PLOS ONE: utsöndrade proteinet sura och rika på cystein (SPARC) Dämpar angiogenes genom nedreglering av uttryck av VEGF och MMP-7 i Gastric Cancer

Abstrakt

Bakgrund

utsöndrade proteinet surt och rik på cystein (SPARC) är ett glykoprotein som fungerar för att hämma angiogenes, proliferation och invasion i olika typer av cancer. Förmågan hos SPARC att modulera kärlnybildning tros vara medierad delvis av dess förmåga att modulera uttrycket av vaskulär endotelial tillväxtfaktor (VEGF) och matrismetalloproteinaser (MMP: er). I denna studie, som syftar vi att bestämma effekten av SPARC uttryck i gastric cancerceller på proliferation och angiogenes In vitro Mössor och In vivo
.

Metod

Vi utvärderade uttryck av SPARC i sju humana magcancer-cellinjer. Sedan har vi etablerat en stabilt transfekterad SPARC uttryckt cellinje (BGC-SP) och en stabilt transfekterad SPARC knock-down cellinje (HGC-sh). Effekten av SPARC uttryck och SPARC tysta studerades genom att undersöka kapillär bildning av HUVEC In vitro Mössor och en rygg hudveckets kammarmodell In vivo
. Kvantitativ realtids-PCR och Western blotting utfördes för att upptäcka om uttrycken av VEGF och MMP-7 har moduleras av SPARC uttryck. För att ytterligare bestämma effekten av SPARC uttryck på angiogenes In vivo
, xenograft modeller fastställdes och mikrokärlsdensitet (MVD) olika kloner detekterades med immunhistokemi.

Resultat

endogen SPARC överuttryck inhiberade uttrycket av VEGF och MMP-7, liksom angiogenes inducerad av BGC-SP-celler. På motsvarande sätt ökade SPARC tystande uttrycket av VEGF och MMP-7, liksom angiogenes inducerad av HGC-SH-celler. Förhöjda angiogenes inducerad av SPARC tysta i HGC-SH-celler minskade när VEGF neutraliserades av antikroppar, och MMP-7 slogs ned In vitro

Slutsats

SPARC
. trycker angiogenes av gastric cancer genom nedreglering av uttrycket av VEGF och MMP-7

Citation:. Zhang JL, Chen GW, Liu YC, Wang PY, Wang X, Wan YL, et al. (2012) utsöndrade proteinet sura och rika på cystein (SPARC) Dämpar angiogenes genom nedreglering av uttryck av VEGF och MMP-7 i magcancer. PLoS ONE 7 (9): e44618. doi: 10.1371 /journal.pone.0044618

Redaktör: Rajesh Mohanraj, UAE University, Förenade Arabemiraten

Mottagna: 9 juni 2012, Accepteras: 6 aug 2012; Publicerad: 5 september 2012 |

Copyright: © Zhang et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta arbete har finansierats av National Natural Science Foundation i Kina (nr 30.901.417 /H1617). http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Bland cancerrelaterade dödsfall, rankas magcancer andra över hela världen efter lungcancer; nästan två tredjedelar av fallen inträffar i utvecklingsländerna, inklusive 42% från Kina [1]. Angiogenes är en viktig process i magcancer; Därför är regulatoriska och signalmolekyler som modulerar angiogenes blir i fokus för nuvarande forskning. Angiogenes är inte en aktiv process i sig självt, Det styrs av vissa angiogena faktorer och vissa hämmare av angiogenes.

utsöndrade proteinet sura och rika på cystein (SPARC), också känd som osteonektin eller BM-40, är ​​en mångfacetterad utsöndrat glykoprotein som uttrycks av många olika typer av celler och är förknippad med benbildning, fibros och vävnadsreparation.

Nya studier visar att SPARC modulerar spridning, apoptos, invasion och angiogenes i olika typer av cancerceller, men rollen av SPARC i tumörbildning är komplicerad och verkar vara celltypsspecifik på grund av dess olika funktioner i en given mikromiljö [2]. SPARC fungerar som en tumörsuppressor i bröst, neuroblastom, pankreas, äggstocks- och lungcancer [3]. Äggstockscancer i SPARC-null möss växte betydligt större än i vildtyp djur med augmented nivåer av vascular endothelial growth factor (VEGF) och matrismetalloproteinaser (MMP) [4]. Genom att undertrycka tumörkärl genom undertryckande av VEGF uttryck och utsöndring, SPARC hämmade gliom tillväxt [5]. SPARC binder till VEGF, vilket hämmar VEGFR fosforylering, mitogenaktiverade proteinkinaser (MAPK) aktivering och VEGF-inducerad DNA-syntes [6]. Emellertid är rollen av SPARC vid angiogenes också celltypspecifik, vilket förändrar signaltransduktionshändelser som svar på unika cellulära miljöer [7].

VEGF stimulerar angiogenes, och är den viktigaste signalprotein som produceras av celler [8]. MMPs spela viktiga roller i tumörutveckling, inte bara i att bryta ned den extracellulära matrisen, utan också i regleringen av angiogenes. MMP-7, som är den minsta molekylvikten för alla MMP familjemedlemmar, har visat sig accelerera proliferationen av humana navelvenendotelceller (HUVEC) i ett dosberoende sätt in vitro
[9].

Den primära uppgiften för SPARC i angiogenes av magcancer cellinjer är fortfarande oklart. Därför, i denna studie, hypotes vi att SPARC kan modulera proliferation och angiogenes genom att reglera VEGF och MMP-7 uttryck i gastric cancerceller. För att testa dessa hypoteser, testade vi uttryck av SPARC i sju gastric cancercellinjer. Sedan, för att bedöma effekten av förändrade SPARC på gastric cancerceller, har vi etablerat en BGC-SP-klon som överuttryckt SPARC och en HGC-sh-klon i vilken den endogena SPARC slogs ner.

Resultat

uttryck av SPARC i odlade Gastric cancerceller

Vi utvärderade uttryck av SPARC i flera humana gastriska cancercellinjer. Western blotting visade att SPARC var undectable i AGS, MKN45, NCI-N87 och BGC-823 cellinjer, men SGC-7901 cellinje uttryckte låga SPARC och HGC-27, MGC-803 cellinjer uttryckte hög SPARC ( Figur 1A).

Uttryck och hämning av endogen SPARC i Gastric cancercellinjer sälja

Western blotting visade att kDa bandet 43 motsvarar SPARC proteinet signifikant ökad i BGC-SP (BGC celler uttryckande SPARC cDNA) -celler jämfört med parentala (BGC-P) och kontrollceller transfekterade med den tomma vektorn (BGC-EV) (P < 0,05); SPARC inhiberades med nästan två tredjedelar i HGC-SH-celler (HGC celler som uttrycker SPARC-shRNA) jämfört med HGC-P och HGC-EV-celler (P < 0,05, Figur 1B). RT-PCR visade att SPARC-mRNA-uttryck i BGC-SP-celler ökades jämfört med BGC-P och BGC-EV-celler (P < 0,05); SPARC-mRNA-uttryck i HGC-sh minskade med nästan 80% jämfört med HGC-P och HGC-EV-celler (P < 0,05, Figur 1B).

SPARC Uttryck Minskar spridning av Gastric cancercellinjer

för att fastställa om förändrad SPARC uttryck påverkat spridningen av magcancer cellinjer, var tillväxten av transfekterade celler jämfört med de föräldra och tomma vektorkontroller. Data visade att tillväxten av BGC-SP-celler hämmades i jämförelse med BGC-P och BGC-EV-celler efter 8 dagars odling (P < 0,05); tillväxten av HGC-SH-celler ökade något jämfört med HGC-P och HGC-EV-celler (P < 0,05, Figur 1C).

SPARC Uttryck i Gastric cancercellinjer Minskar Angiogenes In vitro
och in vivo

för att förstå effekten av förändrade SPARC uttryck på angiogenes i magcancer cellinjer var HUVEC odlades i konditionerat medium. BGC-SP supernatanten inducerade HUVEC att differentiera till kapillärliknande strukturer inom 36 h (2564,5 ± 553,1 ^ m, P < 0,05) i mindre utsträckning än den överstående lösningen från BGC-EV-celler (5002,4 ± 665,7 ^ m) och BGC-P-celler (5417,3 ± 784,25 ^ m, Figur 2A). HGC-sh supernatanten inducerade HUVEC att differentiera till kapillärliknande strukturer inom 36 h (7024,9 ± 923,1 ^ m, P < 0,05) till en starkare utsträckning än supernatanten från HGC-EV-celler (4456,2 ± 554,2 ^ m) och HGC-P-celler (4023,4 ± 665,2 ^ m, Figur 2A). Kvantifiering av den genomsnittliga rörlängden indikerade att rörlängd på HUVEC i konditionerade media från BGC-SP minskades med ca 52,7% i jämförelse med kontrollceller; rörlängd på HUVEC i konditionerat medium från HGC-sh kloner ökade 74,6% jämfört med kontrollceller (Figur 2A).

rygg fönster modellen visade att BGC-SP-celler hade en 40,4% minskning med tumörer inducerade mikrokärl jämfört med kontrollceller (P < 0,05). HGC-SH-celler i den dorsala hudveckets kammaren resulterade i en ökning 73,2% i tumörframkallad mikrokärl, med ett större antal små blödningar fläckar jämfört med kontrollceller (P < 0,05 Figur 2B). Dessa resultat visar tydligt att SPARC uttryck i magcancer hämmade angiogenes In vitro Mössor och In vivo
.

Den MAPK Signal Banan och uttryck av VEGF och MMP-7 hämmas av SPARC uttryck~~POS=HEADCOMP

för att bestämma effekten av SPARC uttryck på MMP-7 och VEGF, kvantitativ realtids-PCR och Western blotting utfördes. Resultaten visade att MMP-7 och VEGF-uttryck regleras negativt av SPARC-expression. I BGC-SP-celler, var nivåerna av MMP-7-mRNA, MMP-7-protein, VEGF-mRNA, och VEGF-protein inhiberas av 87,2%, 68,9%, 48,4% och 58,6%, respektive, jämfört med tom vektor transfekterade celler. I HGC-SH-celler, ökade MMP-7-mRNA-nivån 11,6-faldigt ökade MMP-7 proteinnivå 8,1-faldigt, ökade VEGF mRNA-nivån 8,8-faldig, och VEGF-proteinnivån ökade 3,2-faldigt jämfört med tom vektor-celler (fig 3A, B). För att bestämma huruvida MAPK signalväg reglerades av SPARC, SAPK /JNK, ERK1 /2 och p-38 nivåer bedömdes av western blotting. Resultaten visade att nivåerna av p-ERK1 /2 var signifikant minskade i BGC-SP-celler och förhöjd i HGC-SH-celler i jämförelse med sina kontrollceller (Figur 3C).

Knock-down av SPARC Expression i HGC-27 celler gynnar Angiogenes via uppreglerat VEGF och MMP-7 expression

för att bekräfta att de pro-angiogena effekter ses med minskad SPARC uttryck beror på ökad MMP-7 och VEGF-produktion och inte till nivåer av SPARC själv var HUVEC odlades i konditionerat media skördade från HGC-SH-celler med exogen lagt rekombinant human SPARC (rhSPARC, 0,3 mikrogram /ml). Våra data visade att tillsättning av exogent SPARC inte hämmade kapillärliknande strukturer av HUVEC-celler jämfört med HGC-sh (Figur 4), till skillnad från den anti-angiogena svaret som ses med endogent uttryck av SPARC i BGC823 celler (Figur 2).

för att ytterligare karakterisera den roll som VEGF och MMP-7 i SPARC-medierad angiogenes modulering, MMP-7-shRNA och 1 | ig /ml neutraliserande VEGF-antikroppen (Chemicon, Temacula, CA, USA) användes för HGC-sh kloner till motverkar funktionerna hos MMP-7 och VEGF.

Vi undersökte förmågan hos MMP-7 uttryck i HGC-SH-celler att modulera angiogenes in vitro Musik av stabilt transfektera MMP-7-shRNA in HGC-SH-celler. Figur 4A visar att uttrycket av MMP-7 i HGC-sh + MMP7-sh celler nedregleras genom stabilt uttrycker MMP-7-sh-RNA till en nivå som är jämförbar med den hos HGC-P och HGC-EV-celler. För att klargöra betydelsen av MMP-7 i knock-down SPARC-medierad främjande av tumörcell-inducerad angiogenes, utförde vi kapillär bildning analys med konditionerat medium av HGC-SH-celler och HGC-sh + MMP7-sh celler. Som visas i figur 4B, indikerar resultaten att minskade MMP-7 uttryck i HGC-sh + MMP7-SH-celler ledde till en minskad kapillär bildning högst väsentligt genom HUVEC In vitro
(HGC-sh + MMP7-sh vs
HGC-sh, P <. 0,05) katalog

för att bestämma funktionen av förhöjt VEGF-inducerad av SPARC tysta, VEGF i det konditionerade mediet av HGC-sh och HGC-sh + MMP7-sh celler neutraliserades genom VEGF-antikropp (1 | ig /ml). Resultaten visade att kapillär bildning av HUVEC minskade signifikant i HGC-sh supernatanten innehållande VEGF neutraliserande antikropp jämfört med supernatant från enbart HGC-SH-celler (HGC-sh + anti-VEGF vs
HGC-sh, P < 0,05 figur 4B). Kapillär bildning av HUVEC var nästan helt hämmade när de odlas i konditionerat medium av HGC-sh + MMP7-sh celler plus lagt VEGF neutraliserande antikropp ( vs
HGC-sh, P < 0,05 Figur 4B).

Serumfria fria~~POS=HEADCOMP konditionerade medier som skördats från HGC-P, HGC-EV, HGC-sh med eller utan rhSPARC (0,3 | j, g /ml) och HGC-sh + MMP7-SH-celler koncentrerades genom ultrafiltrering rör (Millipore, Bedford, MA , USA) under samma betingelser. Western blotting visade att koncentrationen av SPARC i HGC-SH-celler med 0,3 mikrogram /ml rhSPARC inmedium var lika stor som den HGC-P supernatanten (Figur 4A).

Uttryck av SPARC i Gastric cancerceller hämmar Tumourigenicity i nakna möss

för att bedöma den terapeutiska effekten av SPARC uttryck, BGC-P, BGC-EV, BGC-SP celler eller HGC-P, HGC-EV, HGC-SH-celler injicerades subkutant i nakna möss. Det fanns ingen signifikant skillnad i storlek mellan BGC-P (n = 6; medeltumörvolym = 2004 ± 63 mm ^{3), BGC-EV (n = 6; medeltumörvolym = 1856 ± 69 mm 3 ) xenotransplantat. En signifikant minskning (39,1%) av medeltumörvolym hittades i djur som implanterats med BGC-SP xenotransplantat (n = 6; medeltumörvolym = 1130 ± 55 mm 3) jämfört med djur som implanterats med BGC-EV-xenotransplantat ( P < 0,05, Figur 5). Det fanns ingen signifikant skillnad i storlek mellan HGC-P (n = 6; medeltumörvolym = 1605 ± 63 mm 3), HGC-EV (n = 6; medeltumörvolym = 1708 ± 82 mm 3 ) xenotransplantat. En signifikant ökning (50,3%) i medeltumörvolymen hos djur implanterade med HGC-sh xenotransplantat (n = 6; medeltumörvolym = 2412 ± 75 mm 3) jämfört med djur implanterade med HGC-EV xenotransplantat ( P <. 0,05, Figur 5) katalog}

För att bedöma SPARC, VEGF, MMP-7 uttryck in vivo
, xenograft sektioner färgades med en monoklonal antikropp mot humant SPARC, VEGF eller MMP-7 . Figur 5A visar att BGC-SP tumörer uttrycker mer SPARC än BGC-P, BGC-EV tumörer medan samtidigt VEGF, är MMP-7 uttryck minskade (P < 0,05, Figur 5A). Sektioner från HGC-sh tumörer uttrycker mindre SPARC än HGC-P, HGC-EV tumörer medan samtidigt VEGF, är MMP-7 uttryck ökade (P < 0,05, Figur 5A). CD31 används främst för att demonstrera närvaron av vaskulära endotelceller i histologiska vävnadssnitt, som kan bidra till att utvärdera graden av tumörangiogenes. För att bedöma om förändrad SPARC uttryck förmedlat den mikrokärlsdensitet (MVD), analyserade vi angiogenes i xenografter genom histologisk analys av CD-31. Det fanns ingen signifikant skillnad i MVD mellan BGC-P (12,5 ± 2,3 mikrokärl /0,145 mm ^{2), BGC-EV (11,5 ± 3,4 mikrokärl /0,145 mm 2) xenografter. MVD minskade 54,8% i BGC-SP (5,2 ± 2,1 mikrokärl per /mm 2) tumörer jämfört med BGC-EV tumörer (P < 0,05, Figur 5). Det fanns ingen signifikant skillnad i MVD mellan HGC-P (6,4 ± 2,1 mikrokärl /0,145 mm 2), HGC-EV (6,9 ± 1,8 mikrokärl /0,145 mm 2) xenotransplantat. MVD höjdes 51,7% i HGC-sh (10,5 ± 1,5 mikrokärl /0,145 mm 2) tumörer jämfört med HGC-EV tumörer (P < 0,05, Figur 5) katalog}

Diskussion
SPARC är ett vävnadsspecifikt protein som påverkar flera cellprocesser inklusive proliferation, invasion, och angiogenes löst i olika typer av vävnader. Till exempel tidigare studier visat att SPARC främjade invasionen medan samtidigt hämma tillväxten av tumörer [5], [10]. I medulloblastom, kan överuttryck av SPARC inhibera angiogenes i tumören genom att sänka expression och sekretion av VEGF och MMP-9 [11]. I melanom, men uttrycket av SPARC positivt korrelerad med angiogenes [12]. Funktionen hos SPARC i gastric cancerceller är fortfarande oklart.

För att undersöka vilken roll SPARC i magcancer, först testade vi ett uttryck för SPARC i sju cellinjer av magcancer. De flesta cellinjer inte uttrycker, eller bara uttryckte låga SPARC. För att bestämma vilken roll SPARC i tillväxt och angiogenes av magcancer har vi etablerat BGC-SP-klon som stabilt transfekterades med en SPARC-cDNA vektor och HGC-sh klon som stabilt transfekterades med en shRNA vektor inriktning SPARC-mRNA. SPARC uttryck ökade markant i BGC-SP-klon och minskade i HGC-sh klon i jämförelse med sina respektive styr kloner, som bestäms genom western blotting och RT-PCR-analyser. Cellförökning var lägre i BGC-SP-klonen, och var högre i HGC-sh klon än i sina respektive styr kloner genom MTT-metoden. Vi fann också att överuttryck av SPARC hämmade tumörcell-inducerad kapillär bildning av HUVEC In vitro Mössor och angiogenes i rygg fönster analys In vivo
. Å andra sidan, nedreglering av SPARC av mRNA störningar främjas kapillär bildning In vitro Mössor och angiogenes In vivo
.

Blodkärl är avgörande för att leverera näring till vävnader . Därför är neovaskularisation oundgänglig för utveckling av solid tumör. Tidigare studier har visat att SPARC spelar en roll i angiogenes [7]. Våra resultat visade att överuttryck av SPARC hämmade angiogenes In vitro Mössor och In vivo
i samband med minskningen av MMP-7, VEGF och fosforylerad ERK1 /2, medan nedreglering av SPARC främjas angiogenes in vitro Mössor och in vivo
i samband med ökningen av MMP-7, VEGF och fosforylerad ERK1 /2.

Vi genomförde ytterligare studier för att undersöka vilken roll VEGF och MMP-7 i SPARC-medierad angiogenes modulering. När rekombinant humant SPARC-protein sattes till konditionerat medium från HGC-sh klon att återställa SPARC koncentration, gjorde detta medium inte ändra kapillär bildning av HUVEC med In vitro
analys jämfört med kapillär bildning av HUVEC odlades i villkoret medium utan exogent rhSPARC. Vi använde sedan MMP-7-shRNA att nedreglera MMP-7-uttryck i HGC-sh-klonen, och /eller anti-VEGF-antikroppen att neutralisera VEGF i konditionerat medium från HGC-sh-klonen. Kapillär bildning av HUVEC inhiberades väsentligt när de odlades i konditionerat medium med lägre MMP-7 och /eller blockerade VEGF. Dessa experiment antyder att SPARC nedreglering ensam är otillräcklig för framkallande av kärlnybildning, och andra faktorer måste delta i denna process.

VEGF spelar en nyckelroll i angiogenes, och är nödvändig för överlevnaden av endotelceller [8]. I gliom, inhiberade SPARC tumörtillväxt genom att ändra dess mikromiljö och undertrycka dess angiogenes genom hämning av VEGF-produktion och utsöndring [5]. Det kan finnas ett negativt samband mellan SPARC och VEGF uttryck, dvs mer SPARC, desto mindre VEGF eller vice versa
[13], [14].

MMP-7 är i stånd att förnedrande basalmembranet eller bindväv runt fartygen. Det stimulerar också DNA-syntes i odlade vaskulära endotelceller och inducerar angiogenes på den plats där koloncancerceller implanterades i en musmodell [15]. VEGF och andra angiogena faktorer fungerar främst genom MAPK signalvägar, som tros vara viktiga överföringsvägar är involverade i kärlnybildningen processer i tumörer [8]. Vår nyligen genomförd studie visade att MMP-7 expression modul via aktivering av MAPK signalvägar [16]. Flera studier visade också att SPARC module negativt aktiveringen av MAPK vägar [17]. Följaktligen kan SPARC uttryck förändra angiogena balans i tumörer genom nedreglering en rad kärlnybildning främja faktorer.

För att undersöka funktionen hos SPARC i regleringen av magcancer tillväxt In vivo
, BGC-SP och HGC-sh-cellkloner jämfördes med deras kontroll kloner för sin förmåga att bilda tumörer i en subkutan modell. SPARC uttryck reducerade signifikant storlek xenotransplanterat tumör med reducerad MVD, nedreglering av SPARC av RNA-interferens främjat tillväxten av xenotransplanterat tumör med ökad MVD. Därför, i magcancer xenografter, SPARC uttryck negativt korrelerad med angiogenes. Tidigare studier indikerade att SPARC bidrog till reglering av tumörbildning, även om dess roll tycktes vara celltypspecifik. I hepatocellulära cancercell-line xenotransplantat, SPARC uttryck signifikant fördröjd tumörbildning, minskad tumörstorlek och minskad MVD i jämförelse med kontroll xenotransplantat [18]. I koloncancervävnader, var SPARC uttryck negativt korrelerad med VEGF och MVD [19]. I medulloblastom celler, SPARC uttryck hämmade angiogenes som leder till en minskning av tumörtillväxt [11]. I humana mikrovaskulära endotelceller, SPARC inhiberade DNA-syntes In vitro
[6]. I neuroblastom xenografter, SPARC-peptider inhiberade angiogenes och tumörtillväxt In vivo
[20]. Dessa resultat bekräftade SPARC som en hämmare av tumörangiogenes In vivo
.

SPARC uttrycker i normala gastric epitelceller, gastric cancerceller, och stromala celler som omger magcancer på en lägre nivå [21 ]. En immunhistokemisk studie visade att SPARC huvudsakligen uttrycks i stromaceller som omger tumören [22]. Dessa skillnader kan inte helt förklaras. SPARC uttryck kan bero på histologiska typen av tumör, eller vice versa
. Senaste immunohistokemi studie fann att SPARC uttryck negativt korrelerade med uttrycket av VEGF och MVD i magcancer vävnader och SPARC uttryck minskade i magsäckscancer med högre grad av malignitet [23].

Sammanfattningsvis tillväxthämning för magcancer av SPARC verkar förmedlas genom dess undertryckande effekter på MMP-7 och VEGF uttryck, vilket i sin tur hämmar mikrokärls infiltration i tumörer. Vi drar slutsatsen att nedreglering av SPARC kan associera med utvecklingen av magcancer och prospektering i syfte att reglera SPARC uttryck kan bli en betydelsefull strategi för att förbättra magcancer behandling.

Material och metoder

Antikroppar och reagens

Antikroppar mot SPARC (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), (p) SAPK /JNK, (p) ERK1 /2, (p) p-38, MMP-7 (cellsignalering teknik, Danvers, MA, USA), VEGF, och CD31 (Abcam, Cambridge, MA, USA) användes för western blotting och immunohistokemi. Den rhSPARC levererades av R &D (Minneapolis, MN, USA). Omvänd transkription-PCR-kit tillhandahölls av Promega (Madison, WI, USA). MMP-7-shRNA (KH00809P, SuperArray Bioscience Corp. Frederick, MD, USA) användes för nedreglering av MMP-7 i cellkloner. β-Kasein (C-6905, Sigma-Aldrich Corporation, Natick, MA, USA) användes i β-kasein zymografi. Alla andra reagens var av analytisk kvalitet eller bättre.

Cell Culture

Mänskliga gastric cancercellinjer AGS, MKN-45, NCI-N87, BGC823, MGC803, HGC27, SGC7901 erhölls från cancer Institute of Chinese Academy of Medical Science. Alla celler odlades i RPMI 1640-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS). BGC-EO (transfekterade med tom vektor), BGC-SP (överuttrycker SPARC cDNA), HGC-EO (uttryckande tom vektor) och HGC-sh (som uttrycker SPARC shRNA) odlades i fullständigt RPMI 1640 med G418 (50 | j, g /ml) . Alla celler upprätthölls i monolagerkulturer vid 37 ° C i fuktad luft med 5% CO _2.

Etablering av BGC-SP, HGC-sh Kloner och HGC-sh-MMP7-sh kloner

Cirka 150.000 BGC-823-celler ströks per brunn i en sex-brunnar i RPMI 1640 med 10% FBS och tilläts fästa över natten. Ekvimolära mängder av pcDNA3.1 med fullängds-SPARC-cDNA vektor eller den tomma vektorn (Invitrogen, San Diego, CA, USA) inkuberades med Lipofectamine-2000 Transfektion Reagent (Invitrogen, San Diego, CA, USA). Validerade SureSilencing humant SPARC shRNA och tom kontrollvektor erhölls från SuperArray Bioscience Corp. (Frederick, MD, USA). HGC-27-celler transfekterades såsom beskrivits tidigare [24]. I korthet transfekterades celler på ett stabilt sätt med användning av lipofektamin. Transfekterade celler selekterades med G418 (100 | ig /ml för BGC-SP och HGC-sh kloner) under 14 dagar före isolering av individuella kloner. HGC-sh-MMP7-sh-varianter fastställdes såsom beskrivits ovan, var HGC-sh klon-celler transfekterade med MMP-7-shRNA (KH00809P, SuperArray Bioscience Corp. Frederick, MD, USA) med användning av lipofektamin. Därefter tillsattes transfekterade celler selekteras genom puromycin (1 | ig /ml) under 10 dagar.

Cellproliferationsanalys

Cellproliferation bestämdes med en 3- (4,5-dimetyltiazol-2- yl) -2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) analys såsom beskrivits tidigare [24]. Kortfattat, 500-celler odlades per brunn i 96-brunnars plattor och inkuberades under 8 dagar, och sedan, MTT (R &D, Minneapolis, MN, USA) sattes till cellerna. Absorbansvärden vid 550 nm mättes med en mikroplattläsare. Resultaten visas som genomsnittliga absorbansen vid 550 nm och de medel (± SD) av fyrfaldiga bestämningar från sex separata experiment.

Western Blotting Analys

Totala cellysat framställdes och analyserades genom western blotting såsom tidigare beskrivits [24]. Kortfattat, antikroppar mot SPARC, MMP-7, och VEGF (1:1000 utspädning) används för att detektera SPARC, MMP-7, och VEGF, respektive, medan antikroppar mot (p-) SAPK /JNK, (p) ERK1 /2 och (p-) p-38 (1:800 utspädning) användes för att detektera aktivering av MAPK-signalvägen. Bundna antikroppar synliggjordes med användning av ECL (Promega, Madison, WI, USA) på en Kodak Image Station 4000 mm Pro System (Kodak, Rochester, NY, USA). Densiteten för banden kvantifierades genom densitometrisk analys med användning av Image Tool (version 3,0) systemet.

RT-PCR och kvantitativ realtids-PCR

Totalt RNA isolerades från stabilt transfekterade tumörceller med användning av Trizol-reagens (Invitrogen, San Diego, CA, USA) och behandlades under 45 min vid 37 ° C med RQ1 DNas (Promega, Madison, WI, USA). RNA transkriberades omvänt med användning av AMV Reverse Transcriptase (A3500, Promega, Madison, WI, USA). Kvantitativ realtids-PCR utfördes i en ABI Prism7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Beverly, MA, USA) med användning av en GoTaq qPCR Master Mix A6001 kit (Promega, Madison, WI, USA). Primrar som används för kvantitativ realtids-PCR var följande: MMP-7, 5'-GGAGATGCTCACTTCGATGA-3 '(sens) och 5'-ATACCCAAAGAATGGCCAAG-3' (antisens); och VEGF, 5'-AGGAGGAGGGCAGAATCATCA-3 '(sens) och 5'-CTCGATTGGATGGCAGTAGCT-3' (antisens). Primrar som användes för PCR var enligt följande: SPARC, 5'-CTCGAGATGAGGGCCTGGATCTTC-3 '(sens) och 5'-GGATCCCGGATCACAAGATCCTTGTCG-3' (antisens); och glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH), 5'-GGAGTCCACTGGCGTCTTC-3 '(sens) och 5'-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTG-3' (antisens).

β-kasein zymografi

funktionella aktiviteten av MMP-7 utvärderades genom β-kasein zymografi på 10% polyakrylamidgeler inbäddade med 1 mg /ml β-kasein. Lika mängder av det serumfria konditionerade media från celler som odlats under 24 timmar underkastades elektrofores. Efter elektrofores överfördes gelerna tvättas i 2,5% Triton X-100 under en timme för att avlägsna SDS. Gelerna inkuberades sedan under 18 timmar vid 37 ° C i 50 mM Tris /HCl innehållande 10 mM CaCb _{2 och 0,02% NaN 3, färgades med coomassie brilliant blue och avfärgades sedan. Proteolytiska aktiviteter latent MMP-7 och aktiverade MMP-7 framgick som band med molekylmassor av 28 och 19 kDa, respektive.}

konditionerade media Collection för Experiment

Totalt 2 x 10 ^{5 celler av HGC-P, BGC-P eller deras motsvarande stabilt transfekterade kloner var ympades och inkuberades i fullständigt RPMI 1640 i 6-brunnars kammarobjektglas och fick växa under 24 h. Därefter tillsattes konditionerade media samlas in, märkas och förvaras vid -80 ° C för framtida bruk.}

Endothelial Cell Kapillär liknande Tube Formation analys

För att undersöka effekten av SPARC på i vitro
angiogenes, var en kapillär bildningsanalys utförs. I denna analys var matrigel pipetterades i pre-chilled 96-brunnsplattor (75 ^ il Matrigel per brunn) och polymeriseras i 30 min vid 37 ° C. För att bestämma om förändrad SPARC uttryck skulle reglera angiogenes, HUVEC (5000 celler per brunn) inkuberades i 100 | al konditionerat medium som skördats från olika typer av celler. Efter 36 h inkubering rörformiga strukturer fotograferades. Varje analys tillstånd bedömdes i fyrfaldiga bestämningar från tre separata experiment. Bilderna har tagits med en Cannon Power Shot A640 kamera på en Olympus inverterat mikroskop med en 100 gångers förstoring; rörlängden var kvantifieras med hjälp av IPP (version 6.0, Media Cybernetics, Silver Spring, MD).

Rygg hudveckets avdelningen Model

Studierna genomfördes i enlighet med ett protokoll som godkänts av Animal Care och användning kommittén för Pekings universitet (etisk ansökan godkännandenummer nr J201155). In vivo
förfaranden var i överensstämmelse med rekommendationerna i Guide för skötsel och användning av försöksdjur i National Institutes of Health. Atymiska nakna möss (6 veckor gamla, kvinnor, 26-28 g, n = 3 per grupp) avlades och hölls i en bakteriefri miljö. Implantation teknik har beskrivits tidigare [11]. En ryggluftsäck gjordes i musen genom att injicera 10 ml luft subkutant efter att djuret sövdes fullständigt. Diffusionskammare (Millipore, Bedford, MA, USA) framställdes genom att rikta 0,45-mm Millipore-membran på båda sidorna av kanten av 'O'-ringen med cement. BGC-P, BGC-EV och BGC-SP; HGC-P, HGC-EV eller HGC-SH-celler (1 x 10 ^{6) suspenderad i PBS injicerades in i kammaren. En 2 cm långt snitt gjordes horisontellt längs kanten av den dorsala luftsäcken, och kamrarna placerades under huden. Mössen avlivades 10 dagar senare. Djuren noggrant flådda runt de implanterade kamrarna. De hudveck som täcker kamrarna var fotograferades under synligt ljus. Antalet blodkärl räknades.}

xenograft-modeller och immunohistokemi

atymiska nakna möss randomiserades till olika grupper (n = 6 per grupp). Möss ympades subkutant i den nedre bakre flanken med humant BGC-P, BGC-EV, BGC-SP eller HGC-EP, HGC-EV, HGC-SH-celler (2 x 10 ^{6 celler per mus). Tumörtillväxt övervakades genom palpation vid stället för inokulering.}

• PLOS ONE: Avslöja den molekylära mekanismen för magcancer Marker Annexin A4 i Cancer Cell Proliferation Använda Exon matriser
• PLOS ONE: Functional Pstl /Rsal polymorfism i CYP2E1 är förknippad med utveckling, Progression och dåligt utfall för magcancer