PLoS ONE: proteina secreta acido e ricco di cisteina (SPARC) Sopprime Angiogenesi da down-regolazione dell'espressione di VEGF e MMP-7 nel cancro gastrico

Astratto

Sfondo

proteina secreta acido e ricco di cisteina (SPARC) è una glicoproteina che funziona per inibire l'angiogenesi, la proliferazione, e l'invasione in diversi tipi di cancro. La capacità di SPARC di modulare neovascolarizzazione si crede di essere mediato in parte dalla sua capacità di modulare l'espressione del fattore di crescita endoteliale vascolare (VEGF) e metalloproteinasi della matrice (MMP). In questo studio, abbiamo voluto determinare l'effetto di espressione SPARC in cellule di cancro gastrico sulla proliferazione e l'angiogenesi in vitro
e in vivo
.

Metodo

Abbiamo valutato l'espressione di SPARC in sette linee di cellule di cancro gastrico umano. Poi abbiamo stabilito un SPARC stabilmente transfettate sovraespresso linea cellulare (BGC-SP) e un knock-down linea cellulare trasfettata stabilmente SPARC (HGC-sh). L'effetto di SPARC sovraespressione e SPARC silenziamento è stata studiata esaminando formazione capillare di HUVECs in vitro
e un modello da camera della piega cutanea dorsale in vivo
. Quantitativa real-time PCR e Western blotting sono state eseguite per rilevare se le espressioni di VEGF e MMP-7 sono stati modulati dall'espressione SPARC. Per determinare ulteriormente l'effetto di espressione SPARC su angiogenesi in vivo
, modelli di xenotrapianto sono stati stabiliti e la densità dei microvasi (MVD) di diversi cloni sono stati rilevati mediante immunoistochimica.

Risultati

endogena SPARC sovraespressione inibito l'espressione di VEGF e MMP-7, così come l'angiogenesi indotta da cellule BGC-SP. Corrispondentemente, SPARC silenziamento aumentato l'espressione di VEGF e MMP-7, così come l'angiogenesi indotta da cellule HGC-sh. angiogenesi Elevato indotta da SPARC tacere nelle cellule HGC-SH è stata diminuita quando VEGF è stato neutralizzato dagli anticorpi, e MMP-7 è stato abbattuto in vitro
.

Conclusione

SPARC sopprime l'angiogenesi del cancro gastrico da down-regolazione dell'espressione di VEGF e MMP-7

Visto:. Zhang JL, Chen GW, Liu YC, Wang PY, Wang X, Wan YL, et al. (2012) proteina secreta acido e ricco di cisteina (SPARC) Sopprime Angiogenesi da down-regolazione dell'espressione di VEGF e MMP-7 nel cancro gastrico. PLoS ONE 7 (9): e44618. doi: 10.1371 /journal.pone.0044618

Editor: Rajesh Mohanraj, UAE University, Emirati Arabi Uniti

Ricevuto: 9 giugno 2012; Accettato: 6 agosto 2012; Pubblicato: 5 settembre 2012

Copyright: © Zhang et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Questo lavoro è stato finanziato dalla National Science Foundation naturale della Cina (n ° 30.901.417 /H1617). http://www.nsfc.gov.cn/Portal0/default152.htm. I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

Tra decessi correlati al cancro, cancro gastrico è al secondo posto a livello mondiale dopo il cancro del polmone; quasi due terzi dei casi si verificano nei paesi in via di sviluppo, tra cui il 42% dalla Cina [1]. L'angiogenesi è un processo critico di cancro gastrico; di conseguenza, le molecole di regolamentazione e di segnalazione che modulano l'angiogenesi stanno diventando il fulcro della presente ricerca. Angiogenesi non è un processo attivo di per sé; è controllata da alcuni fattori angiogenici e alcuni inibitori dell'angiogenesi.

proteina secreta acido e ricco di cisteina (SPARC), noto anche come osteonectin o BM-40, è una glicoproteina secreta poliedrico che si esprime molti diversi tipi di cellule ed è associata con la formazione di osso, fibrosi e la riparazione dei tessuti.

recenti studi dimostrano che SPARC modula la proliferazione, apoptosi, invasione e l'angiogenesi in differenti tipi di cellule tumorali, tuttavia, il ruolo di SPARC in tumorigenesi è complicato e sembra essere tipo cellulare specifico per le sue diverse funzioni in un dato micro-ambiente [2]. funzioni SPARC come un soppressore del tumore al seno in, neuroblastoma, del pancreas, dell'ovaio e del polmone [3]. Il cancro ovarico nei topi SPARC-null è cresciuta significativamente più grande rispetto a quella in animali wild-type con livelli aumentata di fattore di crescita endoteliale (VEGF) e metalloproteinasi della matrice (MMP) [4]. Sopprimendo vascolarizzazione del tumore attraverso la soppressione di espressione di VEGF e la secrezione, SPARC inibita glioma crescita [5]. SPARC si lega al VEGF, inibendo quindi VEGFR fosforilazione, mitogeno-activated protein-chinasi attivazione (MAPK) e la sintesi del DNA VEGF-indotta [6]. Tuttavia, il ruolo di SPARC nell'angiogenesi è anche tipo cellulare specifico, che altera eventi di trasduzione del segnale in risposta ad ambienti cellulari unici [7].

VEGF stimola l'angiogenesi, ed è la più importante proteina segnale prodotto dalle cellule [8]. MMP svolgono un ruolo importante nello sviluppo del tumore, non solo nella degradazione della matrice extracellulare, ma anche nella regolazione dell'angiogenesi. MMP-7, che è il peso molecolare più piccolo di tutti i membri della famiglia MMP, ha dimostrato di accelerare la proliferazione di cellule umane della vena ombelicale endoteliali (HUVEC) in modo dose-dipendente in vitro
[9].

La funzione principale di SPARC nell'angiogenesi di linee di cellule di cancro gastrico rimane poco chiaro. Pertanto, in questo studio, abbiamo ipotizzato che SPARC potrebbe modulare la proliferazione e l'angiogenesi regolando VEGF e MMP-7 espressioni in cellule di cancro gastrico. Per verificare queste ipotesi, abbiamo testato espressione di SPARC in sette linee di cellule di cancro gastrico. Poi, per valutare l'effetto di SPARC alterata in cellule di cancro gastrico, abbiamo stabilito un clone BGC-SP, che overexpressed SPARC e un clone HGC-sh in cui il SPARC endogena è stato abbattuto.

Risultati

L'espressione di SPARC in cellule in coltura cancro gastrico

Abbiamo valutato l'espressione di SPARC in diverse linee di cellule di cancro gastrico umano. Western Blotting mostrato che il SPARC era undectable in linee cellulari AGS, MKN45, NSC-N87 e BGC-823, linea cellulare tuttavia SGC-7901 ha espresso basso livello di SPARC e HGC-27, MGC-803 linee cellulari espressi alto livello di SPARC ( Figura 1A).

sovraespressione e l'inibizione di endogena SPARC in Gastric Cancer Cell Lines

Western blotting hanno mostrato che il 43 kDa banda corrispondente alla proteina SPARC è risultato significativamente aumentato nel BGC-SP (cellule BGC cellule che esprimono SPARC cDNA) rispetto alle cellule parentali (BGC-P) e di controllo trasfettate con il vettore vuoto (BGC-EV) (P < 0,05); SPARC è stata inibita da quasi due terzi nelle cellule HGC-sh (cellule che esprimono HGC SPARC-shRNA) rispetto alle cellule HGC-P e HGC-EV (p < 0,05, Figura 1B). RT-PCR ha indicato che l'espressione SPARC mRNA nelle cellule BGC-SP è stata aumentata rispetto a BGC-P e le cellule BGC-EV (P < 0,05); l'espressione SPARC mRNA in HGC-sh è diminuito di quasi il 80% rispetto al HGC-P e le cellule HGC-EV (P < 0,05, Figura 1B).

SPARC sovraespressione inibisce la proliferazione di cancro gastrico linee cellulari

Per determinare se l'espressione alterata SPARC influenzato la proliferazione di linee cellulari di cancro gastrico, la crescita delle cellule trasfettate sono stati confrontati con quelli dei controlli vettore parentale e vuoti. I dati mostrano che la crescita delle cellule BGC-SP è stata inibita in confronto con cellule BGC-P e BGC-EV dopo 8 giorni di coltura (P < 0,05); la crescita delle cellule HGC-SH è stato leggermente aumentato rispetto al HGC-P e le cellule HGC-EV (P < 0,05, Figura 1C).

SPARC sovraespressione in gastrico Lines Cancer Cell Diminuisce angiogenesi in vitro
e in vivo

Per comprendere l'effetto di espressione alterata SPARC su angiogenesi nelle linee di cellule di cancro gastrico, HUVECs sono state incubate nei mezzi condizionati. Il surnatante BGC-SP indotta HUVECs di differenziarsi in strutture capillari, come entro 36 ore (2564,5 ± 553,1 micron, P < 0,05), in misura minore rispetto al surnatante dalle cellule BGC-EV (5002,4 ± 665,7 micron) e le cellule BGC-P (5417,3 ± 784,25 micron, Figura 2A). Il surnatante HGC-sh indotta HUVECs di differenziarsi in strutture capillari, come entro 36 ore (7024,9 ± 923,1 micron, P < 0,05), in misura più forte del surnatante dalle cellule HGC-EV (4456,2 ± 554,2 micron) e le cellule HGC-P (4023,4 ± 665,2 micron, Figura 2A). Quantificazione della lunghezza media tubo indicato che la lunghezza del tubo di HUVEC in mezzi condizionati da BGC-SP è diminuita di circa il 52,7% rispetto a cellule di controllo; lunghezza del tubo di HUVECs nei mezzi condizionati da cloni HGC-SH è stato aumentato 74,6% rispetto a cellule di controllo (Figura 2A)
.

Il modello di finestra dorsale ha dimostrato che le cellule BGC-SP ha avuto una diminuzione del 40,4% in al tumore microvasi indotta rispetto a cellule di controllo (P < 0,05). cellule HGC-sh nella camera dorsale della piega cutanea comportato un aumento 73,2% in microvasi tumorali indotta, con un maggior numero di piccoli punti emorragici rispetto a cellule di controllo (P < 0,05 Figura 2B). Questi risultati hanno mostrato chiaramente che SPARC sovraespressione nel carcinoma gastrico ha inibito l'angiogenesi in vitro
e in vivo
.

Il MAPKs Segnalazione Pathway ed espressione di VEGF e MMP-7 sono inibiti da SPARC iperespressione

Per determinare l'effetto di SPARC sovraespressione su MMP-7 e VEGF, quantitativa real-time PCR e saggi di Western blotting sono state eseguite. I risultati hanno mostrato che MMP-7 e l'espressione di VEGF è stato regolato negativamente dall'espressione SPARC. Nelle cellule BGC-SP, livelli di MMP-7 mRNA, MMP-7 proteine, VEGF mRNA e proteine ​​VEGF sono stati inibiti dal 87,2%, 68,9%, 48,4% e 58,6%, rispettivamente, in confronto con cellule vettore trasfettate vuote. Nelle cellule HGC-sh, il livello di mRNA MMP-7 è aumentata 11,6 volte, il livello della proteina MMP-7 è aumentata di 8,1 volte, il livello di VEGF mRNA aumentato 8.8 volte, e il livello della proteina VEGF è aumentato 3,2 volte rispetto al vuoto cellule vettore (Figura 3A, B). Per determinare se il percorso di segnalazione MAPK era regolata da SPARC, SAPK /JNK, ERK1 /2 e P-38 livelli sono stati valutati mediante western blotting. I risultati hanno mostrato che i livelli di p-ERK1 /2 erano significativamente diminuita nelle cellule BGC-SP ed elevato nelle cellule HGC-SH in confronto con le loro cellule di controllo (Figura 3C).

knock-down di SPARC espressione in HGC-27 Cells Promuove angiogenesi tramite VEGF up-regolati e MMP-7 Expression

per confermare che gli effetti pro-angiogenici osservati con ridotta espressione SPARC sono dovuti ad un aumento dell'espressione di MMP-7 e VEGF e non a livelli di SPARC sé, HUVEC sono stati incubati in mezzi condizionati da cellule raccolte HGC-SH con esogeno aggiunto ricombinante umana SPARC (rhSPARC, 0,3 mg /ml). I nostri dati indicano che l'aggiunta SPARC esogeno non ha inibito strutture capillari-come HUVECs rispetto HGC-sh (figura 4), a differenza della risposta anti-angiogenica visto con espressione endogena di SPARC in BGC823 cellule (Figura 2).

per caratterizzare ulteriormente il ruolo di VEGF e MMP-7 nella modulazione dell'angiogenesi SPARC-mediata, MMP-7-shRNA e 1 mg ml anticorpi neutralizzanti /VEGF (Chemicon, Temacula, CA, USA) sono stati utilizzati per i cloni HGC-sh a antagonizzare le funzioni di MMP-7 e VEGF.

Abbiamo esaminato la capacità di MMP-7 espressione in cellule HGC-sh per modulare l'angiogenesi in vitro
da stabile trasfezione MMP-7-shRNA in cellule HGC-Sh. Figura 4A indica che l'espressione di MMP-7 in cellule MMP7-sh HGC-sh + era down-regolato da esprimono stabilmente MMP-7-sh-RNA ad un livello paragonabile a quello di HGC-P e cellule HGC-EV. Per chiarire il ruolo di MMP-7 in knock-down promozione SPARC-mediata di angiogenesi delle cellule indotta da tumore, abbiamo effettuato analisi capillare formazione con i media condizionati delle cellule HGC-sh e HGC-sh + cellule MMP7-sh. Come mostrato in Figura 4B, i risultati indicano che la diminuzione MMP-7 espressione in cellule HGC-SH + MMP7-sh ha portato ad una diminuzione significativa formazione capillare HUVECs in vitro
(HGC-sh + MMP7-sh vs
HGC-sh, P. < 0,05)

Per determinare la funzione di espressione di VEGF elevata indotta da SPARC silenziamento, VEGF nei media condizionata di HGC-sh e HGC-sh + MMP7-sh cellule è stata neutralizzata da anticorpi VEGF (1 mg /ml). I risultati hanno mostrato che la formazione capillare HUVECs era diminuita in modo significativo nel surnatante HGC-sh contenente il VEGF anticorpi neutralizzanti rispetto al surnatante da sole cellule HGC-sh (HGC-sh + anti-VEGF vs
HGC-sh, P < 0.05 Figura 4B). formazione capillare di HUVECs era quasi completamente inibita quando coltivate nei mezzi condizionati di HGC-sh + cellule MMP7-sh più aggiunto di anticorpi neutralizzanti il ​​VEGF ( vs
HGC-sh, P < 0.05 figura 4B).

mezzi condizionati privo di siero raccolti da HGC-P, HGC-EV, HGC-sh con o senza rhSPARC (0,3 mg /ml) e le cellule HGC-sh + MMP7-sh sono state concentrate in metropolitana ultrafiltrazione (Millipore, Bedford, MA , USA) nelle medesime condizioni. Western Blotting mostrato che la concentrazione di SPARC in cellule HGC-SH con 0,3 ug /ml rhSPARC inmedium era uguale a quello del HGC-P surnatante (Figura 4A).

sovraespressione di SPARC in cellule cancro gastrico inibisce tumorigenicità in nude topi

Per valutare l'efficacia terapeutica di espressione SPARC, BGC-P, BGC-EV, le cellule BGC-SP o HGC-P, HGC-EV, le cellule HGC-SH sono stati iniettati per via sottocutanea in topi nudi. Non vi era alcuna differenza significativa di dimensioni tra BGC-P (n = 6; significare volume del tumore = 2004 ± 63 millimetri ^{3), BGC-VE (n = 6; significare volume del tumore = 1856 ± 69 millimetri 3 ) xenotrapianti. Una diminuzione significativa (39,1%) del volume del tumore media è stato trovato in animali impiantati con xenotrapianto BGC-SP (n = 6; significare volume del tumore = 1130 ± 55 millimetri 3) in confronto con gli animali impiantati con xenotrapianto BGC-EV ( P < 0,05, Figura 5). Non vi era alcuna differenza significativa di dimensioni tra HGC-P (n = 6; significare volume del tumore = 1605 ± 63 millimetri 3), HGC-VE (n = 6; significare volume del tumore = 1708 ± 82 millimetri 3 ) xenotrapianti. Un aumento significativo (50,3%) del volume del tumore media è stato trovato in animali impiantati con xenotrapianto HGC-sh (n = 6; significare volume del tumore = 2412 ± 75 mm 3) in confronto con gli animali impiantati con xenotrapianto HGC-EV ( P. < 0,05, figura 5)}

Per valutare SPARC, VEGF, MMP-7 espressioni in vivo
, sezioni di xenotrapianto sono state colorate con un anticorpo monoclonale contro SPARC umano, VEGF o MMP-7 . Figura 5A indica che i tumori BGC-SP esprimono più SPARC di BGC-P, i ​​tumori BGC-EV, mentre in concomitanza VEGF, MMP-7 espressioni sono diminuiti (P ​​< 0,05, Figura 5A). Sezioni di HGC-sh tumori esprimono meno SPARC di HGC-P, i ​​tumori HGC-EV, mentre in concomitanza VEGF, sono aumentati MMP-7 espressioni (P < 0,05, Figura 5A). CD31 viene utilizzato principalmente per dimostrare la presenza di cellule endoteliali vascolari in sezioni di tessuto istologici, che possono contribuire a valutare il grado di angiogenesi tumorale. Per valutare se l'espressione alterata SPARC mediato la densità dei microvasi (MVD), abbiamo analizzato l'angiogenesi in xenotrapianti mediante analisi istologica dei CD-31. Non vi era alcuna differenza significativa nella MVD tra BGC-P (12,5 ± 2,3 microvasi /0.145 mm ^{2), BGC-EV (11.5 ± 3.4 microvasi /0.145 mm 2) xenotrapianti. MVD era diminuita del 54,8% in BGC-SP (5.2 ± 2.1 microvasi per /mm 2) tumori rispetto a tumori BGC-EV (p < 0,05, Figura 5). Non vi era alcuna differenza significativa nella MVD tra HGC-P (6.4 ± 2.1 microvasi /0.145 mm 2), HGC-EV (6.9 ± 1.8 microvasi /0.145 mm 2) xenotrapianti. MVD è stato elevato 51,7% in HGC-sh (10.5 ± 1.5 microvasi /0.145 mm 2) tumori rispetto a tumori HGC-EV (p < 0,05, figura 5)}

Discussione
SPARC è una proteina tessuto-specifico che colpisce più processi cellulari quali la proliferazione, invasione e l'angiogenesi variabile in diversi tipi di tessuti. Per esempio, studi precedenti hanno dimostrato che SPARC promosso l'invasione mentre contemporaneamente inibire la crescita di tumori [5], [10]. In medulloblastoma, la sovraespressione di SPARC può inibire l'angiogenesi tumorale abbassando l'espressione e la secrezione del VEGF e MMP-9 [11]. Nel melanoma, tuttavia, l'espressione di SPARC è stata positivamente correlata con l'angiogenesi [12]. La funzione di SPARC in cellule di cancro gastrico è ancora chiaro.

Al fine di studiare il ruolo di SPARC nel carcinoma gastrico, in primo luogo abbiamo testato l'espressione di SPARC in sette linee di cellule di cancro gastrico. La maggior parte delle linee di cellule non hanno espresso, o espressi solo basso livello di SPARC. Per determinare il ruolo di SPARC nella crescita e l'angiogenesi del cancro gastrico, abbiamo stabilito il clone BGC-SP che è stato stabilmente trasfettate con un vettore SPARC cDNA, e il clone HGC-sh che è stato stabilmente trasfettate con un vettore shRNA mira SPARC mRNA. espressione SPARC è aumentato in modo significativo in BGC-SP clone e diminuita in HGC-sh clone in confronto con i rispettivi cloni di controllo, come determinato dal western blotting e RT-PCR analisi. tasso di proliferazione cellulare era più bassa nel BGC-SP clone, ed era più alta nei HGC-sh clone rispetto nei loro rispettivi cloni di controllo con il metodo MTT. Abbiamo anche trovato che la sovraespressione di SPARC inibito tumore a cellule indotta formazione capillare di HUVECs in vitro
e angiogenesi nel saggio finestra dorsale in vivo
. D'altra parte, down-regulation di SPARC da interferenze mRNA promosso la formazione capillare in vitro
e angiogenesi in vivo
.

I vasi sanguigni sono essenziali per fornire sostanze nutritive ai tessuti . Pertanto, neovascolarizzazione è indispensabile per lo sviluppo di tumore solido. Studi precedenti hanno dimostrato che SPARC svolge un ruolo nella angiogenesi [7]. I nostri risultati hanno dimostrato che l'iperespressione di SPARC ha inibito l'angiogenesi in vitro
e in vivo
in associazione con la diminuzione di MMP-7, VEGF e ERK1 /2 fosforilata, mentre down-regulation di SPARC promosso angiogenesi in vitro
e in vivo
in associazione con l'aumento di MMP-7, VEGF e ERK1 fosforilata /2.

Abbiamo inoltre implementato studi per indagare il ruolo di VEGF e MMP-7 nella modulazione dell'angiogenesi SPARC-mediata. Quando la proteina ricombinante umana SPARC è stato aggiunto al medium condizionato da HGC-sh clone per ripristinare la concentrazione SPARC, questo mezzo condizionato non ha cambiato la formazione capillare di HUVECs da in vitro
test rispetto alla formazione capillare di HUVECs incubati in il medium condizione senza esogeno rhSPARC. Abbiamo poi utilizzato MMP-7-shRNA di down-regolare MMP-7 espressione in HGC-sh clone, e /o anti-VEGF anticorpi per neutralizzare VEGF in mezzo condizionato da HGC-sh clone. formazione capillare di HUVECs è stata inibita significativamente quando incubati nei media condizionata inferiore MMP-7 e /VEGF o bloccato. Questi esperimenti suggeriscono che SPARC down-regolazione da solo non è sufficiente per l'induzione di neovascolarizzazione, e di altri fattori devono essere coinvolti in questo processo.

VEGF svolge un ruolo chiave nella angiogenesi, ed è necessaria per la sopravvivenza delle cellule endoteliali [8]. In glioma, SPARC ha inibito la crescita tumorale, alterandone il micro-ambiente e sopprimendo la sua angiogenesi attraverso l'inibizione dell'espressione di VEGF e la secrezione [5]. Ci può essere una relazione negativa tra SPARC e le espressioni di VEGF, vale a dire, più SPARC, meno VEGF o viceversa
[13], [14].

MMP-7 è in grado di degradanti membrana basale o tessuto connettivo intorno ai vasi. Inoltre stimola la sintesi del DNA nelle cellule endoteliali vascolari in coltura, e induce l'angiogenesi nel sito in cui le cellule tumorali del colon sono stati impiantati in un modello murino [15]. VEGF e altri fattori angiogenici funzionano principalmente attraverso segnalazione MAPK pathways, che si ritiene siano importanti vie di trasduzione coinvolte nei processi neovascolarizzazione nei tumori [8]. Il nostro recente studio ha mostrato che MMP-7 espressione è stata modulata attraverso l'attivazione di vie di segnalazione MAPK [16]. Diversi studi hanno anche dimostrato che SPARC modulata negativamente l'attivazione di vie MAPK [17]. Di conseguenza, l'espressione SPARC può alterare l'equilibrio angiogenico nei tumori da down-regolazione di una serie di neovascolarizzazione promuovere fattori.

Per studiare la funzione di SPARC nella regolazione della crescita del cancro gastrico in vivo
, BGC-SP e cloni cellulari HGC-sh sono stati confrontati con i cloni di controllo per la loro capacità di formare tumori in un modello sottocutanea. SPARC sovraespressione ha ridotto significativamente le dimensioni del tumore xenotrapiantati con MVD ridotta, down-regulation di SPARC da RNA interference promosso la crescita del tumore xenotrapiantati con maggiore MVD. Pertanto, in xenotrapianti cancro gastrico, espressione SPARC è negativamente correlata con l'angiogenesi. Studi precedenti hanno indicato che SPARC contribuito alla regolamentazione della formazione del tumore, anche se il suo ruolo sembrava essere cellula-tipo specifico. In epatocellulari xenotrapianti di linee cellulari tumorali, SPARC sovraespressione significativamente ritardato la formazione del tumore, ridurre le dimensioni del tumore, e una diminuzione MVD in confronto con xenotrapianti di controllo [18]. Nei tessuti cancro del colon, espressione SPARC era correlata negativamente con l'espressione di VEGF e MVD [19]. In cellule di medulloblastoma, SPARC sovraespressione inibito l'angiogenesi che porta alla diminuzione della crescita tumorale [11]. Nelle cellule endoteliali microvascolari umane, SPARC ha inibito la sintesi del DNA in vitro
[6]. In xenotrapianti neuroblastoma, peptidi SPARC inibito l'angiogenesi e la crescita tumorale in vivo
[20]. Questi risultati hanno confermato SPARC come un inibitore dell'angiogenesi tumorale in vivo
.

SPARC esprime in normali cellule epiteliali gastriche, cellule di cancro gastrico, e le cellule stromali che circondano il cancro gastrico ad un livello inferiore [21 ]. Uno studio ha mostrato che l'immunoistochimica SPARC espressa prevalentemente in cellule stromali che circondano il tumore [22]. Queste discrepanze non possono essere pienamente spiegate. espressione SPARC può dipendere dal tipo istologico del tumore, o viceversa
. recente studio ha trovato che l'immunoistochimica espressione SPARC è stata negativamente correlata con l'espressione di VEGF e MVD nei tessuti di cancro gastrico, e l'espressione SPARC diminuita in cancro gastrico con una maggiore grado di malignità [23].

In sintesi, l'inibizione della crescita del cancro gastrico da SPARC sembra essere mediata attraverso i suoi effetti sulla soppressione MMP-7 e VEGF espressioni, che possono a loro volta inibire microvasi infiltrazione in tumori. Concludiamo che down-regolazione di SPARC può associare con il progredire del cancro gastrico, e l'esplorazione mirava a regolare l'espressione SPARC può diventare un approccio significativo per migliorare il trattamento del cancro gastrico.

Materiali e Metodi

Anticorpi e reagenti

Anticorpi contro SPARC (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), (p) SAPK /JNK, (p) ERK1 /2, (p) p-38, MMP-7 (tecnologia di segnalazione cellulare, Danvers, MA, USA), VEGF, e CD31 (Abcam, Cambridge, MA, USA) sono stati utilizzati per Western blotting ed immunoistochimica. Il rhSPARC è stato fornito da R & D (Minneapolis, MN, Stati Uniti d'America). Reverse Kit di trascrizione-PCR è stato fornito da Promega (Madison, WI, USA). MMP-7-shRNA (KH00809P, SuperArray Bioscience Corp. Frederick, MD, USA) è stato utilizzato per la down-regulation di MMP-7 nei cloni cellulari. β-caseina (C-6905, Sigma-Aldrich Corporation, Natick, MA, USA) è stato utilizzato in zimografia β-caseina. Tutti gli altri reagenti erano di grado analitico o migliore.

Cell Culture

umani gastrici di cellule di cancro linee AGS, MKN-45, NCI-N87, BGC823, MGC803, HGC27, SGC7901 sono stati ottenuti dal Cancer Institute della Accademia Cinese delle Scienze mediche. Tutte le cellule sono state coltivate in terreno RPMI 1640 supplementato con siero fetale bovino 10% (FBS). BGC-EV (transfettate con vettore vuoto), BGC-SP (iperespressione SPARC cDNA), HGC-EV (che esprime vettore vuoto) e HGC-sh (che esprime SPARC shRNA) sono state coltivate in completo RPMI 1640 con G418 (50 mg /ml) . Tutte le cellule sono state mantenute in colture monostrato a 37 ° C in aria umidificata con 5% di CO _2.

Istituzione di BGC-SP, cloni HGC-sh e cloni HGC-sh-MMP7-sh

circa 150.000 BGC-823 cellule sono state piastrate per pozzetto in una piastra di sei bene in RPMI 1640 con il 10% FBS e ha permesso di collegare durante la notte. quantità equimolari di pcDNA3.1 con full-length cDNA SPARC vettore o il vettore vuoto (Invitrogen, San Diego, CA, USA) sono state incubate con Lipofectamine-2000 Transfection Reagent (Invitrogen, San Diego, CA, USA). Convalidato SureSilencing umana SPARC shRNA e controllo vettoriale vuoto sono stati ottenuti da SuperArray Bioscience Corp. (Frederick, MD, USA). HGC-27 cellule sono state trasfettate come precedentemente descritto [24]. Brevemente, le cellule sono state trasfettate in maniera stabile con lipofectamina. Le cellule trasfettate sono state selezionate con G418 (100 ug /ml per BGC-SP e cloni HGC-SH) per 14 giorni prima l'isolamento di singoli cloni. varianti HGC-sh-MMP7-sh sono stati stabiliti come descritto sopra, le cellule clone HGC-sh sono state trasfettate con MMP-7-shRNA (KH00809P, SuperArray Bioscience Corp. Frederick, MD, USA) utilizzando lipofectamina. Poi, le cellule trasfettate sono state selezionate da puromicina (1 mg /ml) per 10 giorni.

Cell Proliferation Assay

La proliferazione cellulare è stata determinata da un 3- (4,5-dimetiltiazol-2- il) -2,5-diphenyltetrazolium bromuro (MTT), come descritto in precedenza [24]. In breve, 500 cellule sono state coltivate per pozzetto in piastre da 96 pozzetti e incubate per 8 giorni, e poi, MTT (R & S, Minneapolis, MN, USA) è stato aggiunto alle cellule. I valori di assorbanza a 550 nm sono stati misurati con un lettore di micropiastre. I risultati sono stati mostrati come media assorbanza a 550 nm ed i mezzi (± DS) delle determinazioni quadruplicate da sei esperimenti separati.

Western blotting

lisati cellulari totali sono stati preparati ed analizzati mediante western blotting come precedentemente descritto [24]. In breve, gli anticorpi anti SPARC, MMP-7, e VEGF (1:1000 diluizione) sono stati usati per rilevare SPARC, MMP-7, e VEGF, rispettivamente, mentre gli anticorpi (p) SAPK /JNK, (p) ERK1 /2 e (p-) p-38 (1:800 diluizione) sono stati utilizzati per rilevare l'attivazione del pathway MAPK. Gli anticorpi legati sono stati visualizzati con ECL (Promega, Madison, WI, USA) su un Kodak immagine Stazione del sistema 4.000 millimetri Pro (Kodak, Rochester, NY, USA). La densità delle bande è stata quantificata mediante analisi densitometrica utilizzando lo strumento di immagine (versione 3.0) del sistema.

RT-PCR quantitativa e Real-time PCR

L'RNA totale è stato isolato dalle cellule tumorali stabilmente trasfettate usando il reagente Trizol (Invitrogen, San Diego, CA, USA) e trattati per 45 minuti a 37 ° C con RQ1 DNasi (Promega, Madison, WI, USA). RNA è stato trascrizione inversa usando AMV della trascrittasi inversa (A3500, Promega, Madison, WI, USA). Quantitativa real-time PCR è stata effettuata in un Prism7300 Sequence Detection System ABI (Applied Biosystems, Beverly, MA, USA) utilizzando un kit A6001 GoTaq qPCR Master Mix (Promega, Madison, WI, USA). Primer utilizzati per quantitativa real-time PCR erano le seguenti: MMP-7, 5'-GGAGATGCTCACTTCGATGA-3 '(senso) e 5'-ATACCCAAAGAATGGCCAAG-3' (antisenso); e VEGF, 5'-AGGAGGAGGGCAGAATCATCA-3 '(senso) e 5'-CTCGATTGGATGGCAGTAGCT-3' (antisenso). Primer utilizzati per la PCR sono stati i seguenti: SPARC, 5'-CTCGAGATGAGGGCCTGGATCTTC-3 '(senso) e 5'-GGATCCCGGATCACAAGATCCTTGTCG-3' (antisenso); e gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi (GAPDH), 5'-GGAGTCCACTGGCGTCTTC-3 '(senso) e 5'-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTG-3' (antisenso).

β-caseina zimografia

Il attività funzionale di MMP-7 è stata valutata mediante β-caseina zimografia il 10% gel di poliacrilammide incorporati con 1 mg /ml β-caseina. La stessa quantità di mezzi di comunicazione senza siero condizionata dalle cellule coltivate per 24 ore sono stati elettroforesi. Dopo l'elettroforesi, i gel sono stati lavati in 2,5% Triton X-100 per un'ora per rimuovere SDS. I gel sono state quindi incubate per 18 ore a 37 ° C in 50 mM Tris /HCl contenente 10 mM CaCl _{2 e 0,02% NaN 3, colorato con Coomassie Brilliant Blue quindi decolorato. attività proteolitica della latente MMP-7 e attivato MMP-7 sono state evidenziate come bande con masse molecolari di 28 e 19 kDa, rispettivamente.}

condizionata Collection supporti per la Sperimentazione

In totale, 2 × 10 ^{5 cellule di HGC-P, BGC-P o loro corrispondenti cloni stabilmente trasfettate sono state seminate e incubate in completo RPMI 1640 nella camera di diapositive 6 pozzetti e lasciate crescere per 24 h. Successivamente, sono stati raccolti i media condizionati, etichettati e conservati a -80 ° C per un uso futuro.}

cellule endoteliali capillare simile formazione del tubo Assay

Per esaminare l'effetto di SPARC su in vitro
angiogenesi, un saggio di formazione capillare è stata eseguita. In questo saggio, matrigel è stato pipettato in pre-raffreddate piastre a 96 pozzetti (75 microlitri matrigel per pozzetto) e polimerizzato per 30 min a 37 ° C. Per determinare se l'espressione alterata SPARC sarebbe regolare l'angiogenesi, HUVECs (5000 cellule per pozzetto) sono stati incubati in 100 ml di mezzi condizionati raccolte da diversi tipi di cellule. Dopo 36 ore di incubazione, strutture tubolari sono stati fotografati. Ogni condizione test è stata valutata in quattro copie determinazioni da tre esperimenti separati. Le immagini sono state catturate utilizzando una fotocamera A640 colpo di cannone di potenza su un microscopio invertito Olympus con un ingrandimento di 100 ×; la lunghezza del tubo è stato quantificato con IPP (versione 6.0, Media Cybernetics, Silver Spring, MD).

dorsale della piega cutanea Camera Modello

Gli studi sono stati eseguiti in conformità con un protocollo approvato dalla cura degli animali e del Comitato uso della Università di Pechino (etica approvazione della domanda numero n J201155). in vivo
procedure erano in conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health. topi atimici nudi (6 settimane di vita, di sesso femminile, 26-28 g, n = 3 per gruppo) sono stati allevati e mantenuti in un ambiente privo di germi. La tecnica di impianto è stato descritto in precedenza [11]. Un sacco aereo dorsale è stato fatto nel topo iniettando 10 ml di via sottocutanea aria dopo l'animale è stato anestetizzato completamente. camere di diffusione (Millipore, Bedford, MA, USA) sono stati preparati allineando 0.45 mm membrane Millipore su entrambi i lati del cerchio dell'anello 'O' con il cemento. BGC-P, BGC-EV e BGC-SP; HGC-P, HGC-EV o cellule HGC-sh (1 × 10 ^{6) sospeso in PBS sono stati iniettati nella camera. Una lunga incisione 2 cm è stata fatta orizzontalmente lungo il bordo della sacca d'aria dorsale, e le camere sono stati posti sotto la pelle. I topi sono stati sacrificati 10 giorni più tardi. Gli animali sono stati accuratamente scuoiati intorno alle camere impiantati. Le pieghe della pelle che copre le camere sono state fotografate in luce visibile. Il numero dei vasi sanguigni è stato contato.}

Modelli di xenotrapianto e immunoistochimica

I topi nudi atimici sono stati randomizzati a diversi gruppi (n = 6 per gruppo). I topi sono stati inoculati per via sottocutanea nel fianco posteriore inferiore con umana BGC-P, BGC-EV, BGC-SP o HGC-EP, HGC-EV, le cellule HGC-sh (2 × 10 ^{6 celle per il mouse). La crescita tumorale è stata monitorata con la palpazione al sito di inoculazione.}

• PLoS ONE: Rivelare il meccanismo molecolare del cancro gastrico Marker annessina A4 in Cancer Cell Proliferation Utilizzando Exon Arrays
• PLoS ONE: funzionale PstI /RsaI polimorfismo nel CYP2E1 è associata con lo sviluppo, la progressione e scarsi risultati di gastrico Cancer