PLoS ONE: секретируемого белка Кислотные и Рич в цистеин (SPARC) Подавляет ангиогенеза вниз-регуляцию экспрессии VEGF и MMP-7 в желудочном Cancer

Абстрактный

Фон

секретируемого белка кислой и богатый цистеином (SPARC) представляет собой гликопротеин, который функционирует для ингибирования ангиогенеза, пролиферации и инвазии в различных видах рака. Способность СПАРК модулировать неоваскуляризацию, как полагают, опосредованной частично его способности модулировать экспрессию фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и металлопротеиназ матрикса (ММР). В данном исследовании мы стремились определить влияние экспрессии в СПАРК клеток рака желудка на пролиферацию и ангиогенез в пробирке
и В естественных условиях
.

Способ
<р> Мы оценили экспрессию СПАРК в семи желудочных линиях раковых клеток человека. Затем мы создали стабильно трансфицированные СПАРК избыточно экспрессируется клеточной линии (КУП-SP) и стабильно трансфицировали SPARC нокдауна клеточную линию (ТЖК-SH). Эффект СПАРК избыточной экспрессии и SPARC глушителей изучали путем изучения формирования капиллярный HUVECs в пробирке
и кожа-кратная модель камеры спинным В естественных условиях
. Количественная ПЦР в реальном времени и Вестерн-блоттинга были выполнены, чтобы обнаружить, если выражения VEGF и MMP-7 модулировались выражением СПАРК. Для дальнейшего определения влияния экспрессии SPARC на ангиогенез В естественных условиях
, были созданы модели ксенотрансплантата и плотность микрососудов (MVD) различных клонов были обнаружены с помощью иммуногистохимии.

Результаты
<р> Эндогенный СПАРК избыточная экспрессия ингибирует экспрессию VEGF и ММР-7, а также ангиогенез, индуцированный КУП-SP клеток. Соответственно, СПАРК глушителей повышал экспрессию VEGF и ММР-7, а также ангиогенез, индуцированный ТЖК-Sh клеток. Повышенные ангиогенез, индуцированный СПАРК глушителей в ТЖК-ш клеток уменьшается, когда VEGF был нейтрализуется антителами, и ММР-7 был сбит в пробирке
.

Заключение

SPARC подавляет ангиогенез рака желудка путем снижения регуляции экспрессии VEGF и MMP-7
<р> Образец цитирования:. Чжан JL, Чэнь GW, Лю YC, Ван PY, Ван X, Ван Ю.Л. и др. (2012) секретируемого белка Кислотные и Рич в цистеин (SPARC) Подавляет ангиогенеза вниз-регуляцию экспрессии VEGF и MMP-7 в рака желудка. PLoS ONE 7 (9): e44618. DOI: 10.1371 /journal.pone.0044618
<р> Редактор: Раджеш Mohanraj, ОАЭ университет, ОАЭ
<р> Поступило: 9 июня 2012 года; Принято: 6 августа 2012 года; Опубликовано: 5 Сентября, 2012
<р> Copyright: © Zhang и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Эта работа финансировался Национальным фондом естественных наук Китая (№ 30901417 /H1617). http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> Среди случаев смерти, связанных с раком, рак желудка занимает второе место в мире после рака легких; почти две трети случаев происходят в развивающихся странах, в том числе 42% из Китая [1]. Ангиогенез является важным процессом при раке желудка; Таким образом, регуляторные и сигнальные молекулы, которые модулируют ангиогенез становятся предметом настоящего исследования. Ангиогенез не активный процесс сам по себе; она находится под контролем некоторых ангиогенных факторов и некоторых ингибиторов ангиогенеза.
<р> секретируемый белок кислой и богат цистеина (SPARC), также известный как остеонектин или БМ-40, представляет собой многогранный секретируемый гликопротеин, который выражается много различных типов клеток и связано с образованием костной ткани, фиброз и восстановления тканей.
<р> Последние исследования показывают, что СПАРК модулирует пролиферацию, апоптоз, инвазию и ангиогенез в различных типах раковых клеток, однако, роль в СПАРК tumourigenesis сложна и, как представляется, клеточного типа конкретных благодаря своим разнообразным функциям в данной микро-среде [2]. функции как SPARC супрессора опухоли в молочной железы, нейробластомы, поджелудочной железы, яичников и рака легких [3]. Рак яичников в СПАРК-нулевых мышей выросли значительно больше, чем в животных дикого типа с увеличенными уровнями фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) и матричных металлопротеиназ (ММР) [4]. Подавляя опухоли венозность путем подавления экспрессии VEGF и секреции, СПАРК ингибирует рост глиомы [5]. СПАРК связывается с VEGF, таким образом, ингибирование VEGFR фосфорилирования, митоген-активируемой протеинкиназы (МАРК) активацию и синтез ДНК VEGF-индуцированный [6]. Тем не менее, роль в СПАРК ангиогенеза также камерного типа специфически, который изменяет передачи сигналов события в ответ на уникальных клеточных кругах [7].
<Р> VEGF стимулирует ангиогенез, и является самым важным белком сигнал, продуцируемый клетками [8]. ММР играют важную роль в развитии опухоли, а не только в деградации внеклеточного матрикса, но и в регуляции ангиогенеза. ММР-7, которая является наименьшей молекулярный вес всех членов семьи ММР, было показано, ускорить пролиферацию эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVECs) в зависимости от дозы, в пробирке
[9].
<р> основная функция СПАРК в ангиогенеза желудка линий раковых клеток остается неясным. Таким образом, в этом исследовании мы предположили, что, возможно, СПАРК модулировать пролиферацию и ангиогенез, регулируя VEGF и ММР-7 выражений в клеток рака желудка. Для проверки этих гипотез, мы проверили экспрессию СПАРК в семи желудочных линиях раковых клеток. Затем, чтобы оценить влияние на измененном СПАРК клеток рака желудка, мы установили КУП-SP клон, который суперэкспрессированный SPARC и клон ТЖК-SH, в которой эндогенный SPARC был сбит.

Результаты

выражение СПАРК в клетках, культивируемых рак желудка
<р> Мы оценили экспрессию СПАРК в нескольких желудочных линиях раковых клеток человека. Вестерн-блоттинг показал, что SPARC был undectable в клеточных линиях АГС, MKN45, NCI-N87 и КУП-823, однако SGC-7901 клеточная линия выражается низкий уровень СПАРК и ТЖК-27, MGC-803 клеточные линии выразили высокий уровень СПАРК ( Рис. 1А)

Гиперэкспрессия и ингибирование эндогенного СПАРК в рак желудка клеточных линий

вестерн-блоттинга показал, что 43 кДа, соответствующая белку SPARC была значительно увеличена в BGC-SP (BGC клетки экспрессирующих СПАРК кДНК) клеток по сравнению с родительскими (КУП-Р) и контрольных клеток, трансфицированных пустым вектором (КУП-EV) (P &ЛТ; 0,05); Серверы SPARC тормозилось почти на две трети в ТЖК-ш-клеток (клеток, экспрессирующих ТЖК-shRNA SPARC) по сравнению с ТЖК-P и ТЖК-EV клеток (P &ЛТ; 0,05, Фигура 1В). RT-PCR показали, что экспрессия мРНК в СПАРК КУП-SP клеток была увеличена по сравнению с BGC-P и клеток BGC-EV (P < 0,05); выражение СПАРК мРНК в HGC-ш уменьшилось почти на 80% по сравнению с HGC-P и клеток ТЖК-EV (P < 0,05, рис 1б).

СПАРК Гиперэкспрессия снижающего пролиферацию рака желудка клеточных линий <бр> <р> Чтобы определить, влияет ли измененную экспрессию СПАРК пролиферацию желудочных линий раковых клеток, рост трансфицированных клеток сравнивали с родительскими и пустой векторных элементов управления. Данные показали, что рост КУП-SP клеток ингибируется по сравнению с КУП-P и КУП-EV клеток через 8 дней культивирования (P ≪ 0,05); рост ТЖК-ш клеток была увеличена незначительно по сравнению с HGC-P и клеток ТЖК-EV (P < 0,05, рис 1C).

СПАРК Гиперэкспрессия в рак желудка клеточных линий снижает ангиогенез В пробирке
и в естественных условиях

<р> Чтобы понять влияние измененной экспрессии СПАРК на ангиогенез в желудочном линиях раковых клеток, HUVECs инкубировали в кондиционированной среды. КУП-SP надосадочную индуцированный HUVECs дифференцироваться в капиллярных структур типа в течение 36 ч (2564,5 ± 553,1 мкм, Р &л; 0,05), в меньшей степени, чем супернатант из клеток КУП-EV (5002,4 ± 665,7 мкм) и КУП-P клеток (5417,3 ± 784,25 мкм, Рисунок 2А). ТЖК-ш надосадочную индуцированное HUVECs дифференцироваться в капиллярно-подобных структур в течение 36 ч (7024,9 ± 923,1 мкм, P &л; 0,05) более сильной степени, чем супернатант из клеток ТЖК-EV (4456,2 ± 554,2 мкм) и ГГК-P клеток (4023,4 ± 665,2 мкм, Рисунок 2А). Количественное средней длины трубки показали, что длина трубки HUVECs в кондиционированной среды из BGC-СП была снижена примерно на 52,7% по сравнению с контрольными клетками; Длина трубки HUVECs в кондиционированной среды от ТЖК-ш клонов увеличилась 74,6% по сравнению с контрольными клетками (рис 2А)
. <р> Модель спинные окно показал, что КУП-SP клетки имели снижение tumour- на 40,4% индуцированной микрососуды по сравнению с контрольными клетками (P &ЛТ; 0,05). ТЖК-SH клетки в дорсальной кожи-кратном камере привело к увеличению на 73,2% в индуцированный опухолью микрососудов, с большим количеством мелких пятен кровотечений по сравнению с контрольными клетками (P &ЛТ 0,05 Рис 2B). Эти результаты ясно показали, что избыточная экспрессия в СПАРК рака желудка ингибирует ангиогенез в пробирке
и В естественных условиях
.

The MAPKs Сигнальный Тропинка и экспрессия VEGF и MMP-7 подавляются на SPARC гИПЕРЭКСПРЕССИЯ
<р> Для того, чтобы определить влияние избыточной экспрессии на СПАРК MMP-7 и VEGF, количественный ПЦР в реальном времени и Вестерн-блоттинга анализы были выполнены. Результаты показали, что ММР-7 и экспрессия СЭФР отрицательно регулируется выражением СПАРК. В КУП-SP клеток, уровни ММР-7 мРНК, ММР-7 белка, мРНК VEGF и белка VEGF тормозились на 87,2%, 68,9%, 48,4% и 58,6%, соответственно, по сравнению с пустой векторных трансфицированных клеток. В ТЖК-Sh клеток, уровень мРНК ММР-7 увеличилась 11,6 раза, уровень белка ММР-7 увеличилась 8,1 раза, уровень мРНК VEGF увеличилось 8,8 раза, а уровень белка VEGF увеличилась в 3,2 раза по сравнению с пустой вектор клеток (Фигура 3А, Б). Для того, чтобы определить, был ли сигнальный путь МАРК регулируется SPARC, SAPK /JNK, ERK1 /2 и р-38 уровней оценивали с помощью вестерн-блоттинга. Результаты показали, что уровни р-ERK1 /2 были значительно уменьшились в КУП-SP клеток и повышен в ТЖК-ш клеток по сравнению с их контрольными клетками (рис 3C).

нокдауна СПАРК выражения в HGC-27 Клетки стимулирует ангиогенез для того, чтобы подтвердить, что проангиогенные эффекты, наблюдаемые с уменьшением экспрессии СПАРК обусловлены повышенной экспрессии ММР-7 и VEGF, а не к уровням с помощью повышающей регуляции VEGF и MMP-7 Expression

сам СПАРК, HUVECs инкубировали в кондиционированной среды найденным ТЖК-Sh клеток с экзогенной добавили рекомбинантный человеческий SPARC (для rhSPARC, 0,3 мкг /мл). Наши данные свидетельствуют о том, что добавление экзогенного SPARC не ингибирует капиллярные подобных структур HUVECs по сравнению с HGC-ш (рисунок 4), в отличие от антиангиогенной реакции, наблюдаемой с эндогенной экспрессии в СПАРК BGC823 клеток (рисунок 2).
<р> для дальнейшей характеризации роли VEGF и MMP-7 в СПАРК-опосредованного ангиогенеза модуляции, ММР-7-shRNA и 1 мкг /мл, нейтрализующие антитела к VEGF (Хемикон, Temacula, CA, USA) использовали для ТЖК-Sh клонов в антагонистами функции MMP-7 и СЭФР.
<р> Мы исследовали способность экспрессии ММР-7 в ТЖК-Sh клеток модулировать ангиогенез <ЕМ> в пробирке Ру по стабильно трансфекцию MMP-7-shRNA в ТЖК-SH клетки. Фиг.4А показывает, что экспрессия ММР-7 в HGC-Sh + MMP7-ш клеток подавлялась при стабильно экспрессирующих ММР-7-ш-РНК до уровня, сравнимого с тем из HGC-P и клеток ТЖК-EV. Для выяснения роли ММР-7 в бросовой СПАРК-опосредованной продвижения опухолевых клеток индуцированных ангиогенеза, мы провели анализ формирования капиллярного с кондиционированной среды ТЖК-ш клеток и HGC-ш + MMP7-ш клеток. Как показано на рисунке 4B, результаты указывают на то, что снижение экспрессии ММР-7 в ТЖК-ш + MMP7-ш клеток приводило к значительно пониженное образование капилляров с помощью HUVECs в пробирке
(ТЖК-ш + MMP7-ш против
ТЖК-ш, р &л;. 0,05)
<р> Для определения функции повышенной экспрессии VEGF, индуцированного СПАРК глушителей, VEGF в кондиционированной среды ТЖК-ш и ТЖК-ш + MMP7-ш клетки нейтрализуют VEGF антителом (1 мкг /мл). Результаты показали, что формирование капилляр HUVECs значительно снизилась в ТЖК-ш супернатанта, содержащего VEGF нейтрализацию антител по сравнению с супернатанта из одних ТЖК-Sh клеток (ТЖК-ш + анти-VEGF против
HGC-ш, P ≪ 0,05 4Б). формирование капиллярного HUVECs было почти полностью ингибируется при культивировании в кондиционированной средах HGC-ш + MMP7-ш клеток плюс добавил VEGF нейтрализующее антитело ( против
ТЖК-ш, Р &л; 0,05 Рисунок 4B).
<р> бессывороточной кондиционированной среды, полученные из HGC-P, HGC-EV, HGC-ш с добавлением или без rhSPARC (0,3 мкг /мл) и ТЖК-Sh + MMP7 М.-Ш. клетки концентрировали с помощью ультрафильтрации трубки (Millipore, Bedford, MA , США) при тех же самых условиях. Вестерн-блоттинг показал, что концентрация в СПАРК ТЖК-Sh клеток с помощью 0,3 мкг /мл rhSPARC inmedium была равна от ТЖК-Р супернатант (фиг.4А).

Сверхэкспрессия SPARC в клетках рака желудка Подавляет Tumourigenicity в голых мышей
<р> Для оценки терапевтической эффективности экспрессии Sparc, в BGC-P, BGC-EV, КУП-SP клетки или HGC-P, HGC-EV, ТЖК-SH клетки вводили подкожно голым мышам. Там не было никакого существенного различия в размерах между BGC-Р (п = 6, средний объем опухоли = 2004 ± 63 мм 3), КУП-EV (п = 6, средний объем опухоли = 1856 ± 69 мм 3 ) ксенотрансплантаты. Значительное снижение (39,1%) в среднего объема опухоли было обнаружено у животных, которым имплантировали КУП-SP ксенотрансплантатов (n = 6; средний объем опухоли = 1130 ± 55 мм 3) по сравнению с животными, которым имплантировали КУП-EV ксенотрансплантатов ( P &л; 0,05, рисунок 5). Там не было никакого существенного различия в размерах между HGC-Р (п = 6, средний объем опухоли = 1605 ± 63 мм 3), ТЖК-EV (п = 6, средний объем опухоли = 1708 ± 82 мм 3 ) ксенотрансплантаты. Значительное увеличение (50,3%) в среднего объема опухоли было обнаружено у животных, которым имплантировали ТЖК-Sh ксенотрансплантатов (n = 6; средний объем опухоли = 2412 ± 75 мм 3) по сравнению с животными, которым имплантировали ТЖК-EV ксенотрансплантатов ( р &л;. 0,05, рисунок 5)
<р> Для оценки SPARC, VEGF, MMP-7 выражений в естественных условиях
, ксенотрансплантатов срезы окрашивали моноклональным антителом против человеческого СПАРК, VEGF или ММР-7 , Рисунок 5А показывает, что КУП-SP опухоли выражают больше, чем SPARC BGC-P, КУП-EV опухолей, в то время как одновременно VEGF, MMP-7 выражения снизились (P &л; 0,05, рис, 5А). Отрывки из ТЖК-ш опухолей выражают меньше, чем SPARC HGC-P, опухоли ТЖК-EV в то время как одновременно VEGF, MMP-7 выражения увеличиваются (Р &л; 0,05, рис 5А). CD31 используется в основном для демонстрации присутствия эндотелиальных клеток сосудов в секциях гистологических тканей, которые могут помочь оценить степень ангиогенеза опухоли. Для того, чтобы оценить, является ли измененную экспрессию СПАРК опосредованной плотности микрососудов (MVD), мы проанализировали ангиогенез в ксенографтов гистологическим анализом CD-31. Там не было никаких существенных различий в МВД между BGC-P (12,5 ± 2,3 микрососудов /0,145 мм 2), КУП-EV (11,5 ± 3,4 микрососудов /0,145 мм 2) ксенотрансплантатов. МВД РФ была снижена 54,8% в BGC-SP (5,2 ± 2,1 микрососудов в /мм 2) опухоли по сравнению с КУП-EV опухолей (P < 0,05, рис 5). Там не было никаких существенных различий в МВД между HGC-P (6,4 ± 2,1 микрососудов /0,145 мм 2), ТЖК-EV (6,9 ± 1,8 микрососудов /0,145 мм 2) ксенотрансплантаты. МВД РФ был повышен 51,7% в HGC-ш (10,5 ± 1,5 микрососудов /0,145 мм 2) опухоли по сравнению с ТЖК-EV опухолей (P < 0,05, рисунок 5)

Обсуждение
<р.> СПАРК представляет собой ткань-специфический белок, который влияет на несколько клеточных процессов, включая пролиферацию, инвазию и ангиогенез переменно в различных типах тканей. Например, предыдущие исследования показали, что СПАРК способствовало вторжение в то время как одновременно подавляя рост опухолей [5], [10]. В медуллобластоме, сверхэкспрессия СПАРК может ингибировать ангиогенез в опухоли путем снижения экспрессии и секреции VEGF и MMP-9 [11]. В меланоме, однако, экспрессия СПАРК положительно коррелировал с ангиогенеза [12]. Функция СПАРК в раковых клетках желудка, остается неясным.
<Р> Для того чтобы исследовать роль СПАРК при раке желудка, мы впервые тестировали экспрессию СПАРК в семи клеточных линий рака желудка. Большинство линий клеток не выражают, или экспрессируется только низкий уровень СПАРК. Для определения роли СПАРК в росте и ангиогенеза рака желудка, мы создали клон КУП-SP, который был стабильно трансфицированных вектором СПАРК кДНК, и клон ТЖК-SH, который был стабильно трансфицированных вектором shRNA ориентации мРНК SPARC. Выражение СПАРК значительно увеличилось в КУП-SP клона и снижение в ТЖК-ш клона по сравнению с их соответствующими контрольными клонами, как это определено с помощью Вестерн-блоттинга и ОТ-ПЦР анализы. Скорость пролиферации клеток была ниже в КУП-SP клона, и была выше в ТЖК-ш клона, чем в своих клонов управления методом МТТ. Мы также обнаружили, что избыточная экспрессия СПАРК тормозится клеток-индуцированной формирование капилляров опухоли HUVECs в пробирке
и ангиогенез в окне анализа спинным В естественных условиях
. С другой стороны, вниз-регулирование СПАРК мРНК вмешательства способствовали формированию капиллярного в пробирке
и ангиогенез В естественных условиях
.
<Р> Кровеносные сосуды необходимы для доставки питательных веществ к тканям , Таким образом, неоваскуляризация является необходимым для развития солидной опухоли. Предыдущие исследования показали, что СПАРК играет определенную роль в ангиогенезе [7]. Наши результаты показали, что избыточная экспрессия ингибирует ангиогенез СПАРК в пробирке
и В естественных условиях
в связи с уменьшением ММР-7, VEGF и фосфорилирования ERK1 /2, в то время как вниз регулирование способствовало СПАРК ангиогенез в пробирке
и в естественных условиях
в связи с увеличением ММР-7, VEGF и фосфорилирования ERK1 /2.
<р> Мы также реализованы исследования с целью изучения роли VEGF и MMP-7 в СПАРК-опосредованного ангиогенеза модуляции. Когда рекомбинантный белок СПАРК человек был добавлен в кондиционированной среде из ТЖК-ш клона, чтобы восстановить концентрацию SPARC, это кондиционированная среда не изменилась формирование капиллярный HUVECs по в пробирке
анализа по сравнению с формированием капиллярного HUVECs в инкубированных состояние среда без экзогенного rhSPARC. Затем мы использовали MMP-7-shRNA к понижающей регуляции ММР-7 экспрессию в ТЖК-ш клона, и /или анти-VEGF-антитела для нейтрализации VEGF в кондиционированной среде от ТЖК-ш клона. формирование капиллярного HUVECs значительно тормозится, когда они инкубировать в кондиционированной среде с более низким ММР-7 и /или заблокированного VEGF. Эти эксперименты показывают, что СПАРК понижающую регуляцию сама по себе недостаточна для индукции неоваскуляризации, а также другие факторы должны быть вовлечены в этот процесс.
<Р> СЭФР играет ключевую роль в ангиогенезе, и необходимо для выживания эндотелиальных клеток [8]. В глиомы, СПАРК ингибирует рост опухоли путем изменения его микросреду и подавляя его ангиогенез посредством ингибирования экспрессии VEGF и секреции [5]. Там может быть отрицательная связь между СПАРК и выражениями, т.е. VEGF, тем больше СПАРК, тем меньше VEGF или наоборот
[13], [14].
<Р> ММР-7 способен унижающие базальной мембраны или соединительной ткани вокруг сосудов. Он также стимулирует синтез ДНК в культивируемых эндотелиальных клетках сосудов и индуцирует ангиогенез в месте, где раковые клетки толстой кишки были имплантированы в мышиной модели [15]. VEGF и другие ангиогенные факторы действуют в основном через МАРК сигнальных путей, которые, как полагают, являются важными пути передачи, участвующих в процессах неоваскуляризации в опухолях [8]. Наше недавнее исследование показало, что экспрессия ММР-7 модулировался через активацию МАРК сигнальных путей [16]. Некоторые исследования также показали, что отрицательно СПАРК модулирует активацию МАРК путей [17]. Следовательно, выражение СПАРК может изменить баланс в ангиогенный опухолей путем снижения регулирующей ряд факторов, способствующих неоваскуляризации.
<Р> Для исследования функции СПАРК в регуляции желудочной роста рака <ЕМ> В естественных условиях
, КУП-SP и клоны ТЖК-SH-клеток по сравнению с их клонов контроля за их способности образовывать опухоли в модели подкожного. СПАРК избыточная экспрессия значительно уменьшил размер ксенотрансплантированной опухоли с уменьшенным МВД РФ, понижающей регуляции СПАРК путем РНК-интерференции способствовало росту ксенотрансплантированной опухоли с повышенным МВД РФ. Таким образом, в желудочном ксенотрансплантатов рака, экспрессия СПАРК отрицательно коррелирует с ангиогенезом. Предыдущие исследования показали, что СПАРК вклад в регуляции образования опухоли, хотя его роль, казалось, камерного типа специфичны. В гепатоцеллюлярный рак ксенотрансплантаты клеточных линий, SPARC избыточная экспрессия значительно задерживается формирование опухоли, уменьшение размера опухоли и снижение MVD по сравнению с контрольными ксенотрансплантатов [18]. В тканях рака толстой кишки, экспрессия СПАРК отрицательно коррелировала с экспрессией VEGF и МВД РФ [19]. В медуллобластомой клетках, СПАРК гиперэкспрессия ингибирует ангиогенез приводит к снижению роста опухоли [11]. В микрососудистых эндотелиальных клетках человека, СПАРК ингибирует синтез ДНК <ЕМ> в пробирке
[6]. В нейробластомы ксенотрансплантатов, пептиды ингибируют SPARC ангиогенез и рост опухоли В естественных условиях
[20]. Эти результаты подтвердили, рабочую станцию ​​SPARC в качестве ингибитора ангиогенеза опухоли <ЕМ> В естественных условиях
.
<Р> СПАРК выражается в нормальных эпителиальных клеток желудка, клеток рака желудка, а также стромальных клеток, окружающих рак желудка на более низком уровне [21 ]. Исследование показало, что иммуногистохимии СПАРК основном экспрессируется в стромальных клетках, окружающих опухоль [22]. Эти расхождения не могут быть полностью объяснены. Выражение СПАРК может зависеть от гистологического типа опухоли, или наоборот
. Недавнее исследование показало, что иммуногистохимии экспрессия СПАРК отрицательно коррелировала с экспрессией VEGF и MVD в желудочном раковых тканей, и экспрессия СПАРК уменьшилась в раке желудка с более высокой степени злокачественности [23].
<Р> Таким образом, торможение роста рака желудка по СПАРК-видимому, опосредованы через его подавление эффектов на ММР-7 и СЭФР выражений, которые могут в свою очередь, ингибирующих микрососудов инфильтрации в опухоли. Мы пришли к выводу, что понижающая регуляция СПАРК может ассоциировать с развитием рака желудка, а также исследование целью регулировать экспрессию SPARC может стать значимым подходом к улучшению лечения рака желудка.

Материалы и методы

Антитела и реагенты
<р> Антитела против СПАРК (Santa Cruz Biotechnology, Санта-Круз, Калифорния, США), (p-) SAPK /JNK, (p-) ERK1 /2, (р) р-38, ММР-7 (технология клеточной сигнализации, Danvers, MA, USA), VEGF, и CD31 (Abcam, Кембридж, Массачусетс, США) были использованы для вестерн-блоттинга и иммуногистохимии. RhSPARC поставлялся R &Amp; D (Миннеаполис, штат Миннесота, США). Обратную транскрипцию-ПЦР-комплект был поставлен фирмой Promega (Madison, WI, USA). ММР-7-shRNA (KH00809P, SuperArray Bioscience Corp. Фредерик, штат Мэриленд, США) использовали для понижающей регуляции MMP-7 в клеточных клонов. β-казеин (С-6905, Sigma-Aldrich Corporation, Натик, Миннесота, США) использовали в бета-казеин зимографией. Все другие реагенты были аналитической чистоты или выше.

Культура клеток

желудка человека линии раковых клеток АГС, MKN-45, NCI-N87, BGC823, MGC803, HGC27, SGC7901 были получены из институт рака китайской академии медицинских наук. Все клетки культивировали в среде RPMI 1640, дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS). КУП-EV (трансфицированные пустым вектором), КУП-SP (гиперэкспрессией SPARC кДНК), ТЖК-EV (экспрессирующих пустой вектор) и ТЖК-ш (выражающий SPARC shRNA) выращивали в полной среде RPMI 1640 с использованием G418 (50 мкг /мл) , Все клетки поддерживали в монослойных культурах при 37 ° С в увлажненном воздухе с 5% CO <югу> 2.

Создание BGC-SP, ТЖК-ш клонами и ТЖК-ш-ш-MMP7 Клоны <бр> <р> примерно 150000 клеток КУП-823 высевали на лунку в шести-луночный планшет в среде RPMI 1640 с добавлением 10% FBS и позволяли закрепляться в течение ночи. Эквимолярные количества пкДНК3.1 с полной длины кДНК СПАРК вектор или пустым вектором (Invitrogen, San Diego, CA, США), инкубировали с Липофектамин-2000 Реагент трансфекции (Invitrogen, San Diego, CA, USA). Подтверждено SureSilencing человек SPARC shRNA и пустой вектор управления были получены из SuperArray Bioscience Corp. (Фредерик, штат Мэриленд, США). ТЖК-27 клетки трансфицировали, как описано ранее [24]. Вкратце, клетки были трансфицированы в стабильном состоянии с использованием липофектамина. Трансфицированные клетки были отобраны с G418 (100 мкг /мл для BGC-SP и ТЖК-Sh клонов) в течение 14 дней перед выделением отдельных клонов. были установлены ТЖК-ш-MMP7-SH варианты, как описано выше, клон клеток ТЖК-SH трансфицировали ММР-7-shRNA (KH00809P, SuperArray Bioscience Corp. Фредерик, штат Мэриленд, США) с использованием липофектамина. Затем трансфецированные клетки отбирали путем пуромицин (1 мкг /мл) в течение 10 дней.

пролиферации клеток Анализ
<р> пролиферации клеток определяли с помощью 3- (4,5-диметилтиазол-2- ил) -2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ), как описано ранее [24]. Вкратце, 500 клетки культивировали на лунку в 96-луночные планшеты и инкубировали в течение 8 дней, а затем, МТТ (R &Amp; D, Миннеаполис, штат Миннесота, США) добавляли к клеткам. значения оптической плотности при 550 нм измеряли с помощью микропланшет-ридера. Результаты были представлены как средние значения оптической плотности при 550 нм, а среднее (± стандартное отклонение) определений из шести четырех повторах отдельных экспериментов.

Вестерн блот анализ
<р> Всего лизаты клеток получали и анализировали с помощью вестерн-блоттинга как описано ранее [24]. Вкратце, антитела к СПАРК, MMP-7 и VEGF (1:1000 разведение) были использованы для обнаружения SPARC, MMP-7 и VEGF, соответственно, в то время как антитела к (р) SAPK /JNK, (р) ERK1 /2 и (р) р-38 (1:800 разведение) были использованы для выявления активации сигнального пути МАРК. Связанные антитела визуализировали с помощью ECL (Promega, Madison, WI, USA) на Kodak Image Station Pro System 4000 мм (Kodak, Рочестер, штат Нью-Йорк, США). Плотность полос количественно с помощью денситометрическом анализа с помощью инструмента Image (версия 3.0) системы.

RT-PCR и количественный ПЦР в реальном времени
<р> Общую РНК выделяли из стабильно трансфицированных опухолевых клеток с использованием реагента тризола (Invitrogen, San Diego, CA, США) и обрабатывали в течение 45 мин при 37 ° C с RQ1 ДНКазы (Promega, Madison, WI, USA). РНК подвергали обратной транскрипции с использованием AMV обратной транскриптазы (A3500, Promega, Madison, WI, USA). Количественная ПЦР в реальном времени проводили в системе ABI Prism7300 последовательности обнаружения (Applied Biosystems, Беверли, штат Массачусетс, США) с использованием набора для A6001 GoTaq КПЦР Master Mix (Promega, Madison, WI, USA). Праймеры, используемые для количественной ПЦР в реальном времени были следующими: ММР-7, 5'-GGAGATGCTCACTTCGATGA-3 '(смысловой) и 5'-ATACCCAAAGAATGGCCAAG-3' (антисмысловой); и СЭФР, 5'-AGGAGGAGGGCAGAATCATCA-3 '(смысловой) и 5'-CTCGATTGGATGGCAGTAGCT-3' (антисмысловой). Праймеры, используемые для ПЦР были следующими: Sparc, в 5'-CTCGAGATGAGGGCCTGGATCTTC-3 '(смысловой) и 5'-GGATCCCGGATCACAAGATCCTTGTCG-3' (антисмысловой); и глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (GAPDH), 5'-GGAGTCCACTGGCGTCTTC-3 '(смысловой) и 5'-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTG-3' (антисмысловой).

β-казеин зимографии
<р> функциональная активность ММР-7 оценивали с помощью β-казеина зимографии на 10% полиакриламидном геле внедренных с 1 мг /мл бета-казеина. были электрофорезу равные количества бессывороточной кондиционированной среды от клеток, культивированных в течение 24 часов. После электрофореза гели промывали в 2,5% Triton X-100 в течение одного часа дл удалени ДДС. Затем гели выдерживают в течение 18 ч при температуре 37 ° С в 50 мМ Трис /HCl, содержащем 10 мМ CaCl <суб> 2 и 0,02% NaN <суб> 3, окрашивали кумасси бриллиантовым синим, а затем отмывали. Протеолитические деятельность скрытой MMP-7 и активированную ММР-7 были свидетельствуют в виде полос с молекулярными массами 28 и 19 кДа, соответственно.

Комнаты Медиа Коллекция для экспериментирования

В общей сложности, 2 × 10 ^{5 клеток HGC-P, BGC-P или их соответствующих стабильно трансфецированных клонов были посеяны и инкубировали в полной среде RPMI 1640, в 6-луночных камерных слайдами и оставляли расти в течение 24 часов. Затем кондиционированную среду собирали, маркированы и хранили при -80 ° C для использования в будущем.}

эндотелиальные клетки капиллярного типа Формирование труб Анализ
<р> Для того, чтобы изучить влияние на СПАРК в витро
ангиогенез, пробирного образование капиллярная проводили. В этом анализе Матригель пипеткой в ​​предварительно охлажденные 96-луночные планшеты (75 мкл Матригель на лунку) и полимеризуется в течение 30 мин при 37 ° С. Для того, чтобы определить, является ли измененную экспрессию СПАРК будет регулировать ангиогенез, HUVECs (5000 клеток на лунку) инкубировали в 100 мкл кондиционированной среды добываемых из различных видов клеток. Через 36 ч инкубации, были сфотографированы трубчатые структуры. Каждое условие анализа оценивали в четырех определений из трех отдельных экспериментов. Изображения были получены с помощью удара A640 камеры Cannon подачи питания на Olympus инвертированный микроскоп с 100-кратным увеличением; длина трубки была количественно с помощью IPP (версия 6.0, Медиа Кибернетика, Silver Spring, MD).

Спинной кожи раз камера Модель
<р> Исследования проводились в соответствии с протоколом, утвержденным Уход за животными и использование комитета Пекинского университета (этическое одобрение заявка номер No. J201155). В VIVO
процедуры были в соответствии с рекомендациями, приведенными в Руководстве по уходу и использованию лабораторных животных Национальных институтов здравоохранения. Бестимусных голых мышей (возраст 6 недель, женщина, 26-28 г, п = 3 на группу) были разведены, и поддерживается в стерильном среде. Методика имплантации была описана ранее [11]. Воздушный мешок, спинной было сделано в мыши путем введения 10 мл воздуха подкожно после того, как животное анестезировали полностью. Диффузионная камера (Millipore, Bedford, MA, США) были получены путем выравнивания 0,45-мм Millipore мембраны на обеих сторонах обода кольца 'O' с цементом. КУП-P, КУП-EV и КУП-SP; ТЖК-П, ТЖК-EV или ТЖК-SH-клетки (1 × 10 ^{6) суспендировали в PBS вводили в камеру. Предусмотрено наличие 2 см длиной надрез в горизонтальном направлении вдоль кромки воздушного мешочка дорсальную, а камеры были помещены под кожей. Мышей умерщвляли через 10 дней. Животные были тщательно кожурой вокруг имплантированных камер. Складки кожи, покрывающие камеры были сфотографированы в видимом свете. Количество кровеносных сосудов подсчитывали.}

ксенотрансплантатных Модели и Immunohistochemistry

бестимусных голых мышей были рандомизированы к различным группам (n = 6 в каждой группе). Мышам инокулировали подкожно в нижней задней боковой стороны с человеческим BGC-P, КУП-Е.В., КУП-SP или ТЖК-ЕР, ТЖК-Е.В., ТЖК-SH-клетки (2 × 10 ^{6 клеток на мышь). Мониторинг роста опухоли при пальпации на месте прививки.}

• PLoS ONE: Раскрывая молекулярный механизм рака желудка Маркер аннексина A4 в пролиферации клеток рака Использова…
• PLoS ONE: Функциональная PstI /RsaI полиморфизма CYP2E1 связан с развитием, прогрессом и неблагоприятный исход рака желу…