PLoS ONE: baltymas rūgštus ir Turtingas cisteinas (SPARC) Stabdo angiogenezę Down reguliavimas VEGF ir MMP-7 raišką Skrandžio Cancer

Anotacija

Fonas

baltymas rūgštus ir daug cisteino (SPARC) yra glikoproteinas, kuris funkcijos slopina angiogenezę, proliferaciją, ir invazija įvairių tipų vėžio. Iš SPARC gebėjimas moduliuoti neovaskuliarizacija yra manoma, kad būti tarpininkaujant iš dalies, kad ji gali moduliuoti kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus (VEGF) ir matrikso metaloproteinazių (MMP) išraiška. Šiame tyrime siekėme nustatyti SPARC raiškos poveikį skrandžio vėžio ląsteles nuo platinimo ir angiogenezę in vitro, parsisiųsti ir vivo
.

metodas

įvertino išraišką SPARC septynių žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas. Tada mes sukūrėme stabiliai perkeltų SPARC ekspresija ląstelių linija (BGC-SP) ir stabiliai transfekuotos SPARC trankyti į apačią ląstelių linija (HGC-sh). Iš SPARC raiškos ir SPARC nuslopinami poveikis buvo tiriamas nagrinėjant kapiliarų formavimąsi HUVECs in vitro, parsisiųsti ir nugaros odos raukšlės kameros modelį in vivo
. Kiekybinis realaus laiko PGR ir imunoblotingu buvo atlikti, siekiant nustatyti, ar VEGF ir MMP-7 išsireiškimai buvo moduliuoti SPARC išraiška. Toliau nustatyti SPARC raiškos poveikį angiogenezę vivo
buvo įkurta ksenografiniuose modeliai ir kraujagyslių tankis (VRM) skirtingų klonų buvo aptikta imunohistocheminiu.

Rezultatai

endogeninės SPARC raiškos slopina VEGF ir MMP-7 išraiška, taip pat angiogenezę, kurį sukelia BGC-SP ląstelių. Atitinkamai, SPARC triukšmo slopinimo padidėjo VEGF ir MMP-7 išraiška, taip pat angiogenezę, kurį sukelia HGC-sh ląstelių. Padidėjęs angiogenezę sukeltas SPARC slopinimo į HGC-sh ląstelių sumažėjo, kai VEGF buvo neutralizuoti antikūnų, ir MMP-7 buvo nuversta vitro
.

Išvada

SPARC slopina angiogenezę skrandžio vėžio žemyn reguliuojant VEGF ir MMP-7 išraišką

nurodomoji dalis:. Zhang JL Chen GW Liu YC Wang PY Wang X Wan ilas, et al., (2012) baltymas rūgštus ir Turtingas cisteinas (SPARC) Stabdo angiogenezę Down reguliavimas VEGF ir MMP-7 išraiška skrandžio vėžio. PLoS vieną iš 7 (9): e44618. Doi: 10,1371 /journal.pone.0044618

redaktorius: Rajesh Mohanraj, JAE universitetas, Jungtiniai Arabų Emyratai

Įstojo: birželio 9, 2012; Priimtas rugpjūčio 6, 2012 m Paskelbta: Spalis 5, 2012

Visos teisės saugomos: © Zhang et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas buvo finansuojamas iš nacionalinio Gamtos mokslo fondo Kinijos (Nr 30.901.417 /H1617). http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm. Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Tarp vėžio mirčių, skrandžio vėžys užima antrą vietą pasaulyje po plaučių vėžio; beveik du trečdaliai atvejų įvyksta besivystančiose šalyse, įskaitant 42% iš Kinijos [1]. Angiogenezę yra kritinis procesas skrandžio vėžio; Todėl, reguliavimo ir signalizacijos molekulės, kurios moduliuoja angiogenezę yra tapusi šio tyrimo dėmesio centre. Angiogenezę yra ne aktyvus procesas, savaime; ji kontroliuoja kai kurių angiogeninių veiksnių ir kai kurių angiogenezę inhibitoriais.

baltymas rūgštus ir daug cisteino (SPARC), taip pat žinomas kaip Osteonectin ar BM-40, yra įvairiapusė sekretuojamą glikoproteinas, kuris išreiškiamas daug skirtingų tipų ląstelių ir yra susijęs su kaulų formavimuisi, fibrozės ir audinių remontas.

Neseniai atlikti tyrimai rodo, kad "SPARC moduliuoja platinimu, apoptozę invazija bei angiogenezę įvairių tipų vėžio ląsteles, tačiau SPARC vaidmenį tumorogenezės yra sudėtingas ir atrodo, kad būti specifinis ląstelių tipo atsižvelgiant į jos įvairių funkcijų tam tikroje mikro-aplinkoje [2]. SPARC veikia kaip auglio slopinamojo krūtimi, neuroblastomos, kasos, kiaušidžių ir plaučių vėžio [3]. Kiaušidžių vėžys SPARC null pelių augo žymiai didesnis negu laukinio tipo gyvūnų su patobulintą lygių kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus (VEGF) ir matricos metaloproteinazių (MMP) [4]. Slopina naviko kraujagyslių per slopinimo VEGF saviraiškos ir sekrecija, SPARC slopinamas glioma augimo [5]. SPARC jungiasi prie VEGF, todėl slopina KEAFR fosforilinimo, mitogenu aktyvinto proteino kinazės receptorius (MAPK) įjungimas ir VEGF sukeltos DNR sintezę [6]. Tačiau SPARC vaidmuo angiogenezės yra taip pat ląstelių-tipo konkrečių, kuris keičia impulsų perdavimą įvykius reaguojant į unikalių korinio aplinkose [7].

VEGF stimuliuoja angiogenezę, ir yra labiausiai svarbus signalas baltymas, gaminamas ląstelių [8]. MMPs vaidina svarbų vaidmenį navikų vystymosi ne tik žeminančio tarpląsteliniame bet ir reguliuojant angiogenezę. MMP-7, kuris yra mažiausias molekulinė masė visų MMP šeimos nariams, buvo įrodyta, kad pagreitinti žmogaus bambos venos endotelio ląstelių (HUVECs) dozės priklausomu būdu platinimu in vitro
[9].

pagrindinė funkcija SPARC ir angiogenezę skrandžio vėžio ląstelių linijų lieka neaiškus. Todėl šiame tyrime mes iškėlė hipotezę, kad "SPARC gali moduliuoti platinimu ir angiogenezę reguliuojant VEGF ir MMP-7 išraiškas skrandžio vėžio ląsteles. Išbandyti šias hipotezes, mes patikrinome išraišką SPARC septyniose skrandžio vėžio ląstelių linijas. Tada įvertinti pakitusiu SPARC skrandžio vėžio ląstelių poveikį, mes sukūrėme BGC-SP klonas kuris ekspresija SPARC ir HGC-sh klonas, kurioje endogeninė SPARC buvo nuversta.

Rezultatai

išraiška SPARC kultūringas skrandžio vėžio ląstelių

Mes įvertinome išraišką SPARC keliose žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas. Imunoblotingu parodė, kad "SPARC buvo undectable į AGS, MKN45, NVI-N87 ir BGC-823 ląstelių linijas, tačiau SGC-7901 ląstelių linija išreikšti mažą SPARC ir HGC 27, MSV-803 ląstelių linijos išreiškė aukštą SPARC ( 1A pav.)

Padidėjusi parsisiųsti ir slopinimas endogeninio SPARC skrandžio vėžio ląstelių linijas

Imunoblotingo parodė, kad 43 kDa juosta, atitinkanti SPARC baltymų kiekis buvo daug didesnis BGC-SP (bgc ląstelių išreikšti SPARC kDNR) ląstelių, palyginti su tėvinių (BGC-P), ir kontrolinių ląstelių, transfekuotų su tuščiu vektoriaus (BGC-EV) (P < 0,05); SPARC buvo slopinamas beveik du trečdaliai į HGC-sh ląstelių (HGC ląstelių išreiškė SPARC shRNR), palyginti su HGC-P ir HGC-EV ląstelių (p < 0,05, 1B pav.) AT-PGR nurodė, kad "SPARC iRNR raiška BGC-SP ląstelių buvo padidintas, palyginti su BGC-P ir BGC-EV ląstelių (p < 0,05); SPARC iRNR raiška HGC-sh sumažėjo beveik 80%, palyginti su HGC-P ir HGC-EV ląstelių (P < 0,05, 1B pav.)

SPARC Padidėjusi sumažėjimai Daugėja skrandžio vėžio ląstelių linijas

Norėdami nustatyti, ar pasikeitė SPARC išraiška įtakos skrandžio vėžio ląstelių linijų proliferaciją, kad perkeltų ląstelių augimas buvo palyginti su tėvų ir tuščių vektoriaus kontrolė. Duomenys parodė, kad BGC-SP ląstelių augimas buvo slopinamas, palyginti su BGC-P ir BGC-EV ląstelių po to, kai 8 dienų kultūros (P < 0,05); iš HGC-sh ląstelių augimas buvo šiek tiek padidėjo, palyginti su HGC-P ir HGC-EV ląstelių (p < 0,05, 1C pav.)

SPARC Padidėjusi skrandžio vėžio ląstelių linijas Sumažina Angiogenezė in vitro
ir vivo

Jei suprasti pakitusiu SPARC raiškos poveikį angiogenezę skrandžio vėžio ląstelių linijas, HUVECs buvo inkubuojami kondicionieriai žiniasklaida. BGC-SP paviršinis sukeltas HUVECs diferencijuojasi į kapiliarų-kaip statinių per 36 h (2564,5 ± 553,1 mkm, p < 0,05), kiek mažiau nei virš nuosėdų nuo BGC-EV ląstelių (5002,4 ± 665,7 mikrometrai) ir BGC-P ląstelių (5417,3 ± 784,25 mkm, 2A pav.) HGC-SH paviršinis sukeltas HUVECs diferencijuojasi į kapiliarų-kaip statinių per 36 h (7024,9 ± 923,1 mkm, p < 0,05) su stipresniu mastu negu virš nuosėdų nuo HGC-EV ląstelių (4456,2 ± 554,2 mikrometrai) ir HGC-P ląstelių (4023,4 ± 665,2 mkm, 2A pav.) Kiekybinis vidutinis vamzdžio ilgis nurodė, kad vamzdelis ilgis HUVECs į galutinai apdorotas žiniasklaidos nuo BGC-SP sumažėjo maždaug 52,7%, palyginti su kontrolinių ląstelių; vamzdžio ilgis nuo HUVECs į galutinai apdorotas žiniasklaidos iš HGC-sh klonų buvo padidintas 74,6%, palyginti su kontrolinių ląstelių (2a pav.)

nugaros langas modelis parodė, kad BGC-SP ląstelės turėjo 40,4% sumažėjo naviku sukeltas mikrokraujagysles, palyginti su kontrolinių ląstelių (P < 0,05). HGC-sh ląstelės nugaros odos raukšlės kameroje lėmė 73,2% padidėjęs naviko sukelta kraujagyslėms, su didesniu skaičiumi maža kraujavimo dėmės, palyginti su kontrolinių ląstelių (p < 0,05 2B pav). Šie rezultatai aiškiai parodė, kad "SPARC raiškos skrandžio vėžio slopina angiogenezę in vitro parsisiųsti ir vivo
.

Apie MAPKs signalizacijos kelią ir išraiška VEGF ir MMP-7 yra Slopino iki SPARC raiška

Norėdami nustatyti SPARC raiškos poveikį MMP-7 ir VEGF, kiekybinis realaus laiko PGR ir Imunoblotingo tyrimai buvo atlikti. Rezultatai parodė, kad MMP-7 ir VEGF išraiška buvo neigiamai reglamentuoja SPARC išraiška. Į BGC-SP ląstelių, lygiai MMP-7 mRNR, MMP-7 baltymų, VEGF mRNR, ir VEGF baltymų buvo slopinamas 87,2%, 68,9%, 48,4%, ir 58,6%, atitinkamai, palyginti su tuščių vektoriaus transfekuota ląstelių. Į HGC-sh ląstelių, MMP-7 lygis mRNR padidėjo 11,6 kartus, MMP-7 baltymų lygis padidėjo 8,1 karto, VEGF lygis mRNR padidėjo 8,8 karto, o VEGF baltymų lygis padidėjo 3,2 karto, palyginti su tuščia vektoriaus ląstelės (pav 3A, B). Norint nustatyti, ar MAPK signalizacijos kelias reglamentavo SPARC, SAPK /JNK, ERK1 /2 ir p-38 koncentracija buvo vertinama Imunoblotingo. Rezultatai parodė, kad lygiai p-ERK1 /2 buvo žymiai sumažėjo BGC-SP ląstelių ir padidėjusi HGC-sh ląstelių, lyginant su jų kontrolinių ląstelių (3c pav.)

Knock žemyn SPARC išraiška HGC-27 Ląstelės Skatina angiogenezę per Up-reguliuojama VEGF ir MMP-7 raiškos pervežimas

Norėdami patvirtinti, kad PRO angiogenezę reiškiniai su sumažėjusiu "SPARC išraiška yra dėl padidėjusios MMP-7 ir VEGF išraiška, o ne lygių pati SPARC, HUVECs buvo inkubuojami kondicionieriai žiniasklaidos nuimtų nuo HGC-sh ląstelių su egzogeninė pridūrė rekombinantinio žmogaus SPARC (rhSPARC, 0,3 mikrogramų /ml). Mūsų duomenys rodo, kad pridedant egzogeninės SPARC neslopina kapiliarų-kaip struktūras HUVECs palyginti su HGC-sh (4 paveikslas), skirtingai nuo antiangiogeninį atsakas pastebėtas su endogeninio išraiška SPARC į BGC823 ląstelių (2 paveikslas).

Jei papildomai apibūdinti VEGF ir MMP-7 vaidmenį SPARC sąlygojamą angiogeneziniu moduliavimo, MMP-7-shRNR ir 1 mikrogramai /ml neutralizuojančių VEGF antikūnas (Chemicon, Temacula, CA, JAV) buvo naudojami HGC-sh klonų slopinti MMP-7 ir VEGF funkcijas.

išnagrinėjo MMP-7 raiškos gebėjimus HGC-sh ląstelių diferencijuoti angiogenezę in vitro
pagal stabiliai transfekuoja MMP-7-shRNR į HGC-sh ląstelės. 4a paveikslas rodo, kad MMP-7 išraiška HGC-sh + MMP7-SH ląstelių buvo žemyn-reguliuoja stabiliai išreikšti MMP-7-SH-RNR iki tokio lygio, panašios ir palyginamos su HGC-P ir HGC-EV ląstelių. Išsiaiškinti, kad MMP-7 vaidmenį Knock žemyn SPARC sąlygojamą skatinimo naviko ląstelių sukeltas angiogenezę, mes atliekame kapiliarų susidarymas analizę su apdorotų priemonėse HGC-sh ląstelių ir HGC-sh + MMP7-SH ląsteles. Kaip nurodyta 4B paveiksle, rezultatai rodo, kad sumažėjo MMP-7 išraišką HGC-sh + MMP7-SH ląstelių lėmė kapiliarų formavimas žymiai sumažėjo HUVECs in vitro
(HGC-SH + MMP7-sh vs
HGC-SH, p. < 0,05)

Norėdami nustatyti padidėjusi VEGF išraiškos sukeltos SPARC nuslopinami funkciją, VEGF kiekį sąlygoja priemonėse HGC-sh ir HGC-sh + MMP7-sh ląstelės buvo neutralizuotas VEGF antikūno (1 g /ml). Rezultatai parodė, kad kapiliarinis formavimas HUVECs buvo žymiai sumažėjo HGC-sh virš nuosėdų, kurių sudėtyje yra VEGF neutralizuojančių antikūnų, palyginti su nuopilo nuo vien HGC-sh ląstelių (HGC-SH + Anti-VEGF, vs pervežimas HGC-sh, P < 0,05 4B pav). Kapiliarinis formavimas HUVECs buvo beveik visiškai slopino kai kultivuojamos apdorotas priemonėse HGC-sh + MMP7-sh ląstelių plius pridėta VEGF neutralizuojančių antikūnų ( vs
HGC-SH, "P < 0,05 4B pav.)

Serumo be sutvarkytuose žiniasklaidos nuskinti nuo HGC-p, HGC-EV, HGC-sh su arba be rhSPARC (0,3 g /ml) ir HGC-SH + MMP7-sh ląstelių buvo koncentruojamas ultrafiltracji vamzdžio (Millipore Bedford, MA , JAV), tomis pačiomis sąlygomis. Imunoblotingu parodė, kad SPARC koncentracija HGC-sh ląstelių 0,3 mikrogramai /ml rhSPARC inmedium buvo lygus, kad iš HGC-P, virš nuosėdų (4a pav.)

Padidėjusi SPARC skrandžio vėžio ląstelių Slopina tumorogeniškumą nuogas Pelės

Jei įvertinti terapinį veiksmingumą SPARC išraiškos, BGC-p, BGC-EV, BGC-SP ląstelių ar HGC-p, HGC-EV, HGC-sh ląstelės buvo švirkščiamas į poodį į nuogas pelių. Nebuvo jokio reikšmingo skirtumo dydžio tarp BGC-P (n = 6; galvoje auglys tūris = 2004 ± 63 mm ^{3), BGC-EV (n = 6; galvoje auglys tūris = 1856 ± 69 mm 3 ) ksenoimplantai. Gerokai sumažės (39,1%) vidutinis naviko tūrio rastas implantuoti su BGC-SP audiniuose, gyvūnų (n = 6; reiškia naviko tūrį = 1130 ± 55 mm 3), palyginti su implantuoti su BGC-EV audiniuose, gyvūnų ( P < 0,05, 5 pav). Nebuvo jokio reikšmingo skirtumo dydžio tarp HGC-P (n = 6; galvoje auglys tūris = 1605 ± 63 mm 3), HGC-EV (n = 6; galvoje auglys tūris = 1708 ± 82 mm 3 ) ksenoimplantai. Reikšmingas padidėjimas (50,3%) vidutinis naviko tūrio rastas implantuoti su HGC-sh audiniuose, gyvūnų (n = 6; reiškia naviko tūrį = 2412 ± 75 mm ilgio 3), palyginti su implantuoti su HGC-EV audiniuose, gyvūnų ( p. < 0,05, 5 pav)}

Jei įvertinti SPARC, VEGF, MMP-7 posakiai in vivo
, ksenografiniuose skyriai buvo tamsintas su monokloniniai antikūnai prieš žmogaus SPARC, VEGF ar MMP-7 , 5A skaičius rodo, kad BGC-SP navikai išreikšti daugiau SPARC nei BGC-P, BGC-EV navikų, o kartu VEGF, MMP-7 išraiškos sumažėjo (p < 0,05, 5A pav.) Profiliai iš HGC-SH navikų išreikšti mažiau SPARC nei HGC-p, HGC-EV navikai, o kartu VEGF, MMP-7 išraiškos padidėjo (p < 0,05, 5A pav). CD31 yra naudojama pirmiausiai siekiant įrodyti kraujagyslių endotelio ląstelių histologinių audinių pjūvių, kuris gali padėti įvertinti naviko angiogenezę laipsnį buvimą. Siekiant įvertinti, ar keisti "SPARC išraiška tarpininkaujant su kraujagyslių tankis (MVD), mes analizuojami angiogenezę audiniuose, pagal histologinę analizę CD-31. Nebuvo didelio skirtumo MVD tarp BGC-P (12,5 ± 2,3 mikrokraujagyslės /0,145 mm ^{2), BGC-EV (11,5 ± 3,4 Mikrokraujagysles /0,145 mm 2) ksenoimplantai. VRM sumažėjo 54,8% visų BGC-SP (5,2 ± 2,1 Mikrokraujagysles už /mm 2) navikai palyginti su BGC-EV navikų (p < 0,05, 5 pav.) Nebuvo didelio skirtumo MVD tarp HGC-P (6.4 ± 2.1 mikrokraujagyslės /0,145 mm 2), HGC-eV (6,9 ± 1,8 Mikrokraujagysles /0,145 mm 2) ksenoimplantai. VRM buvo padidėjusi 51,7% visų HGC-sh (10,5 ± 1,5 mikrokraujagyslės /0,145 mm 2) navikai palyginti su HGC-EV navikų (p < 0,05, 5 paveikslas)}

Diskusijos
SPARC yra audinių-specifinio baltymo, kuris paveikia daugelio langelių procesus, įskaitant proliferaciją, invazija, bei angiogenezę įvairiai įvairių tipų audinių. Pavyzdžiui, ankstesni tyrimai parodė, kad "SPARC skatino invaziją, o kartu slopina auglių [5] augimą [10]. Be meduloblastomos, iš SPARC raiška gali slopinti auglio angiogenezę mažinant išraišką ir sekreciją VEGF ir MMP-9 [11]. Melanomos, tačiau SPARC išraiška buvo teigiamai koreliuoja su angiogeneze [12]. Iš SPARC funkcija skrandžio vėžio ląstelių lieka neaiškus.

Norint ištirti, SPARC vaidmenį skrandžio vėžio, mes pirmą kartą išbandė SPARC išraišką septynių ląstelių linijų skrandžio vėžio. Dauguma ląstelių linijos neišreiškė, ar tik išreiškė žemo lygio SPARC. Norėdami nustatyti SPARC vaidmenį augimui ir angiogenezę skrandžio vėžio, mes sukūrėme BGC-SP klonas, kuris buvo stabiliai transfekuota SPARC kDNR vektorius, ir HGC-sh klonas, kuris buvo stabiliai transfekuota shRNR vektoriaus orientacijos SPARC iRNR. SPARC išraiška labai padidėjo BGC-SP klonas ir sumažėjo HGC-sh klonas, palyginti su atitinkamų kontrolinių klonai, kaip nustatyta Imunoblotingo ir RT-PCR analizuoja. Ląstelių proliferacija lygis buvo mažesnis BGC-SP klonas, ir buvo didesnis HGC-sh klonas nei atitinkamų kontrolinių klonų pagal MTT metodu. Mes taip pat nustatė, kad padidėjusią SPARC slopina auglio ląstelių sukeltas kapiliarų formavimąsi HUVECs in vitro parsisiųsti ir angiogenezę nugaros lango tyrimo vivo
. Kita vertus, žemyn reguliavimas SPARC pagal iRNR trukdžių skatinamas kapiliarų formavimas in vitro parsisiųsti ir angiogenezę vivo
.

Kraujo laivai yra būtini siekiant užtikrinti maistinių medžiagų į audinius , Todėl neovaskuliarizacija yra būtinas kietųjų auglių vystymuisi. Ankstesni tyrimai parodė, kad "SPARC vaidina svarbų vaidmenį angiogenezę [7]. Mūsų rezultatai parodė, kad padidėjusią SPARC slopina angiogenezę in vitro parsisiųsti ir vivo
kartu su MMP-7, VEGF ir fosforilinto ERK1 /2 sumažėjimo, o žemyn reguliavimas SPARC skatinamas angiogenezę in vitro parsisiųsti ir vivo
kartu su MMP-7, VEGF ir fosforilinto ERK1 padidėjimas /2.

Mes taip pat įgyvendinti mokslinius tyrimus ir ištirti vaidmenį VEGF ir MMP-7 "SPARC sąlygojamą angiogeneziniu moduliavimą. Kai rekombinantinis žmogaus SPARC baltymas buvo įtraukta į sąlygoja laikmenoje HGC-sh klonas atkurti SPARC koncentracija, tai lėmė vidutinio nepakeitė kapiliarų formavimąsi HUVECs in vitro
tyrimas lyginant su kapiliariniu formavimo HUVECs inkubuojami būklė vidutinio nesant egzogeninės rhSPARC. tada mes naudojome MMP-7-shRNR down reguliuoti MMP-7 išraišką HGC-sh klonas, ir /ar anti-VEGF antikūnas neutralizuoti VEGF apdorotas laikmenoje HGC-sh klonas. Kapiliarinis formavimas HUVECs buvo žymiai slopinamas, kai jie inkubuojami sąlygoja žiniasklaidos su mažesne MMP-7 ir /arba užblokuotas VEGF. Šie eksperimentai rodo, kad "SPARC žemyn reguliavimo nepakanka vien tik už neovaskuliarizacija indukcijos, ir kitus veiksnius, turi būti įtrauktas į šį procesą.

VEGF vaidina svarbų vaidmenį angiogenezę, ir kai tai būtina dėl endotelio ląstelių išlikimo [8]. Be glioma, SPARC slopina naviko augimą pakeisdamas savo mikroaplinką ir slopina jo angiogenezę per VEGF saviraiškos ir sekrecijos slopinimo [5]. Čia gali būti neigiamas ryšys tarp SPARC ir VEGF išraiškos, ty daugiau SPARC, tuo mažiau VEGF arba , atvirkščiai
[13], [14].

MMP-7 yra pajėgi žeminantis pamatinės membranos ar jungiamojo audinio aplink laivams. Ji taip pat stimuliuoja DNR sintezę išaugintų kraujagyslių endotelio ląstelių, ir sužadinantis angiogenezę ne toje vietoje, kur gaubtinės žarnos vėžio ląstelės buvo implantuoti į pelės modelį [15]. VEGF ir kitų angiogenezę veiksniai veikia daugiausia per MAPK signalizacijos būdus, kurie, kaip manoma, yra svarbios perdavimo kelių dalyvaujantys neovaskuliarizacija procesų [8] navikų. Mūsų Neseniai atliktas tyrimas parodė, kad MMP-7 išraiška buvo moduliuojama per iš MAPK signalizacijos būdus [16] aktyvacijos. Keli tyrimai taip pat parodė, kad "SPARC neigiamai moduliuojama su MAPK kelius [17] aktyvacijos. Todėl, SPARC išraiška gali pakeisti angiogenezds pusiausvyrą navikų žemyn, reglamentuojančius iš neovaskuliarizacija skatinti veiksnių.

Jei ištirti SPARC funkciją skrandžio vėžio augimo reglamento vivo
, BGC-SP ir HGC-sh ląstelių klonai buvo palyginti su jų valdymo klonai už jų gebėjimą suformuoti navikus po oda modelį. SPARC raiška žymiai sumažino xenografted naviko dydį riboto MVD, žemyn reguliavimo SPARC pagal RNR trukdžių skatino xenografted naviko augimą su padidėjusiu MVD. Todėl, skrandžio vėžio audiniuose,, SPARC išraiška neigiamai koreliuoja su angiogenezę. Ankstesni tyrimai parodė, kad "SPARC prisidėjo prie navikų susidarymo reguliavimas, nors jo vaidmuo atrodė specifinis ląstelių tipo. Be kepenų vėžio ląstelių linijos audiniuose,, SPARC raiška žymiai vėliau auglio susidarymą, sumažino naviko dydį ir sumažėjo MVD, palyginti su kontrolės audiniuose, [18]. Be gaubtinės žarnos vėžio audiniuose, SPARC išraiška buvo neigiamai koreliuoja su VEGF saviraiškos ir MVD [19]. Be medulloblastoma ląsteles, SPARC raiškos slopina angiogenezę, vedantį į naviko augimą [11] sumažėjimą. Žmogaus mikrovaskulinių endotelio ląstelių, SPARC slopina DNR sintezę in vitro
[6]. Be neuroblastoma audiniuose,, SPARC peptidai slopina angiogenezę ir naviko augimą in vivo
[20]. Šie rezultatai patvirtino SPARC kaip naviko angiogenezę inhibitorių vivo
.

"SPARC išreiškia normaliomis skrandžio epitelinių ląstelių, skrandžio vėžio ląsteles, o stromos ląstelėse aplinkinių skrandžio vėžiu žemesniu lygmeniu [21 ]. Imunohistocheminis tyrimas parodė, kad "SPARC daugiausia išreikštas stromos ląstelėse aplinkinių auglį [22]. Šie neatitikimai negali būti išsamiai paaiškinta. SPARC išraiška gali priklausyti nuo histologinio tipo naviko arba atvirkščiai
. Naujausi imunohistocheminis tyrimas nustatė, kad "SPARC išraiška buvo neigiamai koreliuoja su VEGF ir MVD raiškos skrandžio vėžio audiniuose, SPARC išraiška sumažėjo skrandžio vėžio aukštesnio lygio piktybinių navikų [23].

Apibendrinant, augimo slopinimo skrandžio vėžio SPARC atrodo tarpininkaujant per savo slopinimo poveikį MMP-7 ir VEGF posakių, kurie, savo ruožtu, gali slopinti kraujagyslių infiltraciją į navikų. Galime daryti išvadą, kad žemyn reguliavimas SPARC gali susieti su skrandžio vėžio eigą ir žvalgyba skirta reguliuoti SPARC išraiška gali tapti prasmingu metodas pagerinti skrandžio vėžiui gydyti.

Medžiagos ir metodai

Antikūnai ir reagentai

Antikūnai prieš SPARC (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, JAV) (p) SAPK /JNK (p) ERK1 /2, (p), p-38, MMP-7 (Mobilusis signalizacijos technologija, Danvers, MA, JAV), VEGF ir CD31 (ABcam, Cambridge, MA, JAV) buvo naudojami Imunoblotingo ir imunohistocheminiu. RhSPARC buvo pateikta R & D (Minneapolis, MN, JAV). Atvirkštinės transkripcijos-PGR rinkinys buvo tiekiama PROMEGA (Madison, WI, JAV). MMP-7-shRNR (KH00809P, SuperArray biologijos Corp Frederick, MD, JAV) buvo naudojamas down-regulation MMP-7 ląstelių klonų. β-kazeino (C-6905, Sigma-Aldrich Corporation Natick, MA, JAV) buvo naudojamas beta kazeinas zymography. Visi kiti reagentai buvo analitinio reitingui arba geresnis.

Mobilusis Kultūra

Žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas, AGS, MKN-45, NVI-N87, BGC823, MGC803, HGC27, SGC7901 buvo gauti iš Vėžys institutas Kinijos mokslų akademijos medicinos mokslų. Visos ląstelės buvo auginamos RPMI 1640 terpėje, papildytoje 10% vaisiaus galvijų serumo (FBS). BGC-eV (perkeltų su tuščiu vektorių), BGC-SP (ekspresija SPARC kDNR), HGC-eV (išreikšti tuščias vektorių) ir HGC-SH (išreikšti SPARC shRNR) buvo auginami visiškai RPMI 1640 su G418 (50 mikrogramai /ml) , Visos ląstelės buvo prižiūrimi monomolekulinių sluoksnių kultūrų 37 ° C drėkinamame ore su 5% CO _2.

steigimas BGC-SP, HGC-sh klonų ir HGC-SH-MMP7-sh klonai

"Maždaug 150.000 BGC-823 ląstelės buvo padengtas už gerai šešių pat plokštelėje RPMI 1640 su 10% FBS ir leidžiama pridėti naktį. Ekvimoliarinis kiekiai pcDNA3.1 su pilno ilgio "SPARC kDNR vektoriumi ar tuščią vektoriaus (Invitrogen, San Diego, CA, JAV) buvo inkubuojami su Lipofectamine-2000 transfekcijq reagentas (Invitrogen, San Diego, CA, JAV). Patvirtinta SureSilencing žmogaus SPARC shRNR ir tuščias kontrolė vektorius buvo gauti iš SuperArray biologijos mokslų Corp (Frederick, MD, JAV). HGC-27 ląstelių buvo pernešta, kaip aprašyta anksčiau [24]. Trumpai, ląstelės buvo transfekuota stabiliai naudojant lipofectamine. Transfekuoti ląstelės buvo pasirinktas su G418 (100 mikrogramų /ml BGC-SP ir HGC-sh klonų) 14 dienų iki atskirų klonų atskirai. HGC-SH-MMP7-sh variantai buvo įsteigta kaip aprašyta pirmiau, HGC-sh klonas ląstelės buvo pernešta su MMP-7-shRNR (KH00809P, SuperArray biologijos Corp. Frederick, MD, JAV), naudojant lipofectamine. Tada, transfekuotos ląstelės buvo atrinkti puromicino (1 g /ml) 10 dienų.

ląstelių proliferacijos Analizės

ląstelių proliferacija buvo nustatomas pagal 3- (4,5-dimetiltiazol-2- il) -2,5-diphenyltetrazolium bromidas (MTT) Analizės, kaip aprašyta anksčiau [24]. Trumpai, 500 ląstelių buvo auginamos duobutei 96-duobučių lėkštelėse ir inkubuojami 8 dienų, ir tada, MTT (R & D, Mineapolis, MN, JAV) buvo įtraukta į ląsteles. Absorbcijos vertės 550 nm buvo matuojamas mikroplokštelės skaitytuvą. Rezultatai buvo parodyta, kaip tai absorbcija esant 550 nm bangos ilgiui ir priemones (± SN) egzemplioriais nustatymų iš šešių atskirų eksperimentų.

Imunoblotingo analizė

Iš viso ląstelių fragmentai buvo parengta ir analizuojami Imunoblotingo kaip buvo aprašyta anksčiau [24]. Trumpai tariant, antikūnų SPARC, MMP-7, ir VEGF (1:1000 skiedimo) buvo naudojamas siekiant aptikti SPARC, MMP-7 ir VEGF, atitinkamai, o antikūnai (P-) SAPK /JNK (P-) ERK1 /2 ir (p), p-38 (1:800 praskiedimas) buvo naudojamas siekiant aptikti aktyvavimą MAPK signalinio kelio. Rasta antikūnai buvo ryškinamos naudojant ECL (PROMEGA, Madison, WI, JAV) ant "Kodak Vaizdo station 4000 mm Pro sistemos (Kodak, Rochester, NY, JAV). Iš juostų tankis buvo įvertintas densitometric analizę, naudojant Image Tool (versija 3.0) sistema.

AT-PGR ir kiekybinė Realaus laiko PGR

Viso RNR buvo išskirta iš stabiliai perkeltų vėžinių ląstelių naudojant Trizol reagentą (Invitrogen, San Diego, CA, JAV) ir gydomi 45 min 37 ° C su RQ1 DNaze (PROMEGA, Madison, WI, JAV). RNR buvo atvirkštinis transkripcija naudojant AMV atvirkštinės transkriptazės (A3500, PROMEGA, Madison, WI, JAV). Kiekybinis realaus laiko PGR buvo atliekama ABI Prism7300 Sequence Detection System (Taikomosios Biosystems, Beverly, MA, JAV), naudojant GoTaq qPCR magistras Mix A6001 rinkinį (Promega, Madison, WI, JAV). Pradmenys naudojami kiekybiniam realiu laiku PGR buvo taip: MMP-7, 5'-GGAGATGCTCACTTCGATGA-3 '(pojūtis) ir 5'-ATACCCAAAGAATGGCCAAG-3' (Priešprasminis); ir VEGF, 5'-AGGAGGAGGGCAGAATCATCA-3 '(pojūtis) ir 5'-CTCGATTGGATGGCAGTAGCT-3' (Priešprasminis). Pradmenys naudojamas PGR buvo taip: SPARC, 5'-CTCGAGATGAGGGCCTGGATCTTC-3 '(pojūtis) ir 5'-GGATCCCGGATCACAAGATCCTTGTCG-3' (Priešprasminis); ir gliceraldehido-3-fosfato dehidrogenazės (GAPDH), 5'-GGAGTCCACTGGCGTCTTC-3 '(pojūtis) ir 5'-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTG-3' (Priešprasminis).

β-kazeino Zymography

funkcinis aktyvumas MMP-7 buvo įvertintas β-kazeino zymography 10% poliakrilamido geliai įterptųjų su 1 mg /ml beta-kazeino. buvo elektroforezė vienodą kiekį serume be sąlygoja žiniasklaidos nuo auginamų 24 valandas ląstelėse. Po to, kai elektroforezės geliai buvo išplautos 2,5% Triton X-100 vieną valandą, pašalinti SDS. tada geliai buvo inkubuojamos 18 valandas 37 ° C temperatūroje 50 mM Tris /HCl, kurių sudėtyje yra 10 mM CaCl _{2 ir 0,02% NaN 3, nudažomi su coomassie briliantinis mėlynasis ir tada destained. Proteolitiniai veikla latentinė MMP-7 ir aktyvuota MMP-7 buvo matyti, kaip juostų molekulinių masių 28 19 kDa, atitinkamai.}

kondicionieriai Žiniasklaida kolekcija eksperimentavimo

Iš viso 2 × 10 ^{5 ląstelės HGC-P, BGC-P arba jų atitinkamų stabiliai perkeltų klonų buvo sėklomis ir inkubuojami visiškai RPMI 1640 in 6-bei kamerinių skaidres ir leido augti 24 val. Vėliau kondicionieriumi žiniasklaida buvo surinkti, paženklinti ir laikomi -80 ° C naudoti ateityje.}

endotelio ląstelių Kapiliarinis panašūs vaizdeliai formavimas Analizės

Jei išnagrinėti SPARC poveikį in vitro
angiogenezę, kapiliarinis vamzdelis formavimas tyrimas buvo atliktas. Siame bandyme, Matrigel buvo pipete į iš anksto atšaldyti 96-duobučių lėkštelėse (75 mikrol Matrigel duobutei) ir polimerizuoti 30 min 37 ° C temperatūroje. Norėdami nustatyti, ar pasikeitė SPARC išraiška būtų reguliuoti angiogenezę, HUVECs (5000 ląstelių viename šulinio) buvo inkubuojami 100 įxL sąlygotų žiniasklaidos surinktų iš skirtingų rūšių ląstelėmis. Po 36 h inkubacijos, vamzdiniai struktūros buvo fotografuotas. Kiekvienas tyrimas būklė buvo įvertinta keturiais egzemplioriais nustatymų iš trijų atskirų eksperimentų. Vaizdai buvo užfiksuoti naudojant patranka Power Shot A640 fotoaparatą Olympus apversto mikroskopu su 100 × priartinimas; vamzdis ilgis buvo įvertintas naudojant IPP (versija 6.0, Žiniasklaida Kibernetika, Silver Spring, MD).

Nugaros odos raukšlės rūmai Modelis

tyrimai buvo atlikti pagal protokolą pagal patvirtintą gyvūnų priežiūros ir naudojimo komitetas Pekino universitete (etikos taikymas patvirtinimo numeris Nr J201155). in vivo
procedūros buvo laikomasi vadove rekomendacijas dėl priežiūros ir naudojimo laboratorinių gyvūnų iš Nacionalinių sveikatos institutų. Athymic nude peles (6 savaičių amžiaus, moterys, 26-28 g, n = 3 kiekvienai grupei) buvo veisiami ir palaikoma per gemalų aplinkoje. Implantacijos metodas buvo aprašyta anksčiau [11]. Nugaros oro SAC buvo pateiktas pele įpurškiant 10 ml oro oda po gyvūnas buvo anestezuoti visiškai. Difuzijos kameros (MILLIPORE, Bedford, MA, JAV) buvo parengta derinant 0,45 mm MILLIPORE membranas ant abiejų iš "O" žiedas su cemento ratlankio pusių. BGC-P BGC-EV ir BGC-SP; HGC-P HGC-EV arba HGC-sh ląstelės (1 × 10 ^{6) sustabdytas PBS buvo švirkščiamas į kamerą. A 2 cm ilgio pjūvis buvo priimti horizontaliai išilgai nugaros oro maišelį krašto, ir kameros buvo dedamas po oda. Pelės buvo paaukotos 10 dienų. Gyvūnai buvo kruopščiai skaldytos aplink implantuoti rūmams. Odos raukšlėse, apimantys kameras buvo fotografuotas pagal matomą šviesą. buvo skaičiuojamas kraujagyslių numeris.}

ksenografiniuose Modeliai ir imunohistocheminis

athymic nude pelėms buvo randomizuoti į skirtingas grupes (N = 6 kiekvienai grupei). Pelės buvo pasėta po oda apatinėje galinėje sparno su žmogaus BGC-P, BGC-EV, BGC-SP arba HGC-EP HGC-EV, HGC-sh ląstelės (2 × 10 ^{6 ląstelės per pele). Naviko augimo buvo stebimas ne, inokuliacijos vietoje apčiuopiant.}

• PLoS ONE: demaskuojant molekulinio mechanizmo skrandžio vėžio Marker aneksino A4 Vėžys ląstelių proliferaciją Naudojant Exon masyvai
• PLoS ONE: Funkcinis Pst /RsaI polimorfizmas į 2E1 yra susijusi su plėtros progresavimą ir menkas rezultatas skrandžio vėžio