Abstrakt
Baggrund
udskilt protein surt og rig på cystein (SPARC) er et glycoprotein, der fungerer til at inhibere angiogenese, proliferation og invasion i forskellige typer af cancer. Evnen hos SPARC at modulere neovaskularisering menes at være medieret delvist af dens evne til at modulere ekspressionen af vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF) og matrixmetalloproteinaser (MMP'er). I denne undersøgelse, vi havde til formål at bestemme effekten af SPARC-ekspression i mavens kræftceller på proliferation og angiogenese in vitro Vi evaluerede udtryk for SPARC i syv humane gastrisk cancer cellelinjer. Derefter etablerede vi et stabilt transficeret SPARC overudtrykt cellelinie (BGC-SP) og en stabilt transficeret SPARC-knockdown cellelinie (HGC-sh). Effekten af SPARC overekspression og SPARC lyddæmpning blev undersøgt ved at undersøge kapillær dannelse af HUVEC'er in vitro endogen SPARC overekspression inhiberede ekspressionen af VEGF og MMP-7, samt angiogenese induceret af BGC-SP-celler. Tilsvarende SPARC lyddæmpning forøget ekspression af VEGF og MMP-7, samt angiogenese induceret af HGC-SH-celler. Forhøjet angiogenese induceret af SPARC tavshed i HGC-sh celler blev nedsat, når VEGF blev neutraliseret af antistoffer, og MMP-7 blev slået ned in vitro SPARC undertrykker angiogenese af gastrisk cancer ved nedregulering af ekspressionen af VEGF og MMP-7 Henvisning:. Zhang JL, Chen GW, Liu YC, Wang PY, Wang X, Wan YL et al. (2012) udskilt protein Sure og Rig på cystein (SPARC) Undertrykker Angiogenese af Down-regulerer ekspressionen af VEGF og MMP-7 i Gastric Cancer. PLoS ONE 7 (9): e44618. doi: 10,1371 /journal.pone.0044618 Redaktør: Rajesh Mohanraj, UAE University, De Forenede Arabiske Emirater Modtaget: 9. juni 2012; Accepteret: August 6, 2012; Udgivet: September 5, 2012 | Copyright: © Zhang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af National Natural Science Foundation of China (nr 30.901.417 /H1617). http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser Introduktion Blandt kræftrelaterede dødsfald, mavekræft andenpladsen på verdensplan efter lungekræft; næsten to tredjedele af tilfældene forekommer i udviklingslandene, herunder 42% fra Kina [1]. Angiogenese er en kritisk proces i gastrisk cancer; Derfor er regulatoriske og signalmolekyler, som modulerer angiogenese blive fokus for nuværende forskning. Angiogenese er ikke en aktiv proces i sig selv; den styres af nogle angiogene faktorer og nogle inhibitorer af angiogenese. udskilt protein sure og rig på cystein (SPARC), også kendt som osteonectin eller BM-40, er et mangesidet secerneret glycoprotein, som udtrykkes ved mange forskellige typer af celler og er forbundet med knogledannelse, fibrose og vævsheling. Nylige undersøgelser viser, at SPARC modulerer proliferation, apoptose, invasion og angiogenese i forskellige typer af cancerceller, men rolle SPARC i tumorigenese er kompliceret og synes at være celletypespecifik grund af sine forskellige funktioner i et givet mikromiljø [2]. SPARC fungerer som en tumorsuppressor i bryst, neuroblastom, pancreas, æggestokkene og lungekræft [3]. Ovariecancer i SPARC-null mus voksede betydeligt større end i vildtype-dyr med augmented niveauer af vaskulær endotel vækstfaktor (VEGF) og matrixmetalloproteinaser (MMP'er) [4]. Ved at undertrykke tumorvaskularitet gennem suppression af VEGF-ekspression og sekretion, SPARC inhiberede gliom vækst [5]. SPARC binder til VEGF og derved inhibere VEGFR phosphorylering, mitogenaktiverede proteinkinaser (MAPK) aktivering og VEGF-induceret DNA-syntese [6]. Imidlertid rolle SPARC i angiogenese er også celletypespecifik, som ændrer signaltransduktionshændelser i afhængighed af unikke cellulære miljøer [7]. VEGF stimulerer angiogenese og er det vigtigste signal protein produceret af celler [8]. MMP'er spiller vigtige roller i tumorudvikling, ikke kun i nedbrydning af ekstracellulær matrix, men også i reguleringen af angiogenese. MMP-7, som er den mindste molekylvægt på alle MMP familiemedlemmer, har vist sig at fremskynde proliferation af humane navlestrengsveneendotelceller (HUVEC'er) i en dosis-afhængig måde in vitro Den primære funktion af SPARC i angiogenese af gastriske cancer cellelinjer fortsat uklart. Derfor i denne undersøgelse har vi den hypotese, at SPARC kan modulere proliferation og angiogenese ved at regulere VEGF og MMP-7 udtryk i gastriske cancerceller. For at teste disse hypoteser, testede vi udtryk for SPARC i syv gastrisk cancer cellelinjer. Så, for at vurdere effekten af ændrede SPARC på mavens kræftceller, vi etableret et BGC-SP klon, som overudtrykt SPARC og en HGC-sh-klon, hvor den endogene SPARC blev slået ned. Angivelse af SPARC i dyrkede Gastric cancer Cells Vi evaluerede udtryk for SPARC i flere humane gastrisk cancer cellelinjer. Western blotting viste, at SPARC var undectable i AGS, MKN45, NIC-N87 og BGC-823-cellelinjer, men SGC-7901 cellelinie udtrykte lavt niveau af SPARC og HGC-27, MGC-803 cellelinjer udtrykte højt SPARC ( Figur 1A). Overekspression og Hæmning af endogen SPARC i Gastric kræftcellelinjer Western blotting viste, at 43 kDa bånd svarende til SPARC-protein blev øget væsentligt i BGC-SP (BGC celler udtrykker SPARC cDNA) celler sammenlignet med parentale (BGC-P) og kontrol-celler transficeret med tom vektor (BGC-EV) (P < 0,05); SPARC blev hæmmet af næsten to tredjedele i HGC-sh celler (HGC celler, der udtrykker SPARC-shRNA) sammenlignet med HGC-P og HGC-EV-celler (P < 0,05, figur 1B). RT-PCR viste, at SPARC mRNA-ekspression i BGC-SP-celler blev forøget i sammenligning med BGC-P og BGC-EV-celler (P < 0,05); SPARC mRNA-ekspression i HGC-sh faldt med næsten 80% i forhold til HGC-P og HGC-EV-celler (P < 0,05, figur 1B). SPARC Overekspression Fald spredning af mavekræft cellelinier for at afgøre, om ændret SPARC udtryk påvirket udbredelsen af gastrisk cancer cellelinjer, blev væksten af transfekterede celler sammenlignet med de forældre og tomme vektor kontrol. Dataene viste, at væksten af BGC-SP-celler blev inhiberet i sammenligning med BGC-P og BGC-EV-celler efter 8 dages dyrkning (P < 0,05); væksten af HGC-sh celler blev øget en smule i forhold til HGC-P og HGC-EV-celler (P < 0,05, figur 1C). SPARC Overekspression i Gastric Cancer Cell Lines Reducerer angiogenese in vitro for at forstå effekten af ændret SPARC udtryk på angiogenese i gastrisk cancer cellelinjer, blev HUVEC'er inkuberet i konditionerede medier. Den BGC-SP supernatant induceret HUVEC'er til at differentiere til kapillære-lignende strukturer inden for 36 timer (2564,5 ± 553,1 um, P < 0,05) i mindre grad end supernatanten fra BGC-EV-celler (5002,4 ± 665,7 um) og BGC-P-celler (5417,3 ± 784,25 um, figur 2A). Den HGC-sh supernatant induceret HUVEC'er til at differentiere til kapillær-lignende strukturer inden for 36 timer (7024,9 ± 923,1 um, P < 0,05) til en stærkere grad end supernatanten fra HGC-EV-celler (4456,2 ± 554,2 um) og HGC-P celler (4023,4 ± 665,2 um, figur 2A). Kvantificering af den gennemsnitlige rørlængde indikerede, at rørlængde på HUVEC'er i konditioneret medium fra BGC-SP blev reduceret med ca. 52,7% i forhold til kontrolceller; rørlængde på HUVEC'er i konditioneret medie fra HGC-sh kloner blev øget 74,6% i forhold til kontrol-celler (Figur 2A). Den dorsale vindue model viste, at BGC-SP celler havde et fald i tumour- 40,4% inducerede mikrokar i sammenligning med kontrolceller (P < 0,05). HGC-SH-celler i den dorsale hud-fold kammer resulterede i en stigning 73,2% i tumorinduceret mikrokar, med et større antal små blødende pletter i sammenligning med kontrolceller (P < 0,05 Figur 2B). Disse resultater viste klart, at SPARC overekspression i mavekræft hæmmede angiogenese in vitro for at bestemme virkningen af SPARC overekspression på MMP-7 og VEGF, kvantitativ realtids-PCR og Western blotting-assays blev udført. Resultaterne viste, at MMP-7 og VEGF-ekspression var negativt reguleret af SPARC ekspression. I BGC-SP-celler, blev niveauerne af MMP-7 mRNA, MMP-7 protein, VEGF-mRNA, og VEGF-protein inhiberet af 87,2%, 68,9%, 48,4% og 58,6%, henholdsvis i forhold til tom vektor transficerede celler. I HGC-SH-celler, MMP-7 mRNA-niveauet steg 11,6 gange, MMP-7 proteinniveauet steg 8,1 gange, VEGF mRNA-niveauet steg 8,8 gange, og VEGF-proteinniveau steg 3,2 gange sammenlignet med tomme vektor celler (figur 3A, B). For at bestemme hvorvidt MAPK signalvejen blev reguleret af SPARC, SAPK /JNK, ERK1 /2 og p-38-niveauer blev bedømt ved western blotting. Resultaterne viste, at niveauet af p-ERK1 /2 var væsentligt reduceret i BGC-SP celler og forhøjede i HGC-sh celler i sammenligning med deres kontrol celler (figur 3C). for at bekræfte, at de pro-angiogene virkninger set med nedsat SPARC udtryk skyldes øget MMP-7 og VEGF udtryk og ikke til niveauet af SPARC selv, HUVEC'er blev inkuberet i konditionerede medier høstet fra HGC-SH-celler med eksogent tilsat rekombinant human SPARC (rhSPARC, 0,3 ug /ml). Vores data indikerer, at tilsætning af eksogent SPARC ikke inhiberede kapilllærlignende strukturer af HUVEC'er sammenlignet med HGC-sh (figur 4), i modsætning til det anti-angiogene respons ses med endogen ekspression af SPARC i BGC823 celler (figur 2). for yderligere at karakterisere rollen af VEGF og MMP-7 i SPARC-medieret angiogenese modulation, MMP-7-shRNA og 1 ug /ml neutraliserende VEGF-antistof (Chemicon, Temacula, CA, USA) blev anvendt til HGC-sh kloner til antagonisere funktionerne af MMP-7 og VEGF. Vi undersøgte evnen af MMP-7-ekspression i HGC-SH-celler til at modulere angiogenese in vitro for at bestemme funktionen af forhøjede VEGF-ekspression induceret af SPARC lyddæmpning, VEGF i de konditionerede medier af HGC-sh og HGC-sh + MMP7-sh celler blev neutraliseret ved VEGF-antistof (1 pg /ml). Resultaterne viste, at kapillær dannelse af HUVEC'er blev reduceret betydeligt i HGC-sh supernatant indeholdende VEGF neutraliserende antistof sammenlignet med supernatant fra HGC-SH-celler alene (HGC-sh + anti-VEGF vs serumfrie konditionerede medier høstet fra HGC-P, HGC-EV, HGC-sh med eller uden rhSPARC (0,3 ug /ml) og HGC-sh + MMP7-SH-celler blev koncentreret ved ultrafiltrering rør (Millipore, Bedford, MA , USA) under samme betingelser. Western blotting viste, at koncentrationen af SPARC i HGC-SH-celler med 0,3 ug /ml rhSPARC inmedium var lig med den for HGC-P supernatant (figur 4A). for at vurdere den terapeutiske effekt af SPARC udtryk BGC-P, BGC-EV, BGC-SP celler eller HGC-P, HGC-EV, HGC-sh celler blev injiceret subkutant i nøgne mus. Der var ingen signifikant forskel i størrelse mellem BGC-P (n = 6; betyde tumorvolumen = 2004 ± 63 mm 3), BGC-EV (n = 6; betyde tumorvolumen = 1856 ± 69 mm 3 ) xenografter. Et signifikant fald (39,1%) i gennemsnitlig tumorvolumen blev fundet i dyr implanteret med BGC-SP xenotransplantater (n = 6; betyde tumorvolumen = 1130 ± 55 mm 3) sammenlignet med dyr implanteret med BGC-EV xenografter ( P < 0,05, figur 5). Der var ingen signifikant forskel i størrelse mellem HGC-P (n = 6; betyde tumorvolumen = 1605 ± 63 mm 3), HGC-EV (n = 6; betyde tumorvolumen = 1708 ± 82 mm 3 ) xenografter. En signifikant stigning (50,3%) i gennemsnitlig tumorvolumen blev fundet i dyr implanteret med HGC-sh xenotransplantater (n = 6; betyde tumorvolumen = 2412 ± 75 mm 3) sammenlignet med dyr implanteret med HGC-EV xenografter ( P. < 0,05, figur 5) For at vurdere SPARC, VEGF, MMP-7 udtryk in vivo Diskussion For at undersøge den rolle, SPARC i gastrisk kræft, vi først testet udtryk for SPARC i syv cellelinier af mavekræft. De fleste cellelinjer gav ikke udtryk for, eller kun udtrykt lavt niveau af SPARC. For at bestemme den rolle, SPARC i væksten og angiogenese af gastrisk cancer etablerede vi BGC-SP klonen som stabilt transficeret med en SPARC cDNA vektor og HGC-sh klon som stabilt transficeret med en shRNA vektor målretning SPARC mRNA. SPARC udtryk steg markant i BGC-SP-klon og faldt i HGC-sh-klon i forhold til deres respektive kontrol-kloner, som bestemt ved western blotting og RT-PCR-analyser. Celleproliferation var lavere i BGC-SP-klon, og var højere i HGC-sh klon end i deres respektive kontrol kloner ved MTT metoden. Vi fandt også, at overekspression af SPARC hæmmede tumor celle-induceret kapillær dannelse af HUVEC'er in vitro Blodkar er afgørende for at levere næringsstoffer til væv . Derfor neovaskularisering er uundværlig for udviklingen af fast tumor. Tidligere undersøgelser har vist, at SPARC spiller en rolle i angiogenese [7]. Vores resultater viste, at overekspression af SPARC hæmmede angiogenese in vitro Vi yderligere implementeret studier for at undersøge den rolle, VEGF og MMP-7 i SPARC-medieret angiogenese modulation. Når rekombinant humant SPARC protein blev tilsat til konditioneret medium fra HGC-sh klon til at genoprette SPARC koncentration, dette konditionerede medium ikke ændre den kapillære dannelse af HUVEC'er af in vitro VEGF spiller en central rolle i angiogenese, og er nødvendigt for overlevelse af endotelceller [8]. I gliom, SPARC inhiberede tumorvækst ved at ændre dets mikromiljø og undertrykke sin angiogenese gennem inhibering af VEGF-ekspression og sekretion [5]. Der kan være en negativ sammenhæng mellem SPARC og VEGF udtryk, dvs., jo mere SPARC, jo mindre VEGF eller omvendt MMP-7 er i stand til nedværdigende basalmembran eller bindevæv omkring skibene. Det stimulerer også DNA-syntese i dyrkede vaskulære endotelceller, og inducerer angiogenese på det sted, hvor coloncancer-celler blev implanteret i en musemodel [15]. VEGF og andre angiogene faktorer fungerer primært gennem MAPK signalveje, som menes at være vigtige transduktionsveje involveret i neovaskulariseringen processer i tumorer [8]. Vores seneste undersøgelse viste, at MMP-7-ekspression blev moduleret via aktivering af MAPK signalveje [16]. Flere undersøgelser viste også, at SPARC negativt modulerede aktiveringen af MAPK pathways [17]. Derfor kan SPARC udtryk ændre den angiogene balance i tumorer ved at nedregulere en række neovaskularisering fremme faktorer. For at undersøge funktionen af SPARC i reguleringen af gastrisk kræft vækst in vivo SPARC udtrykker i normale gastriske epitelceller, gastriske cancerceller, og stromacellerne omgivende gastrisk cancer på et lavere niveau [21 ]. En immunhistokemisk undersøgelse viste, at SPARC hovedsagelig udtrykkes i stromaceller omgiver tumoren [22]. Disse uoverensstemmelser kan ikke fuldt ud forklares. SPARC ekspression kan afhænge af histologisk type tumor, eller omvendt Sammenfattende væksthæmning af gastrisk cancer ved SPARC synes at være medieret gennem sine suppression virkninger på MMP-7 og VEGF udtryk, som igen kan hæmme mikrokar infiltration i tumorer. Vi konkluderer, at nedregulering af SPARC kan associere med forløbet af mavekræft, og udforskning til formål at regulere SPARC udtryk kan blive en meningsfuld tilgang til at forbedre mavekræft behandling. Antistoffer og reagenser Antistoffer mod SPARC (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), (p-) SAPK /JNK, (p-) ERK1 /2, (p-) p-38, MMP-7 (cellesignalering teknologi, Danvers, MA, USA), VEGF, og CD31 (Abcam, Cambridge, MA, USA) blev anvendt til western blotting og immunhistokemi. Den rhSPARC blev leveret af R &D (Minneapolis, MN, USA). Revers transkription-PCR-kittet blev leveret af Promega (Madison, WI, USA). MMP-7-shRNA (KH00809P, SuperArray Bioscience Corp. Frederick, MD, USA) blev anvendt til nedregulering af MMP-7 i cellekloner. β-casein (C-6905, Sigma-Aldrich Corporation, Natick, MA, USA) blev anvendt i β-kaseinzymografi. Alle andre reagenser var af analytisk kvalitet eller bedre. Humane gastriske kræft cellelinjer AGS, MKN-45, NCI-N87, BGC823, MGC803, HGC27, SGC7901 blev opnået fra Cancer Institute of Chinese Academy of Medical Science. Alle celler blev dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS). BGC-EV (transfekteret med tom vektor), BGC-SP (overudtrykker SPARC cDNA), HGC-EV (udtrykkende tom vektor) og HGC-sh (udtrykkende SPARC shRNA) blev dyrket i komplet RPMI 1640 med G418 (50 ug /ml) . Alle celler blev holdt i monolagskulturer ved 37 ° C i befugtet luft med 5% CO 2. Ca. 150.000 BGC-823 celler blev udpladet pr brønd i en seks-brønds plade i RPMI 1640 med 10% FBS og fik lov til at binde natten over. Ækvimolære mængder af pcDNA3.1 med fuld længde SPARC cDNA vektor eller den tomme vektor (Invitrogen, San Diego, CA, USA) blev inkuberet med Lipofectamine 2000 Transfektion Reagent (Invitrogen, San Diego, CA, USA). Valideret SureSilencing human SPARC shRNA og tom vektor kontrol blev opnået fra SuperArray Bioscience Corp. (Frederick, MD, USA). HGC-27-celler blev transficeret som tidligere [24] beskrevne. Kort beskrevet blev celler transficeret på stabil måde under anvendelse af lipofectamin. Transficerede celler blev selekteret med G418 (100 ug /ml for BGC-SP og HGC-sh kloner) i 14 dage før isoleringen af individuelle kloner. HGC-sh-MMP7-sh varianter blev etableret som beskrevet ovenfor, blev HGC-sh klon celler transficeret med MMP-7-shRNA (KH00809P, SuperArray Bioscience Corp. Frederick, MD, USA) under anvendelse lipofectamin. Derefter blev transficerede celler selekteres ved puromycin (1 ug /ml) i 10 dage. Celleproliferation blev bestemt ved en 3- (4,5-dimethylthiazol-2- yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay som tidligere beskrevet [24]. Kort fortalt, 500 celler blev dyrket pr brønd i 96-brønds plader og inkuberet i 8 dage, og derefter, MTT (R &D, Minneapolis, MN, USA) blev tilsat til cellerne. Absorbansværdier ved 550 nm blev målt med en mikropladelæser. Resultaterne blev vist som gennemsnitlige absorbans ved 550 nm og midlerne (± sd) af firdobbelte bestemmelser fra seks separate forsøg. Totale cellelysater blev fremstillet og analyseret ved western blotting som tidligere beskrevet [24]. Kort fortalt blev antistoffer mod SPARC, MMP-7, og VEGF (1:1000 fortynding) anvendes til at detektere SPARC, MMP-7, og VEGF, hvorimod antistoffer mod (p-) SAPK /JNK, (p-) ERK1 /2 og (p-) p-38 (1:800 fortynding) blev anvendt til at detektere aktivering af MAPK-signalvejen. Bundne antistoffer blev visualiseret under anvendelse af ECL (Promega, Madison, WI, USA) på en Kodak Image Station 4000 mm Pro System (Kodak, Rochester, NY, USA). Densiteten af båndene blev kvantificeret ved densitometrisk analyse under anvendelse Image Tool (version 3.0) system. Totalt RNA blev isoleret fra stabilt transficerede tumorceller under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen, San Diego, CA, USA) og behandlet i 45 minutter ved 37 ° C med RQ1 DNase (Promega, Madison, WI, USA). RNA blev revers transkriberet under anvendelse af AMV revers transkriptase (A3500, Promega, Madison, WI, USA). Kvantitativ realtids-PCR blev udført i en ABI Prism7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Beverly, MA, USA) under anvendelse af en GoTaq qPCR Master Mix A6001 kit (Promega, Madison, WI, USA). Primere anvendt til kvantitativ realtids-PCR var som følger: MMP-7, 5'-GGAGATGCTCACTTCGATGA-3 '(sense) og 5'-ATACCCAAAGAATGGCCAAG-3' (antisense); og VEGF, 5'-AGGAGGAGGGCAGAATCATCA-3 '(sense) og 5'-CTCGATTGGATGGCAGTAGCT-3' (antisense). Primere anvendt til PCR var som følger: SPARC, 5'-CTCGAGATGAGGGCCTGGATCTTC-3 '(sense) og 5'-GGATCCCGGATCACAAGATCCTTGTCG-3' (antisense); og glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH), 5'-GGAGTCCACTGGCGTCTTC-3 '(sense) og 5'-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTG-3' (antisense). β-kaseinzymografi funktionelle aktivitet af MMP-7 blev vurderet ved β-kaseinzymografi den 10.% polyacrylamidgeler indlejret med 1 mg /ml β-casein. Lige store mængder det serumfrie konditionerede medier fra celler dyrket i 24 timer blev elektroforeret. Efter elektroforese blev gelerne vasket i 2,5% Triton X-100 i en time for at fjerne SDS. Gelerne blev derefter inkuberet i 18 timer ved 37 ° C i 50 mM Tris /HCl indeholdende 10 mM CaCI 2 og 0,02% NaN 3, farvet med coomassie brilliant blue og derefter affarvet. Proteolytiske aktiviteter af latent MMP-7 og aktiveret MMP-7 blev påvist som bånd med molekylære masser af 28 og 19 kDa henholdsvis. I alt 2 × 10 5 celler af HGC-P, BGC-P eller deres tilsvarende stabilt transficerede kloner blev udsået og inkuberet i komplet RPMI 1640 i 6-brønds kammerobjektglas og lodes vokse i 24 timer. Efterfølgende blev konditionerede medier opsamlet, mærkes og opbevares ved -80 ° C til senere brug. For at undersøge effekten af SPARC på i vitro Dorsal Hud-fold Chamber Model Undersøgelserne blev udført i overensstemmelse med en protokol godkendt af Animal Care og brug Udvalg for Peking University (etisk ansøgning godkendelsesnummer nr J201155). in vivo De athymiske nøgne mus blev randomiseret til forskellige grupper (n = 6 pr gruppe). Mus blev inokuleret subkutant i den nederste bageste flanke med humant BGC-P, BGC-EV, BGC-SP eller HGC-EP, HGC-EV, HGC-SH-celler (2 x 10 6 celler per mus). Tumorvækst blev overvåget ved palpering ved stedet for inokulering.
in vivo
.
Metode
og en dorsal hudfoldens kammer model in vivo
. Kvantitativ realtids-PCR og western blotting blev udført for at detektere, om udtrykkene for VEGF og MMP-7 blev moduleret af SPARC ekspression. For yderligere at bestemme virkningen af SPARC ekspression på angiogenese in vivo
, xenograftmodeller blev etableret og mikrokar densitet (MVD) af forskellige kloner blev påvist ved immunhistokemi.
Resultater
.
Konklusion
[9].
Resultater
og in vivo
in vivo
.
Den MAPK'er Signalering Pathway og ekspression af VEGF og MMP-7 hæmmes ved SPARC overekspression
Knock-down af SPARC Expression i HGC-27 Cells Fremmer angiogenese via opreguleret VEGF og MMP-7 Expression
ved stabilt at transficere MMP-7-shRNA ind HGC-SH-celler. Figur 4A viser, at ekspressionen af MMP-7 i HGC-sh + MMP7-SH-celler blev nedreguleret ved stabilt udtrykker MMP-7-sh-RNA til et niveau, der kan sammenlignes med HGC-P og HGC-EV-celler. For at belyse den rolle, MMP-7 i knock-down SPARC-medieret fremme af tumorcelle-induceret angiogenese udførte vi kapillærdannelse analyse med konditionerede medier af HGC-SH-celler og HGC-sh + MMP7-SH-celler. Som vist i figur 4B, resultater viser, at faldet MMP-7-ekspression i HGC-sh + MMP7-SH-celler førte til en signifikant nedsat kapillær-dannelse ved HUVEC'er in vitro
(HGC-sh + MMP7-sh vs
HGC-sh, P. < 0,05)
HGC-sh, P < 0,05 figur 4B). Kapillær dannelsen af HUVEC'er var næsten helt hæmmet, når de dyrkes i konditioneret medier HGC-sh + MMP7-sh celler plus tilføjede VEGF neutraliserende antistof ( vs
HGC-sh, P < 0,05 figur 4B).
Overekspression af SPARC i gastrisk cancerceller Hæmmer tumorigenicitet i nøgne mus
, xenograft snit blev farvet med et monoklonalt antistof mod human SPARC, VEGF eller MMP-7 . Figur 5A viser, at BGC-SP tumorer udtrykker mere SPARC end BGC-P, BGC-EV tumorer, mens samtidigt VEGF, er MMP-7 udtryk reduceret (P < 0,05, figur 5A). Sektioner fra HGC-sh tumorer udtrykker mindre SPARC end HGC-P, HGC-EV tumorer mens samtidigt VEGF, er MMP-7 udtryk forøget (P < 0,05, figur 5A). CD31 anvendes primært til at demonstrere tilstedeværelsen af vaskulære endotelceller i histologiske vævssnit, som kan hjælpe til at vurdere graden af tumor angiogenese. For at vurdere, om ændret SPARC udtryk medieret af mikrokar densitet (MVD), analyserede vi angiogenese i xenotransplantater ved histologisk analyse af CD-31. Der var ingen signifikant forskel i MVD mellem BGC-P (12,5 ± 2,3 mikrokar /0,145 mm 2), BGC-EV (11,5 ± 3,4 mikrokar /0,145 mm 2) xenotransplantater. MVD blev reduceret 54,8% i BGC-SP (5,2 ± 2,1 mikrokar pr /mm 2) tumorer i forhold til BGC-EV tumorer (P < 0,05, figur 5). Der var ingen signifikant forskel i MVD mellem HGC-P (6,4 ± 2,1 mikrokar /0,145 mm 2), HGC-EV (6,9 ± 1,8 mikrokar /0,145 mm 2) xenotransplantater. MVD blev forhøjet 51,7% i HGC-sh (10,5 ± 1,5 mikrokar /0,145 mm 2) tumorer sammenlignet med HGC-EV tumorer (P < 0,05, figur 5)
og angiogenese i dorsale vindue assay in vivo
. På den anden side, nedregulering af SPARC af mRNA interferens fremmet kapillær dannelse in vitro
angiogenese in vivo
.
in vivo
i forbindelse med nedgangen i MMP-7, VEGF og phosphoryleret ERK1 /2, mens nedregulering af SPARC forfremmet angiogenese in vitro
in vivo
i forbindelse med forøgelsen af MMP-7, VEGF og phosphoryleret ERK1 /2.
assay sammenlignet med den kapillære dannelse af HUVEC'er inkuberet i betingelsen medie uden eksogent rhSPARC. Vi derefter brugt MMP-7-shRNA at nedregulere MMP-7-ekspression i HGC-sh klon, og /eller anti-VEGF-antistof til at neutralisere VEGF i konditioneret medium fra HGC-sh klon. Kapillærdannelse af HUVEC'er blev inhiberet signifikant, når de inkuberes i de konditionerede medier med lavere MMP-7 og /eller blokeret VEGF. Disse eksperimenter antyder, at SPARC nedregulering alene er utilstrækkelig til fremkaldelse af neovaskularisering og andre faktorer skal inddrages i denne proces.
[13], [14].
, BGC-SP og HGC-sh cellekloner blev sammenlignet med deres kontrol kloner for deres evne til at danne tumorer i et subkutant model. SPARC overekspression reducerede signifikant størrelsen af xenotransplanteret tumor med reduceret MVD, nedregulering af SPARC af RNA-interferens fremmet væksten af xenotransplanteret tumor med øget MVD. Derfor, i gastrisk cancer-xenotransplantater, SPARC ekspression er negativt korreleret med angiogenese. Tidligere undersøgelser indikerede, at SPARC bidrog til regulering af tumor dannelse, selv om dens rolle syntes at være celletypespecifik. I hepatocellulære cancercelle-line xenotransplantater, SPARC overekspression betydeligt forsinket tumordannelse reduceret tumorstørrelse og nedsat MVD i sammenligning med kontrol xenografter [18]. I tyktarmskræft væv, blev SPARC udtryk negativt korreleret med VEGF udtryk og MVD [19]. I medulloblastom celler, SPARC overekspression hæmmede angiogenese fører til faldet af tumorvækst [11]. I humane mikrovaskulære endotelceller, SPARC inhiberede DNA-syntese in vitro
[6]. I neuroblastomceller xenotransplantater, SPARC-peptider inhiberede angiogenese og tumorvækst in vivo
[20]. Disse resultater bekræftede SPARC som en inhibitor af tumorangiogenese in vivo
.
. Seneste immunhistokemi undersøgelse viste, at SPARC udtryk negativt var korreleret med ekspressionen af VEGF og MVD i mavekræft væv, og SPARC udtryk faldt i mavekræft med højere grad af malignitet [23].
Materialer og metoder
Cell Kultur
Etablering af BGC-SP, HGC-sh Kloner og HGC-sh-MMP7-sh Clones
celleproliferationsassay
Western blotting-analyse
RT-PCR og kvantitativ real-time PCR
Betinget Media Collection for Eksperimenter
endotel Cell Kapillær-lignende Tube Formation Assay
angiogenese, en kapillær-dannelse blev udført. I dette assay blev Matrigel pipetteret i nedkølede 96-brønds plader (75 pi Matrigel per brønd) og polymeriseres i 30 minutter ved 37 ° C. For at bestemme om ændret SPARC ekspression ville regulere angiogenese, HUVEC'er (5000 celler per brønd) blev inkuberet i 100 pi konditionerede medier høstet fra forskellige slags celler. Efter 36 timers inkubation blev rørformede strukturer fotograferet. Hvert assay tilstand blev vurderet i firedobbelte bestemmelser fra tre separate forsøg. Billeder blev taget med et Cannon Power Shot A640 kamera på et Olympus omvendt mikroskop med en 100 × forstørrelse; røret længde blev kvantificeret ved hjælp af IPP (version 6.0, Media Cybernetics, Silver Spring, MD).
procedurer var i overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Atymiske nøgne mus (6 uger gamle, kvindelige, 26-28 g, n = 3 pr gruppe) blev avlet og holdes inden for en kim-frit miljø. Implantation teknik har tidligere [11] blevet beskrevet. En dorsal Luftsækken blev foretaget i musen ved at injicere 10 ml luft subkutant efter dyret blev bedøvet helt. Diffusionskamre (Millipore, Bedford, MA, USA) blev fremstillet ved at tilpasse 0,45 mm Millipore membraner på begge sider af randen af O-ringen med cement. BGC-P, BGC-EV og BGC-SP; HGC-P, HGC-EV eller HGC-SH-celler (1 x 10 6) suspenderet i PBS blev injiceret i kammeret. En 2 cm lang indsnit horisontalt langs kanten af den dorsale luftsækken, og kamrene blev anbragt under huden. Musene blev aflivet 10 dage senere. Dyrene blev nøje flået omkring de implanterede kamre. Hudfolder dækker kamrene blev fotograferet under synligt lys. Antallet af blodkar blev talt.
xenograftmodeller og Immunhistokemi
Mænd, der spiser yoghurt to gange om ugen, er mindre tilbøjelige til at udvikle tarmkræft
Thiopuriner kan hjælpe med at stoppe viral replikation i menneskelige coronavirus
Udskiftning af rødt kød med plantebaserede kødalternativer reducerer kardiovaskulær risiko
Proteinsendinger fra humant mikrobiom kaster lys over menneskers sundhed
Lande med ældre befolkninger har højere SARS-CoV-2 infektioner og dødsfald,
Fækal transplantation fra visse donorer bedre end andre
Lidt bevis for mRNA COVID-19 vaccine-associeret trombocytopeni,
foreslår ny FDA -undersøgelse Selv da et væld af vacciner er blevet rullet ud for at imødegå pandemien med coronavirus-sygdommen 2019 (COVID-19), nogle alvorlige bivirkninger er blevet rapporteret, i
Visse bakteriearter kan øge hiv -risikoen hos kvinder,
finder en ny undersøgelse En nylig undersøgelse offentliggjort i Lancet infektionssygdomme, beskriver syv arter af vaginale bakterier, der kan øge risikoen for HIV -infektion betydeligt hos kvinder
Hydrogen Breath er ikke fra Bikini Atoll
I disse dage med al den dumme snak om atomkrig, når du ser ordet brint, tænker du måske øjeblikkeligt på den fattige lille ø i Stillehavet, Bikini Atoll, hvor de testede alle disse atombomber, herunde