PLoS One: kiválasztott fehérje savas és gazdag cisztein (SPARC) elnyomja angiogenezis alulszabályozza a VEGF expresszióját és MMP-7 Gyomor Cancer

absztrakt katalógusa

Háttér katalógusa

kiválasztott fehérje savas és gazdag cisztein (SPARC) egy glikoprotein, hogy a funkciók, hogy gátolja az angiogenezist, a proliferációt, és invázió a különböző típusú rák. Az a képesség, a SPARC modulálására neovascularisatio úgy véljük, hogy közvetíti a részben az a képessége, hogy modulálják a kifejezés a vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) és a mátrix metalloproteinázok (MMP-k). Ebben a tanulmányban célul tűztük annak meghatározására, hogy a SPARC kifejezés a gyomorrák sejtek szaporodási és angiogenezis in vitro katalógusa és in vivo katalógusa.

Módszer katalógusa

értékeltük kifejezése SPARC hét humán gyomorrák sejtvonalakon. Aztán létrehozott egy stabilan transzfektált SPARC túlzott mértékben sejtvonal (BGC-SP) és a stabilan transzfektált SPARC knock-down sejtvonalat (HGC-sh). A hatás a SPARC túltermelése és SPARC hangtompító vizsgáltuk vizsgálatával kapilláris kialakulása HUVEC in vitro katalógusa és egy ICL-szeres kamra modell in vivo katalógusa. Kvantitatív valós idejű PCR és Western blot végeztünk érzékelni, ha a kifejezést a VEGF és MMP-7-ben modulált SPARC kifejezést. További meghatározása hatásának SPARC kifejezés angiogenezis in vivo katalógusa, xenograftmodellekben hozták létre és mikroerek sűrűség (MVD) különböző klónokat immunhisztokémiával. Katalógusa

Eredmények katalógusa

endogén SPARC overexpressziója gátolta a VEGF expresszióját és az MMP-7, valamint az angiogenézis által indukált BGC-SP sejtek. Ennek megfelelően, a SPARC silencing növelte a VEGF expresszióját és az MMP-7, valamint az angiogenézis által indukált HGC-SH sejtekben. Emelkedett az angiogenezis okozta SPARC hangtompító a HGC-sh-sejtek csökkent, ha a VEGF semlegesítette antitestek és MMP-7 volt, leütötte in vitro katalógusa.

Következtetés katalógusa

SPARC elnyomja angiogenezis gyomorrák által le-expresszióját szabályozó VEGF és az MMP-7.

bevezető hivatkozás: Zhang JL, Chen GW, Liu YC, Wang PY, Wang X, Wan YL, et al. (2012) kiválasztott fehérje savas és Gazdag cisztein (SPARC) elnyomja angiogenezist alulszabályozza a VEGF expresszióját és MMP-7 gyomorrákban. PLoS ONE 7 (9): e44618. doi: 10,1371 /journal.pone.0044618 katalógusa

Szerkesztő: Rajesh Mohanraj, EAE University, Egyesült Arab Emírségek katalógusa

Beérkezett: június 9, 2012-ben; Elfogadva: augusztus 6, 2012; Megjelent: szeptember 5, 2012 katalógusa

Copyright: © Zhang et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: Ez a munka finanszírozta a Nemzeti Természettudományi Alapítvány Kína (No. 30901417 /H1617). http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm. A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

Az onkológiai összefüggő halálesetek gyomorrák a második helyen áll az egész világon a tüdőrák után; közel kétharmada az esetek fordulnak elő a fejlődő országokban, köztük 42% Kínából [1]. Az angiogenezis kritikus folyamat gyomorrák; Ezért szabályozási és jelátviteli molekulák, amelyek befolyásolják az angiogenezis válnak a hangsúly a jelenlegi kutatás. Az angiogenezis nem egy aktív folyamat önmagában; ez által irányított egyes angiogén faktorok és néhány angiogenezis inhibitorai.

kiválasztott fehérje savas és gazdag cisztein (SPARC), más néven Osteonectin vagy BM-40, egy sokoldalú szekretált glikoprotein által expresszált sok különböző típusú sejtek, és a kapcsolódó csontképződés, fibrózis és a szöveti javítás.

a legújabb vizsgálatok azt mutatják, hogy a SPARC modulálja proliferáció, apoptózis, invázió és az angiogenezis a különböző típusú rákos sejtekben azonban a szerepe a SPARC a tumorgenesisben bonyolult és úgy tűnik, hogy a sejt-típus specifikus miatt a különböző funkciók egy adott mikro-környezet [2]. SPARC működik, mint egy tumorszuppresszor emlő, neuroblasztóma, hasnyálmirigy-, petefészek- és tüdőrákok [3]. Petefészekrák SPARC-null egerekben nőtt jelentősen nagyobb, mint a vad típusú állatok kibővített szinten a vascularis endothelialis növekedési faktor (VEGF) és a mátrix metalloproteinázok (MMP-k) [4]. Elnyomja a tumor erezettség keresztül elnyomása VEGF expresszióját és szekrécióját, SPARC gátolta glioma növekedést [5]. SPARC kötődik a VEGF és így gátolja a VEGFR foszforiláció, mitogén-aktivált protein kinázok (MAPK) aktiváció és VEGF-fel indukált DNS szintézist [6]. Azonban a szerepe a SPARC angiogenezisben is sejttípus-specifikus, amely megváltoztatja jelátviteli események válaszul egyedi sejtes miliők [7].

VEGF stimulálja az angiogenezist, és a legfontosabb jel sejtjei által termelt fehérjét [8]. Az MMP-k fontos szerepet játszanak a tumor fejlődés, nem csak a lebontó az extracelluláris mátrixban, hanem a szabályozó angiogenezist. MMP-7, ami a legkisebb molekulatömege minden MMP család tagjai, kimutatták, hogy felgyorsítsa a proliferációját humán köldökvéna endoteliális sejteket (HUVEC) dózis-függő módon in vitro
[9].

Az elsődleges funkciója a SPARC az angiogenezisben a gyomor rákos sejtvonalak még nem tisztázott. Ezért, ebben a tanulmányban, feltételeztük, hogy a SPARC esetleg modulálják proliferációt és az angiogenezist szabályozásával VEGF és MMP-7 kifejezések gyomor rákos sejtekben. Tesztelni ezeket a hipotéziseket, teszteltük kifejezése SPARC hét gyomor rákos sejtvonalak. Aztán, hogy értékelje a hatása megváltozott SPARC gyomor rákos sejteket, létrehoztunk egy BGC-SP-klón, amely túlzott mértékben SPARC és HGC-sh klónt, amely az endogén SPARC ütötték le. Katalógusa

Eredmények katalógusa

Expression SPARC tenyésztett gyomorkarcinóma sejtek

Mi értékelte kifejezése SPARC számos emberi gyomor rákos sejtvonalak. Western blot azt mutatta, hogy a SPARC volt undectable AGS, MKN45, NCI-N87 és BGC-823 sejtvonal azonban SGC-7901 sejtvonal fejezte alacsony SPARC és HGC-27, MGC-803 sejtvonal fejezte magas szintű SPARC ( 1A). katalógusa

túltermelése és gátlása endogén SPARC gyomorrákban sejtvonalak

Western blot azt mutatta, hogy a 43 kDa megfelelő SPARC fehérje szignifikánsan nagyobb volt a BGC-SP (BGC sejtek expresszáló SPARC cDNS) sejteket, mint a szülői (BGC-P) és a kontroll transzfektált sejtek az üres vektort (BGC-EV) (P < 0,05); A SPARC gátolta közel kétharmada a HGC-sh sejtek (HGC kifejező sejtek SPARC-shRNS) képest HGC-P és HGC-EV sejtek (P < 0,05, 1B). RT-PCR jelezte, hogy a SPARC-mRNS expresszióját a BGC-SP sejtek megnövekedett összehasonlítva BGC-P és BGC-EV sejteket (P < 0,05); A SPARC mRNS expresszió HGC-sh csökkent közel 80% -os, mint HGC-P és HGC-EV sejtek (P < 0,05, 1B). katalógusa

SPARC túltermelése Csökkenti proliferáció Gyomorrák sejtvonalak

Annak meghatározására, hogy megváltozott a SPARC expressziója befolyásolja az elterjedése a gyomor rákos sejtvonalak, a növekedés a transzfektált sejteket összehasonlítottuk a szülői és üres vektor kontrollok. Az adatok azt mutatták, hogy a növekedés a BGC-SP sejtek gátolta összehasonlítva BGC-P és BGC-EV sejteket 8 nap után a kultúra (P < 0,05); A növekedés HGC-sh sejtek emelkedett képest enyhén HGC-P és HGC-EV sejteket (P < 0,05, 1C). katalógusa

SPARC túltermelése gyomorrákban sejtvonalak Csökkenti Az angiogenezis in vitro
és in vivo Matton

Ahhoz, hogy megértsük a hatása megváltozott SPARC véleménynyilvánítás angiogenezis a gyomor rákos sejtvonalak, HUVEC inkubáltuk kondicionált média. A BGC-SP felülúszó által indukált HUVEC differenciálódni kapilláris-szerű szerkezetek számított 36 óra (2564,5 ± 553,1 jim, a P < 0,05) kisebb mértékben, mint a felülúszót BGC-EV sejtek (5002,4 ± 665,7 nM) és BGC-P-sejtek (5417,3 ± 784,25 nm, a 2A ábra). A HGC-SH felülúszó által indukált HUVEC differenciálódni kapilláris-szerű szerkezetek számított 36 óra (7024,9 ± 923,1 jim, a P < 0,05) erősebb mértékben, mint a felülúszót HGC-EV sejtek (4456,2 ± 554,2 nM) és HGC-P-sejtek (4023,4 ± 665,2 nm, a 2A ábra). Számszerűsítése átlagos cső hossza jelezte, hogy a cső hossza HUVEC in származó kondicionált tápközeggel BGC-SP -kal csökkent körülbelül 52,7%, összehasonlítva a kontroll sejtek; cső hossza HUVEC in származó kondicionált tápközeggel HGC-SH klónok emelkedett 74,6%, összehasonlítva a kontroll sejtek (2A ábra).

A dorsalis ablak modell azt mutatta, hogy BGC-SP sejtek volt 40,4% -os csökkenést tumour- indukált mikroerek összehasonlítva kontroll sejtek (P < 0,05). HGC-SH sejteket a dorzális bőr-szeres kamra eredményezett 73,2% -os növekedését a tumor-indukált mikroerek, egy nagyobb számú apró vérző foltok összehasonlítva kontroll sejtek (P < 0,05 2B ábra). Ezek az eredmények egyértelműen azt mutatták, hogy a SPARC túltermelése gyomorrák gátolja az angiogenezis in vitro katalógusa és in vivo katalógusa.

A MAPK jeladás Út és VEGF expressziót és az MMP-7 gátoltak által SPARC túlexpressziója

hatásának meghatározására SPARC túlexpresszió MMP-7 és a VEGF, kvantitatív valós idejű PCR és Western blot vizsgálatokat végeztünk. Az eredmények azt mutatták, hogy az MMP-7 és a VEGF expresszióját által negatívan szabályozott SPARC kifejezést. A BGC-SP sejtek szintje MMP-7 mRNS, MMP-7 fehérje, a VEGF mRNS, és a VEGF fehérjét gátolta 87,2%, 68,9%, 48,4%, és 58,6% -kal, összehasonlítva az üres vektorral transzfektált sejtekben. A HGC-SH sejtekben, az MMP-7 mRNS szintje emelkedett 11,6-szeres, az MMP-7 fehérje szintje emelkedett 8,1-szeres, a VEGF mRNS szintje emelkedett 8,8-szeres, és a VEGF fehérje szintje növekedett 3,2-szeres képest üres vektor sejtek (a 3a ábrát, B). Annak meghatározására, hogy a MAPK jelátviteli útvonal által szabályozott SPARC, SAPK /JNK, ERK1 /2 és P-38 szinteket vizsgáltuk Western-blottal. Az eredmények azt mutatták, hogy a szintek p-ERK1 /2 szignifikánsan csökkent BGC-SP sejtek és emelkedett a HGC-SH sejtekben, összehasonlítva a kontroll sejtek (3C, ábra).

knock-down SPARC Expresszió HGC-27 sejteket serkenti az angiogenezist keresztül Up szabályozott VEGF és az MMP-7 Expression katalógusa

Annak igazolására, hogy a pro-angiogenetikus észlelt csökkent SPARC kifejezés miatt fokozott MMP-7 és a VEGF expresszió és nem szintek SPARC önmagában HUVEC inkubáltuk kondicionált médiumok betakarított HGC-SH sejteket exogén hozzáadott rekombináns humán SPARC (rhSPARC, 0,3 ng /ml). Eredményeink azt mutatták, hogy hozzáadásával exogén SPARC nem gátolta a kapilláris-szerű struktúrák HUVEC képest HGC-SH (4. ábra), ellentétben az anti-angiogén válasz látható endogén expressziója SPARC a BGC823 sejtekben (2. ábra).

további jellemzése a szerepe a VEGF és MMP-7 SPARC-közvetített angiogenezis moduláció, MMP-7-shRNS és 1 ng /ml semlegesítő VEGF antitest (Chemicon, Temacula, CA, USA) alkalmaztunk HGC-SH klónok antagonizálhatják funkcióit MMP-7 és a VEGF. katalógusa

Megvizsgáltuk a képessége MMP-7 expresszió HGC-sh sejtek az angiogenezis modulálására in vitro katalógusa által stabilan transzfektálása MMP-7-shRNS be HGC-SH sejtekben. Ábra a 4A azt jelzi, hogy az MMP-7 HGC-SH + MMP7-SH sejtekben alulszabályozott által stabilan expresszáló MMP-7-SH-RNS-szintre, amely összehasonlítható HGC-P és HGC-EV sejteket. Ahhoz, hogy vizsgálhassuk a szerepe az MMP-7 knock-down SPARC-mediált előmozdítása tumorsejt-indukált angiogenezis végeztünk kapilláris képződés elemzés kondicionált közegek HGC-SH sejteket és HGC-SH + MMP7-SH sejtekben. Ahogyan a 4b ábrán látható, az eredmények azt mutatják, hogy a csökkent MMP-7 expresszió HGC-SH + MMP7-SH sejteket vezetett jelentősen csökkent kapilláris képződés által HUVEC in vitro katalógusa (HGC-SH + MMP7-SH vs
HGC-SH, a P < 0,05).

Annak megállapításához, a funkció az emelkedett VEGF által indukált SPARC hangtompító, a VEGF a kondicionált közegben a HGC-SH és HGC-SH + MMP7-SH sejtek semlegesítjük VEGF antitesttel (1 ng /ml). Az eredmények azt mutatták, hogy a kapilláris kialakulását HUVEC szignifikánsan csökkent a HGC-sh tartalmazó felülúszót VEGF semlegesítő ellenanyag képest származó felülúszót HGC-sh csak sejtek (HGC-sh + anti-VEGF vs katalógusa HGC-sh, P < 0,05 4b ábra). Kapilláris kialakulását HUVEC majdnem teljesen gátolt volt, ha tenyésztett kondicionált médiumok a HGC-SH + MMP7-SH sejteket plusz hozzáadott VEGF semlegesítő antitest ( vs
HGC-SH, a P < 0,05 4b ábra).

szérum-mentes kondicionált médiumok betakarított HGC-P, HGC-EV, HGC-SH vagy anélkül rhSPARC (0,3 ng /ml) és HGC-SH + MMP7-SH sejteket ultraszűréssel koncentráljuk cső (Millipore, Bedford, MA , USA) azonos feltételek mellett. Western blot azt mutatja, hogy a koncentráció a SPARC a HGC-SH sejteket 0,3 ug /ml rhSPARC inmedium egyenlő volt, hogy a HGC-P felülúszó (4a ábra).

túlexpressziója SPARC gyomorkarcinómában Cells Gátolja Tumourigenicity csupasz egerekben katalógusa

Annak felmérése terápiás hatékonyságát SPARC kifejezés, BGC-P, BGC-EV, BGC-SP sejtek vagy HGC-P, HGC-EV, HGC-sh sejteket injektáltunk szubkután nude egerekben. Nem volt szignifikáns különbség a mérete között BGC-P (n = 6; átlagos tumortérfogat = 2004 ± 63 mm ^{3), BGC-EV (n = 6; átlagos tumortérfogat = 1856 ± 69 mm 3 ) vizsgálatára. Jelentős csökkenése (39,1%) az átlagos tumor térfogat találtak állatok beültetett BGC-SP xenograftok (n = 6; átlagos tumortérfogat = 1130 ± 55 mm 3) képest állatok beültetett BGC-EV átültetést hordoznak ( P < 0,05, 5. ábra). Nem volt szignifikáns különbség a mérete között HGC-P (n = 6; átlagos tumortérfogat = 1605 ± 63 mm 3), HGC-EV (n = 6; átlagos tumortérfogat = 1708 ± 82 mm 3 ) vizsgálatára. Jelentős növekedés (50,3%) az átlagos tumor térfogat találtak állatok beültetett HGC-SH xenograftok (n = 6; átlagos tumortérfogat = 2412 ± 75 mm 3) képest állatok beültetett HGC-EV átültetést hordoznak ( P < 0,05, 5. ábra).}

Annak megállapítására, SPARC, VEGF, az MMP-7 kifejezések in vivo katalógusa, xenograft metszeteket monoklonális antitest ellen emberi SPARC, a VEGF vagy MMP-7 . 5A ábra azt mutatja, hogy BGC-SP daganatok expressz több mint SPARC BGC-P, BGC-EV daganatok, míg egyidejűleg a VEGF, az MMP-7 kifejezések csökkent (P < 0,05, 5A). Metszetet HGC-sh daganatok kifejezni kevesebb SPARC mint HGC-P, HGC-EV tumorokat, míg egyidejűleg a VEGF, az MMP-7 kifejezések emelkedett (P < 0,05, 5A). CD31 használják elsősorban a jelenlétét igazolják, a vaszkuláris endoteliális sejtek hisztológiai szöveti metszeteken, ami segíthet, hogy értékelje a mértéke a tumor angiogenezis. Annak megállapítására, hogy megváltozott a SPARC kifejezés közvetített a mikroerek sűrűség (MVD), elemeztük angiogenezis-xenograftok szövettani elemzése CD-31. Nem volt szignifikáns különbség a MVD között BGC-P (12,5 ± 2,3 erek /0,145 mm ^{2), BGC-EV (11,5 ± 3,4 erek /0,145 mm 2) vizsgálatára. MVD csökkent 54,8% -ban BGC-SP (5,2 ± 2,1 mikroerek per /mm 2) tumorok összehasonlítva BGC-EV tumorok (P < 0,05, 5. ábra). Nem volt szignifikáns különbség a MVD között HGC-P (6,4 ± 2,1 erek /0,145 mm 2), HGC-EV (6,9 ± 1,8 erek /0,145 mm 2) vizsgálatára. MVD-t emelkedett 51,7% -ban HGC-sh (10,5 ± 1,5 erek /0,145 mm 2) tumorok képest HGC-EV tumorok (P < 0,05, 5. ábra). Katalógusa}

Vita katalógusa

SPARC egy szövet-specifikus fehérje, amely befolyásolja több sejt folyamatok, beleértve a szaporodást, invázió és angiogenezis változóan a különböző típusú szöveteket. Például, a korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a SPARC elősegítette az invázió, miközben egyidejűleg gátolják a daganatok növekedését [5], [10]. Medulloblastoma, az overexpressziója SPARC gátolhatják az angiogenézis a tumor csökkentésével expresszióját és szekrécióját a VEGF és MMP-9 [11]. A melanoma, azonban a kifejezés a SPARC pozitív korrelációt mutatott a angiogenezis [12]. A funkció a SPARC a gyomorrák-sejtek még nem tisztázott.

Annak érdekében, hogy vizsgálja meg a szerepét a SPARC a gyomorrák, először azt vizsgáltuk, a kifejezés a SPARC hét sejtvonal gyomorrák. A legtöbb sejtvonal nem kifejezett, vagy csak kifejezett alacsony SPARC. Annak meghatározására, a szerepe a SPARC a növekedés és az angiogenezis a gyomorrák, létrehoztuk a BGC-SP klón, melyet stabilan transzfektáltunk egy SPARC cDNS vektor, és a HGC-SH klónt, amely stabilan transzfektált shRNS vektor célzási SPARC mRNS-t. SPARC expresszió jelentősen nőtt BGC-SP-klón és csökkent HGC-SH klón képest saját kontroll klónok által meghatározott, a Western-blot és RT-PCR-analízissel. Cell proliferációs rátája alacsonyabb volt a BGC-SP klón, és nagyobb volt HGC-SH klón, mint a saját kontroll klónok MTT módszerrel. Azt is megállapították, hogy túltermelése SPARC gátolta a tumor sejtek által indukált kapilláris kialakulását HUVEC in vitro katalógusa és az angiogenezis dorzális ablakban assay in vivo katalógusa. Másrészt, leszabályozza SPARC mRNS interferencia támogatni kapilláris képződés in vitro katalógusa és az angiogenezis in vivo katalógusa.

A vérerek eléréséhez nélkülözhetetlen tápanyagok szövetek . Ezért neovaszkularizáció elengedhetetlen a fejlődés a szilárd daganat. Korábbi tanulmányok már kimutatták, hogy a SPARC szerepet játszik az angiogenezisben [7]. Eredményeink azt mutatták, hogy overexpressziója SPARC gátolta az angiogenezist in vitro
és a in vivo
együttműködve a csökkenés az MMP-7, VEGF és foszforilált ERK1 /2, míg a down-regulációja SPARC mozdítani angiogenezis in vitro katalógusa és in vivo katalógusa együtt a növekedés MMP-7, VEGF és foszforilált ERK1 /2. katalógusa

további végrehajtott vizsgálatok, hogy vizsgálja meg a szerepét VEGF és MMP-7 SPARC-közvetített angiogenezis modulációja. Amikor rekombináns humán SPARC fehérjét adtunk kondicionált tápközeggel HGC-SH klón visszaállítani SPARC koncentráció, ez a kondicionált közeg nem változott a kapilláris képződését HUVEC által in vitro
assay képest a kapilláris képződését HUVEC inkubáljuk a feltétel nélküli közeget exogén rhSPARC. Ezután használt MMP-7-shRNS lefelé szabályozni az MMP-7-expresszió HGC-SH klón, és /vagy anti-VEGF antitest semlegesítése VEGF kondicionált tápközeggel HGC-SH klón. Kapilláris képződését HUVEC gátlódott szignifikánsan, amikor inkubáljuk a kondicionált közegben, alacsonyabb MMP-7 és /vagy blokkolt VEGF. Ezek a kísérletek arra utalnak, hogy a SPARC down-regulációja önmagában nem elégséges a indukciója neovascularisatio, és egyéb tényezőket kell részt ebben a folyamatban.

A VEGF kulcsfontosságú szerepet játszik az angiogenezisben, és szükséges a túlélés a endoteliális sejt [8]. A glióma, SPARC gátolta a tumor növekedését azáltal, hogy megváltoztatja a mikro-környezet és elnyomja annak angiogenezist gátlásán keresztül a VEGF expresszióját és szekrécióját [5]. Lehet, hogy egy negatív kapcsolatát SPARC és VEGF kifejezést, azaz a több SPARC, annál kisebb VEGF vagy fordítva katalógusa [13], [14]. Katalógusa

MMP-7 képes megalázó membrán vagy kötőszövet körüli hajó. Azt is stimulálja a DNS-szintézist tenyésztett vaszkuláris endoteliális sejtek, és indukál angiogenezis a helyszínen, ahol a vastagbél rákos sejteket ültettünk egy egér modell [15]. A VEGF és más angiogén faktorok működnek elsősorban MAPK jelátviteli utak, amelyek úgy gondolják, hogy fontos transzdukciós utak részt vesz a neovascularisatio folyamatokban a tumorokban [8]. A kutatás kimutatta, hogy az MMP-7 expresszió modulált keresztül MAPK jelátviteli útvonalak [16]. Számos tanulmány azt is kimutatták, hogy a SPARC negatívan modulált aktiválását MAPK útvonalak [17]. Következésképpen SPARC kifejezés megváltoztathatja angiogén egyensúly tumorok alulszabályozza sorozata érújdonképződésben elősegítő faktorok. Katalógusa

Annak vizsgálatára funkciójának SPARC szabályozásában gyomorrák növekedés in vivo katalógusa, BGC-SP és HGC-SH sejt klónokat képest a kontroll klónok képességükre képeznek tumorokat szubkután modellben. SPARC overexpressziója szignifikánsan csökkentette a méret-xenograftot hordozó tumor csökkentett MVD, down-regulációja SPARC RNS interferencia elősegítette a növekedés-xenograftot hordozó tumor megnövelt MVD. Ezért a gyomorrák tumorsejteket SPARC kifejezés negatívan korrelál az angiogenezis. Korábbi tanulmányok azt mutatták, hogy a SPARC hozzájárult a szabályozás tumorképződés, bár a szerepe tűnt sejttípus-specifikus. A hepatocelluláris rák sejt-vonal xenograftok, SPARC overexpressziója jelentősen késlelteti a tumor kialakulását, csökkent a daganat mérete, és csökkent MVD képest kontroll xenograftok [18]. Vastagbélrákban szövetekben, SPARC kifejezés negatívan korrelált a VEGF és MVD [19]. Medulloblastoma sejtekben, SPARC overexpressziója gátolta az angiogenezist, ami a csökkenés a tumor növekedésének [11]. A humán mikrovaszkuláris endoteliális sejtek, a SPARC gátolja a DNS szintézist in vitro
[6]. Neuroblastoma xenograftok, SPARC peptidek gátolta angiogenezist és tumornövekedést in vivo katalógusa [20]. Ezek az eredmények megerősítik a SPARC inhibitorként tumor angiogenezis in vivo
.

SPARC fejezi normál gyomornyálkahártya-sejtek, gyomorrák-sejtek, és a körülvevő stromális sejtek gyomorrák alacsonyabb szinten [21 ]. Immunohisztokémiai tanulmány kimutatta, hogy a SPARC főleg kifejezett stromális sejtek a tumort körülvevő [22]. Ezek az eltérések nem lehet teljes mértékben magyarázható. SPARC kifejezés függhet szövettani típusú daganat, vagy fordítva katalógusa. Legutóbbi immunhisztokémiai vizsgálat megállapította, hogy a SPARC kifejezése negatívan korrelált a VEGF expresszióját és MVD gyomorrákban szövetekben, és SPARC expresszió csökkent a gyomorrák nagyobb fokú a malignitás. [23] katalógusa

Összefoglalva, a növekedés gátlása gyomorrák által SPARC Úgy ​​tűnik, a közvetített keresztül elnyomás hatása az MMP-7 és a VEGF kifejezések, ami viszont gátolja a mikroerek beszivárgása daganatok. Arra a következtetésre jutottunk, hogy leszabályozza SPARC társulhatnak az elért gyomorrák, és a feltárás célja, hogy szabályozza a SPARC kifejezés válhat egy értelmes megközelítés javítása gyomorrák kezelésére. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

antitestek és reagensek

elleni antitestek SPARC (santa Cruz Biotechnology, santa Cruz, CA, USA), a (P-) SAPK /JNK, (P-) ERK1 /2, (P-) p-38, MMP-7 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), a VEGF, és a CD31 (ABCAM, Cambridge, MA, USA) alkalmaztunk Western blot és immunhisztokémiai. A rhSPARC szállította R &D (Minneapolis, MN, USA). Reverz transzkripció-PCR kitet által szállított Promega (Madison, WI, USA). MMP-7-shRNS (KH00809P, SuperArray Bioscience Corp. Frederick, MD, USA) használtunk a down-regulációja MMP-7, a sejt klónok. β-kazein (C-6905, Sigma-Aldrich Corporation, Natick, MA, USA) használtunk β-kazein zimográfia. Az összes többi reagens analitikai minőségű vagy annál jobb. Katalógusa

Cell Culture katalógusa

Az emberi gyomor rákos sejtvonalak AGS, MKN-45, NCI-N87, BGC823, MGC803, HGC27, SGC7901 kaptuk a Cancer Institute, a kínai Orvostudományi Akadémia Science. Minden sejteket RPMI 1640 tápközegben, amelyet 10% magzati borjúszérummal (FBS). BGC-EV (transzfektált üres vektor), BGC-SP (overexpresszáló SPARC cDNS), HGC-EV (expresszáló üres vektor) és HGC-SH (expresszáló SPARC shRNS) tenyésztettünk komplett RPMI 1640 G418-cal (50 ng /ml) . Minden sejteket tartottunk fenn egyrétegű tenyészeteket 37 ° C-on nedvesített levegő, 5% CO _2.

létrehozása BGC-SP, HGC-SH klónok és HGC-SH-MMP7-SH klónok

megközelítőleg 150.000 BGC-823 sejteket lyukanként egy hat lyukú lemez RPMI 1640, 10% FBS-sel és éjszakán át hagytuk letapadni. Ekvimoláris mennyiségű pcDNA3.1 teljes hosszúságú SPARC cDNS vektor vagy az üres vektorral (Invitrogen, San Diego, CA, USA) inkubáltuk Lipofectamine-2000 transzfekciós reagens (Invitrogen, San Diego, CA, USA). Validált SureSilencing emberi SPARC shRNS és üres kontroll vektorral kaptuk SuperArray Bioscience Corp. (Frederick, MD, USA). HGC-27 sejteket transzfektáltunk a korábban leírtak szerint [24]. Röviden, sejteket transzfektáltunk stabil módon Lipofectamine. A transzfektált sejteket szelektáltuk G418-cal (100 ng /ml BGC-SP és HGC-SH klónok) 14 napig, mielőtt az izolálását egyedi klónok. HGC-SH-MMP7-SH variánsokat hoztak létre a fent leírt módon, HGC-SH klón sejteket transzfektáltunk az MMP-7-shRNS (KH00809P, SuperArray Bioscience Corp. Frederick, MD, USA) Lipofectamine. Ezután transzfektált sejteket által kiválasztott puromicin (1 ug /ml), 10 napig.

Cell Proliferation Assay

A sejtproliferációt úgy határoztuk meg, egy 3- (4,5-dimetil-2- il) -2,5-difenil-bromid (MTT) vizsgálat a korábban leírtak szerint [24]. Röviden, 500 sejteket tenyésztettünk lyukanként 96 lyukú lemezekre, és inkubáltuk 8 napig, majd MTT-t (R &D, Minneapolis, MN, USA) adtunk a sejtekhez. Abszorbancia értékeket 550 nm-en mértük egy mikrolemez leolvasóval. Az eredményeket mutatjuk jelent abszorbancia 550 nm-en, és a (± SD) a négy meghatározás hat külön kísérletben.

Western-blot-analízis

Teljes sejt lizátumokat állítottunk elő és vizsgáltunk Western-blot a korábban leírtak [24]. Röviden: antitesteket, a SPARC, MMP-7, és a VEGF (1:1000 hígítás) kimutatására használt SPARC, MMP-7, és a VEGF, illetve, míg antitestek (P-) SAPK /JNK, (P-) ERK1 /a 2. és (P-) p-38 (1:800 hígítás) kimutatására használt MAPK jelátviteli út. A kötött antitesteket láthatóvá ECL (Promega, Madison, WI, USA), egy Kodak Image Station 4000 mm Pro Rendszer (Kodak, Rochester, NY, USA). A sűrűsége a sávok mennyiségileg denzitometriás analízissel Image Tool (version 3.0) rendszer. Katalógusa

RT-PCR és kvantitatív valós idejű PCR katalógusa

A teljes RNS-t izoláltunk stabilan transzfektált tumorsejtek Trizol reagens (Invitrogen, San Diego, CA, USA) és a kezelt 45 percen át 37 ° C-RQ1 DNáz (Promega, Madison, WI, USA). RNS-t reverz transzkripcióval segítségével AMV reverz transzkriptázt (A3500, Promega, Madison, WI, USA). Kvantitatív valós idejű PCR-t végeztünk egy ABI Prism7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Beverly, MA, USA) használva egy GoTaq qPCR Master Mix A6001 készlettel (Promega, Madison, WI, USA). Használt primereket kvantitatív valós idejű PCR a következők voltak: MMP-7, 5'-GGAGATGCTCACTTCGATGA-3 '(szensz), és 5'-ATACCCAAAGAATGGCCAAG-3' (antiszensz); és VEGF, 5'-AGGAGGAGGGCAGAATCATCA-3 '(szensz), és 5'-CTCGATTGGATGGCAGTAGCT-3' (antiszensz). Használt primerek PCR a következők voltak: SPARC, 5'-CTCGAGATGAGGGCCTGGATCTTC-3 '(szensz), és 5'-GGATCCCGGATCACAAGATCCTTGTCG-3' (antiszensz); és gliceraldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH), 5'-GGAGTCCACTGGCGTCTTC-3 '(szensz), és 5'-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTG-3' (antiszensz).

β-kazein zimográfia

funkcionális aktivitását MMP-7 értékeltük β-kazein zimográfia 10% -os poliakrilamid gélen beágyazott 1 mg /ml β-kazein. Azonos mennyiségű szérummentes kondicionált tápközeg nőtt sejtekből 24 órán át elektroforetizáltuk. Az elektroforézis után a géleket mossuk, 2,5% Triton X-100-on egy órán az SDS eltávolítása céljából. Ezután a géleket 18 órán át inkubáltuk 37 ° C hőmérsékleten 50 mM Tris /HCI, amely 10 mM CaCI _{2 és 0,02% NaN 3, megfestettük Coomassie Brilliant Blue, majd a festéket eltávolítjuk. Proteolitikus aktivitása látens MMP-7 és az aktivált MMP-7 észlelhetők sávok molekulatömegű 28 és 19 kDa. Katalógusa}

kondicionált Media Collection kísérletügyi katalógusa

A teljes, 2 × 10 ^{5 sejtek HGC-P, BGC-P vagy azok megfelelő stabilan transzfektált klónokat beoltjuk és inkubáljuk komplett RPMI 1640 6 mélyedéses kamra csúszdák és hagytuk növekedni 24 órán át. Ezt követően kondicionált médiumot összegyűjtöttük, felcímkézett és -80 ° C-on, későbbi használatra. Katalógusa}

Az endothel sejtek kapilláris-szerű csőképződésre Analitika katalógusa

hatásának vizsgálata SPARC a vitro
angiogenezis, egy kapilláris képződés vizsgálatot végeztünk. Ebben a vizsgálatban a Matrigel pipettáztunk előhűtött 96 lyukú lemezeken (75 ul Matrigel üregenként) és polimerizált 30 percen át 37 ° C-on. Annak meghatározására, hogy megváltozott a SPARC kifejezés szabályozza angiogenezis, HUVEC (5000 sejt per lyuk) inkubálunk 100 ul kondicionált médiumok betakarított különböző típusú sejtek. Miután 36 óra inkubálás Csőszerkezetek lefényképeztük. Minden vizsgálati körülményhez értékelték négy meghatározás három külön kísérletben. A képeket egy Cannon teljesítmény lövés A640 fényképezőgép Olympus inverz mikroszkóp 100 × nagyítással; A cső hossza mennyiségileg IPP segítségével (6.0, Media Kibernetikai, Silver Spring, MD). katalógusa

ICL-szeres tanács Model katalógusa

A vizsgálatokat végeztek összhangban protokoll által jóváhagyott Animal Care and Use Committee a pekingi egyetem (etikus alkalmazás jóváhagyási szám No. J201155). A in vivo katalógusa eljárások voltak ajánlásaival összhangban az Útmutató az ápolási és a laboratóriumi állatok felhasználását a National Institutes of Health. Thymushiányos csupasz egerekben (6 hetes, nőstény, 26-28 g, n = 3 csoportonként) tenyésztik és tartják fenn egy csíramentes környezetben. Az implantációs technikát korábban már leírták [11]. A dorzális léghólyag történt az egér befecskendezésével 10 ml levegőt szubkután után az állatot érzéstelenítettük teljesen. Diffúziós kamrák (Millipore, Bedford, MA, USA) állítottuk elő összehangolásával 0,45 mm-es Millipore membránok mindkét oldalán a pereme a "O" gyűrű cementtel. BGC-P, BGC-EV és BGC-SP; HGC-P, HGC-EV vagy HGC-SH sejteket (1 × 10 ^{6) PBS-ben szuszpendáljuk injektáltunk a kamrába. Egy 2 cm hosszú bemetszést végeztünk vízszintesen széle mentén a dorzális légzsák, és a kamrák kerültek a bőr alá. Az egereket leöltük 10 nappal később. Az állatokat óvatosan megnyúzott körül a beültetett kamrák. A hajlatokban kiterjedő kamrákat fényképezett látható fényben. A véredények száma megszámoltuk. Katalógusa}

xenograftmodellekben és immunhisztokémiai katalógusa

A athymikus egereket véletlenszerűen különböző csoportokba sorolják (n = 6 csoportonként). Az egereket szubkután oltottuk az alsó hátsó szárnyon humán BGC-P, BGC-EV, BGC-SP vagy HGC-EP, HGC-EV, HGC-SH sejteket (2 × 10 ^{6 sejt per egér). Tumor növekedés követtük tapintással helyén beoltás.}

• PLoS One: feltárása molekuláris mechanizmusa gyomorrák Marker annexin A4 rákos sejtek szaporodásának exon mátrixok
• PLoS One: Funkcionális Pstl /RsaI polimorfizmusa CYP2E1 jár a fejlesztés, Progression és rossz kimenetel a gyomorrák