PLoS ONE: Die Überexpression von CD151 Predicts Prognose bei Patienten mit resezierten Magen Cancer

Abstrakt

Zweck

Die tetraspanin CD151 wirkt als Förderer der Metastasierung und Invasion in verschiedenen Tumoren. Allerdings bleibt die Rolle von CD151 in menschlichen Magenkrebs (HGC) unklar.

Methoden

Zwanzig HGC Proben und abgestimmte Nicht-Tumorproben, die menschliche Magenepithelzellen (HGEC) und vier Magenkrebszellen Linien wurden verwendet CD151-Expression zu analysieren. Short Hairpin-RNA-vermittelte Herunterregulation von CD151-Expression in HGC-Zellen durchgeführt wurde, die Rolle von CD151 bei der Proliferation und Metastase /Invasion von HGC-Zellen zu untersuchen in vivo
und In-vitro-
. Das Verhältnis von CD151 mit α3 in HGC Zellen Integrin wurde durch Silencing Integrin α3, gefolgt von Co-Immunpräzipitation und Immunfluoreszenz-Färbung untersucht. Schließlich wurde der prognostische Wert von CD151 und Integrin α3 durch Immunhistochemie in Gewebe-Mikroarrays von 76 HGC Patienten ausgewertet.

Ergebnisse |

CD151 auf höheren Ebenen in HGC Geweben und HGC Zellen als in Nicht-Tumor exprimiert wurde Geweben und Zellen HGEC. Die Herunterregulierung von CD151 durch vshRNA-CD151 beeinträchtigte Metastasierung und Invasion von HGC-27-Zellen, aber nicht die Zellproliferation beeinflussen. CD151 bildete einen Komplex mit α3 in HGC Zellen Integrin. CD151-cDNA-Transfektion geretteten das metastatische Potenzial und Invasivität von HGC-27-vshCD151 Zellen, aber nicht die der HGC-27-Zellen vshintegrin α3 in vitro
. Klinisch wurde CD151 Überexpression signifikant korreliert mit hoher TNM-Stadium, die Tiefe der Invasion und positiven Lymphknoten ( p
< 0,05) und ein hohes Maß an Integrin α3 wurden mit großer Tumorgröße, hohe TNM-Stadium verbunden sind, Tiefe der Knoten Beteiligung Invasion und Lymphe ( p
< 0,05). Wichtig ist, dass die postoperative 5-Jahres-Gesamtüberlebenszeit von Patienten mit CD151 ^{niedrig und /oder Integrin α3 gering höher als bei Patienten mit CD151 Hoch- und /oder Integrin α3 hoch.}

Schlussfolgerung

CD151 positiv mit der Invasivität von HGC und CD151 oder die Kombination von CD151 und Integrin α3 ist eine neuartige Marker für die Vorhersage der Prognose von Patienten und HGC kann potentielle therapeutische Targets sein verbunden ist.

Citation: Yang YM, Zhang ZW, Liu QM, Sun YF, Yu JR, Xu WX (2013) Überexpression von CD151 Predicts Prognose bei Patienten mit resezierten Magenkrebs. PLoS ONE 8 (3): e58990. doi: 10.1371 /journal.pone.0058990

Editor: Yves St-Pierre, INRS, Kanada

Empfangen: 7. Oktober 2012; Akzeptiert: 8. Februar 2013; Veröffentlicht: 22. März 2013

Copyright: © 2013 Yang et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde von der Akad Workstation Fund von Shaoxing Zweite Volkskrankenhaus unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Menschliche Magenkrebs (HGC) ist die häufigste Ursache der durch Krebs verursachten Tod [1]. Die Inzidenz von HGC wurde geschätzt 934.000 Fälle mit 56% der neuen Fälle auftreten, in Ostasien, darunter 41% in China und 11% in Japan pro Jahr zu sein [2]. Obwohl die weltweite Inzidenz von GC in den letzten Jahren abgenommen hat, ist die Mortalitätsrate in China die höchste unter allen Tumoren und stellt 25% der GC Sterblichkeit weltweit [3]. Trotz der jüngsten Fortschritte in der Chemotherapie und chirurgische Techniken, die 5-Jahres-Gesamtüberleben (OS) Rate in China ist mit 40% gering. Die meisten HGCs werden in Stadium III oder IV diagnostiziert, und die Rate von Lymphknotenmetastasen von GC ist hoch (50-75%) [4]. Die Pathogenese der HGC ist multifaktoriell einschließlich genetischer Prädisposition und Umweltfaktoren. Mehrere genetische Veränderungen sind mit der Prädisposition für HGC verbunden sind, einschließlich solcher, Tumorsuppressorgenen beteiligt, Onkogene, Zelladhäsionsmolekülen, Wachstumsfaktoren und genetische Instabilität [5]. Daher wird in HGC ein besseres Verständnis der molekularen Mechanismen, die das Erreichen und wertvolle diagnostische Marker und neue therapeutische Strategien zu identifizieren, ist von großer klinischer Bedeutung.

Tetraspanine sind Zelloberflächenproteine, die die Membran viermal umspannen, und fanden in verschiedenen Zelltypen in vielen Organismen. Sie zeigen zahlreiche Eigenschaften indikativ ihrer physiologischen Bedeutung in Zelladhäsion, Motilität, die Aktivierung und Proliferation sowie ihr Beitrag zu pathologischen Zuständen, wie Metastasen und pathologischen Angiogenese [6], [7], [8]. CD151 ist ein Glykoprotein der Zelloberfläche zu dem tetraspanin -Superfamilie gehören, die erste Metastase in einer Studie, in der eine unbekannte Antikörper, der spezifisch gehemmt Metastasenbildung in einem menschlichen Epidermis-Karzinom zu fördern wurde gezeigt, in vivo
[ 9
]. Der Antikörper erkannte CD151 und hemmte die Zellmigration ohne Haftung oder Proliferation zu beeinflussen. Small interfering RNA (siRNA) vermittelte Herunterregulation von CD151-Expression in primären Melanozyten führte zum Verlust der Beweglichkeit, während es nur geringe Auswirkungen auf die Steady-state-Spiegel von Integrinen hatte. Außerdem könnten diese Änderungen rückgängig gemacht werden, wenn CD151 wurde erneut exprimiert [10]. Überexpression von CD151 wurde gezeigt, Integrin und Wachstumsfaktor-Rezeptor-abhängigen Signalwege, die in der erhöhten Motilität und Invasivität von Tumorzellen [11] ergab aktivieren. Dieses Verfahren wurde auch von kleinen GTPasen vermittelt die Aktivierung von Wegen beitragen vorgeschlagen, die GTP-Bindung an erhöht Cdc42 und Rac, Organisatoren der Zelle Zytoskeletts. Die haftungsabhängige Aktivierung von Ras, ERK /MAPK1 /2 und Proteinkinase B (PKB) /Akt gezeigt werden, wurde von CD151 moduliert [7], [12]. Die breite Palette von Funktionen von CD151, insbesondere seine Beteiligung an der Invasivität und Metastasierung von Krebszellen, deuten darauf hin, dass ein besseres Verständnis seiner Expression und Rolle in der HGC wichtig sein kann.

In der vorliegenden Studie haben wir die Expression von CD151 in humanen Magenepithelzellen sucht (HGEC), HGC-Zelllinien, HGC Proben und benachbarte nontumorous Gewebe. Zusätzlich untersuchten wir die Wirkung von siRNA-Silencing von CD151 auf die Proliferation, Invasivität und metastatischen Fähigkeit der HGC-27-Zellen und untersuchten die Beziehung zwischen CD151 und Integrin α3. Schließlich wurde die Expression von CD151 und Integrin α3 durch Immunhistochemie in einem Gewebe-Mikroarray untersucht, bestehend aus 76 Fällen von HGC und die prognostische Bedeutung von CD151 und /oder Integrin α3 in HGC wurde untersucht.

Materialien und Methoden

Zelllinien

HGEC und HGC-Zelllinien, einschließlich HGC-27, AGS, MKN28 und MGC803, wurden von der American Type Culture Collection erhalten und aufbewahrt in unserem Labor. Alle Zellinien wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, Invitrogen) supplementiert mit 10% fötalem Rinderserum (Hyclone) bei 37 ° C in einem befeuchteten Inkubator unter 5% CO _{2 gehalten.}

Patienten und Follow-up

Zwanzig frische Tumorproben von Gebieten in der Nähe der Tumorrand und angepasste nicht-Tumorgewebe (mehr als 3 cm vom Tumor entfernt) wurden von aufeinander folgenden Patienten mit HGC blind erhalten, die kurative Resektion zwischen Februar unterzog 2009 und November 2010 im Shaoxing Zweiten Volkskrankenhaus (Shaoxing, China). Weitere 76 Patienten mit Magenkrebs, die R0-Resektion mit erweiterter Lymphknotendissektion unterzog (D2) zwischen September 2005 und September 2008 im Shaoxing Zweiten Volkskrankenhaus wurden in die Studie eingeschlossen. Die Auswertung der reseziert Proben wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des japanischen Gastric Cancer Association (1998) durchgeführt. Jeder Standard-Resektion ging es um die Entfernung der Gruppe 1 und 2 Lymphknoten (Bereich 36-60, Mittelwert 47,6). Bühnen Einstufung wurde nach dem TNM-Klassifikation für HGC (UICC) durchgeführt. Proben wurden auf der Basis der Verfügbarkeit geeigneter Formalin-fixierten, in Paraffin eingebetteten Geweben und vollständige clinicopathologic ausgewählt und Follow-up-Daten von den Patienten. Die Charakteristika der Studienteilnehmer wurden in Tabelle 1 dieser Studie zusammengefasst von der Shaoxing Zweite Volkskrankenhaus Forschungsethikkommission und eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen Individuen erhalten genehmigt wurde. Keiner der Patienten erhielten eine Chemotherapie oder Strahlentherapie vor oder nach der Operation als Teil eines Adjuvans-Programm. Follow-up-Datensammlung wurde am September beendet 2012. Die mediane Nachbeobachtungszeit betrug 43,0 Monate (Bereich 6-78 Monate). Follow-up-Verfahren bestand aus Zwischen Anamnese, körperliche Untersuchung, Beurteilung von Tumormarkern (CEA, CA-199), Abdomensonographie und Röntgen-Thorax alle 2-3 Monate oder CT alle 6 Monate. Das Gesamtüberleben (OS) wurde in überlebenden Patienten als das Intervall zwischen Operation und Tod oder zwischen der Operation und der letzten Beobachtung definiert. Die Daten wurden bei der letzten Follow-up zensiert Patienten leben.

RNA-Extraktion und Reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR)

Die Gesamt-RNA wurde mit dem TRI-Reagenz extrahiert (Sigma ) gemäß dem Protokoll des Herstellers. RNA wurde dann mit DNaseI (Roche Diagnostics) behandelt, gereinigt durch eine RNeasy Säule (Qiagen) und einer Elektrophorese vor in 5'-RACE-Experimente verwenden, um die Integrität der RNA zu bestimmen. Komplementäre DNA (cDNA) wurde aus 2 ug Gesamt-RNA synthetisiert, unter Verwendung von zufälligen Hexameren (Proligo) und Superscript Reverse Transcriptase III (Invitrogen). RT-PCR wurde auf einem Panel von Zelllinien und Tumorproben durchgeführt. Primer, die für PCR verwendet wurden, waren wie folgt: CD151, 5'-ACTTCATCCTGCTCCTCATCAT-3 'und 5'-TCCGTGTTCAGCTGCTGGTA-3'; Integrin α3, 5'-CGAGAGGAAAGAGGAAGTAGGGGGT-3 'und 5'-ATGAAGAAGGAGTGAGGGGTGAGCA-3'; Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH), 5'-GGCATCCTGGGCTACACTGA-3 'und 5'-GTGGTCGTTGAGGGCAATG-3'. Die RT-PCR-Bedingungen waren wie folgt: 10 min bei 94 ° C, die Denaturierung bei 94 ° C für 20 s, Annealing bei 59 ° C für 30 s und Verlängerung bei 72 ° C für 60 s. Die Expression von CD151 und Integrin α3 relativ zum GAPDH Housekeeping-Gen wurde durch Dichteanalyse mit Band Scan v5.0 Software analysiert. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.

Immunoblotting und Immunofluoreszenz Assay

Gesamtzellextrakt-Protein (30 ug) durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt wurde, auf Polyvinylidendifluorid-Membranen übertragen und mit der inkubierten entsprechenden Antikörper. Die Membranen wurden mit dem verstärkten Chemilumineszenz-Methode (Pierce, Rockford, IL, USA) entwickelt. Maus-anti-human CD151 (11G5a, 1:200; Serotec, UK) und Anti-Integrin α3 monoklonale Antikörper (P1B5, 1:300; Chemicon International, Temecula, CA) wurden verwendet, um die Expression von CD151 und Integrin α3 zu erfassen bzw. . GAPDH (1:5,000; Chemicon, USA) wurde als interne Kontrolle verwendet. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.

HGC-27-Zellen wurden verwendet, um die Lage von CD151 und Integrin α3 zu detektieren, wie zuvor beschrieben [13]. Maus-anti-human CD151 monoklonalen Antikörper (11G5a, 1:200; Serotec, UK) und Maus-anti-Human-Integrin Antikörper α3 (P1B5, 1:300; Chemicon International, Temecula, CA) wurden verwendet. Die Scheiben wurden durch Fluoreszenzmikroskopie (Leica Microsystems Imaging Solutions) analysiert.

Die Transfektion von lentiviralen Vektoren mit kleinen Hairpin RNA gegen CD151 und Integrin α3

Die pGMLV /Neo-shRNA-CD151-Vektor wurde konstruiert gemäß den Anweisungen des Herstellers (pGMLV, eine kleine Haarnadel RNA (shRNA) i Vektor, Shanghai Genomeditch Co. Ltd). Drei shRNA-CD151 lentivirale Vektoren (pGMLV-GFP-shRNA -CD151) generiert wurden, die Expression von CD151 in HGC-27-Zellen (shRNA-CD151-HGC-27) zum Schweigen zu bringen. Die shRNA Targeting-Sequenzen für CD151 waren wie folgt:
, 5'-CATGTGGCACCGTTTGCCT-3 ';, 5'-TACCTGCTGTTTACCTACA-3 ';, 5'-CATACAGGTGCTCAA TAAA-3 '. Die shRNA-Targeting-Sequenz α3 für Integrin war wie folgt: 5 'CCTCTATATTGGGTACACGAT-3' (Shanghai Genomeditech, Shanghai, China). Stabil transfizierte Klone wurden durch RT-PCR analysiert und gekennzeichnet durch für die Expressionsniveaus des CD151 Immunoblotting und α3 Proteine ​​Integrin.

MTT Assay, Cell Migration und Matrigel Invasionsassays

Die Zellen wurden ausgesät in 96-Well-Platten (2.000 pro 200 ul-Vertiefung) und inkubiert für 24, 48 und 72 h. Ein 20 ul Volumen der MTT-Lösung wurde 4 h bei den angegebenen Zeitpunkten gegeben und inkubiert. Das Medium (200 &mgr; l DMEM, das 10% fötales Rinderserum enthält) wurde dann ul DMSO durch 150 ersetzt, Platten für 10 min und die Extinktion bei 490 nm geschüttelt wurden gemessen, um die Anzahl der lebensfähigen Zellen in jeder Vertiefung zu bestimmen. Alle Versuche wurden dreimal durchgeführt.

Die Zellmigration bewertet wurde eine Wundheilungs Assay. Die Zellen wurden in 24-Well-Platten auf 80-90% Konfluenz wachsen gelassen. Eine Wunde wurde durch Ziehen einer Plastikpipettenspitze über die Zelloberfläche. Die verbleibenden Zellen wurden dreimal gewaschen, um Zelltrümmer zu entfernen, und bei 37 ° C mit serumfreiem Medium inkubiert. Zu den angegebenen Zeiten migrierenden Zellen an der Wund vorderen wurden photographiert und verglichen. Drei separate Experimente wurden durchgeführt

Zellinvasion Assays wurden 24-Well-Transwells unter Verwendung von (8 &mgr; m Porengröße, Millipore). Vorbeschichtet mit Matrigel (Falcon 354480; BD Biosciences). Insgesamt 1 × 10 ^{5 Zellen wurden dann in 500 ul DMEM suspendiert, das 1% FBS und zu der oberen Kammer, während 750 &mgr; l DMEM, enthaltend 10% FBS wurde in der unteren Kammer platziert. Nach 48 h Inkubation Matrigel und in der oberen Kammer verbleibenden Zellen wurden durch Wattestäbchen entfernt. Zellen auf der unteren Oberfläche der Membran wurden mit Giemsa in 4% Paraformaldehyd und gefärbt fixiert. Zellen in 5 mikroskopische Felder (Vergrößerung × 200) wurden gezählt und fotografiert. Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt.}

In Vivo Metastasierung Assays

Für die in vivo Metastasierung Assays, MGC-803-Mock, MGC-803-vshRNACD151 und MGC-803-vshRNA CD151-cDNA- CD151-Zellen wurden in Nacktmäuse transplantiert (5-Wochen alten BALB /c-nu /nu, 5 pro Gruppe, 1 × 10 ^{6 Zellen pro Maus) über die laterale Schwanzvene [14]. Nach 7 Wochen wurden die Mäuse getötet. Ihre Lungen wurden entfernt und einer Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung. Alle Forschungstiere wurde in Übereinstimmung mit den Protokollen von der Shaoxing Zweite Volkskrankenhaus Animal Care Kommission.}

Co-Immunpräzipitation (Co-ip) Assays

Die Zellen wurden lysiert mit RIPA Lysepuffer ergänzt genehmigt durchgeführt mit 40 mM NaF, 100 uM Na _{3VO 4, und Complete Protease Inhibitor (Roche). Nach dem Entfernen des unlöslichen Materials durch Zentrifugation bei 12.000 × g wurden die Lysate vorgeklärt mit primärem mAb vorabsorbiert Protein inkubiert A- und G-Sepharose-Kügelchen (Pierce Biotechnology) über Nacht bei 4 ° C. Die Niederschläge wurden für 5 Minuten in 2 × SDS-Probenpuffer dreimal mit Lysepuffer, Salz gewaschen und Proteine ​​durch SDS-PAGE auf 10% Gradienten-Gelen gelöst wurden. Nachfolgende Immunoblots wurden mit dem entsprechenden Antikörper und detektiert durch ECL sondiert.}

Bau von Tissue Microarrays und Immunhistochemie

Tissue Microarrays konstruiert wurden, wie zuvor beschrieben [15]. Kurz gesagt, wurden histologisch durch Hämatoxylin &alle Proben von HGC Patienten überprüft werden; Eosin-Färbung und repräsentative Bereiche wurden in den Paraffinblöcken, weg von nekrotischen und hämorrhagischen Materialien vormarkiert. Duplikate von 1 mm Durchmesser Zylinder aus zwei verschiedenen Bereichen, die Tumorzentrum und dem nächsten noncancerous Rand (bezeichnet als intratumorale und peritumor sind; insgesamt vier Schläge) wurden jeweils enthalten, zusammen mit verschiedenen Kontrollen, die Reproduzierbarkeit zu gewährleisten und homogene Färbung der Objektträger (Shanghai Biochip Co. Ltd, Shanghai). So wurden vier verschiedene Gewebemikroarray-Blöcken aufgebaut, die jeweils mit 140 Zylindern. Die Abschnitte 4 &mgr; m Dicke wurden auf Objektträger gelegt, beschichtet mit 3-Aminopropyltriethoxysilan. Monoklonaler Maus-Anti-Human CD151 (11G5a, 1:200; Serotec, UK) und Maus-anti-human-Integrin α3 (P1B5, 1:300; Chemicon International, Temecula, CA) Antikörper wurden verwendet, um die Expression von CD151 und Integrin α3 nachzuweisen . Die Bilder wurden von der Leica QWin plus erfasst v3-Software. Die Intensität der positive Färbung wurde wie beschrieben gemessen. Die Intensität der CD151 und Integrin α3 wurde in zwei Expressionsniveaus klassifiziert nach dem mittleren Bereich der positiven Färbung als Cutoff-Wert wie folgt: CD151 ^{hoch, > 50% der Tumorschnitt; und Integrin α3 hoch, > 25% des Tumorschnitt; CD151 niedrig, < 50% und Integrin α3 niedrig, < 25% [15]}

Statistische Analyse

Die statistische Analyse wurde durchgeführt, mit SPSS 16.0 Software (. SPSS). Die Werte wurden als Mittelwert ± Standardabweichung ausgedrückt. Für immunhistochemischen Marker war die Cutoff für die Definition von Untergruppen mittlere Intensitätswert. Die χ ^{2-Test und Student-t-Test wurden für Vergleiche zwischen den Gruppen verwendet. OS wurde wie zuvor definiert [15]. mit Kaplan-Meier-Überlebensschätzungen wurde Prognostische Bedeutung bewertet und Log-Rank-Tests. Cox wurde Proportional-Hazards-Regressionsmodell die unabhängige prognostische Faktoren zu analysieren. Alle Tests wurden zweiseitig und p
< 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen}

Ergebnisse |

CD151 überexprimiert wird in HGC

CD151-Expression wurde analysiert. durch RT-PCR und Immunoblotting in HGC Tumor- und Nicht-Tumorgewebe angepasst. CD151 wurde in geringen Mengen in Nicht-Tumorgeweben im Vergleich zu HGC Geweben exprimiert. Wie in gezeigt. 1A, B und C, die relative Expression des CD151-Proteins in HGC Proben betrug 2,95 ± 0,21 (Bereich 1,13 bis 3,59) im Vergleich zu 1,30 ± 0,09 (Bereich 1,00 bis 1,81) in Nicht-Tumorproben und der Unterschied war statistisch signifikant ( p
< 0,01). Weiterhin wurden CD151 Expressionsspiegel deutlich niedriger in HGEC als in HGC-27, AGS, MKN28 und MGC803 Zellen (p < 0,05). Keine Unterschiede in der CD151-Expressionsniveaus wurden unter HGC-Zellen (Fig. 1D, E und F) erkannt werden. Immunohistochemstry (IHC) Analysen bestätigten, dass die CD151-Protein auf höheren Ebenen in HGC Gewebe als in angepassten Nicht-Tumorgewebe exprimiert wurde (Abb. 1G).

CD151 Promoted der Invasion und Metastasierung von HGC Cells in vitro und in vivo

die Rolle von CD151 in HGC-Zellen zu untersuchen, wurde die Expression von CD151 in HGC-27-Zellen, modifiziert durch RNA-Interferenz und cDNA-CD151 Transfektion (Abb. 2A). Die Ergebnisse der Wundheilungstest zeigte eine Verzögerung bei der Wundverschlußgeschwindigkeit von shRNA-CD151-HGC-27 Zellen auf 48 h, verglichen mit HGC-27-Mock-Zellen, die durch cDNA-CD151 Transfektion (Fig. 2B) wurde gewonnen. Herabregulierung von CD151 hatte keine signifikante Wirkung auf die Zellproliferation ( p
> 0,05, Fig. 2C). Allerdings beeinträchtigt die Herabregulation von CD151-Expression der Invasivität von HGC-27-Zellen (Abb. 2D, E).

weiter Um die Rolle von CD151 in Tumormetastasen in vivo, MGC-803-Mock, MGC- erkunden 803-vshRNACD151 und MGC-803-vshRNACD151-cDNA-CD151-Zellen wurden in Nacktmäuse durch die seitliche Schwanzvene transplantiert. Histologische Analyse der Lungen von Mäusen bestätigt, dass die Herunterregulierung von CD151 Lungenmetastasenbildung unterdrückt. Die Zahl und Größe der Lungenmetastasen Knötchen wurden signifikant verringert im MGC-803-vshRNACD151 Gruppe im Vergleich mit MGC-803-Mock und MGC-803-vshRNACD151-cDNA-CD151-Zellen (Fig. 2 F, G). Zusammengenommen unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass CD151 ein positiver Regulator von Magenkrebs Metastasen ist.

CD151 bildet einen Komplex mit Integrin α3 und Silencing von Integrin α3 Beeinträchtigt HGC Zellinvasion, induziert durch CD151 Überexpression

Die Beteiligung von Tetraspaninen in der Regulation der Krebsmetastasen-Integrin-vermittelten nachgewiesen wurde GC Invasion und Metastasierung [16] zu fördern und α3β1-Integrin wurde gezeigt. Daher untersuchten wir die Beziehung zwischen Integrin α3 und CD151 in HGC-Zellen. Wie in gezeigt. 3A wurde Integrin α3 auf höheren Ebenen in HGC-Zellen exprimiert als in HGEC Zellen. Co-Immunpräzipitation Experimente zeigten, dass CD151 einen Komplex mit Integrin α3 in HGC-27 Zellen gebildet (Fig. 3B, C). Außerdem CD151 und Integrin α3 co-lokalisiert an der Plasmamembran der HGC-27-Zellen, wie durch Immunofluoreszenz (Fig. 3D) gezeigt.

weiter Um die Beteiligung von CD151 in Integrin α3-Funktion zu untersuchen, wurden Zellen unterzogen RNA-Interferenz oder cDNA-Transfektion und analysiert durch Transwell Experimente nach dem Matrix-Gel mit Laminin-332 zu ersetzen [17]. Die Ergebnisse zeigten, dass zum Schweigen zu bringen Integrin α3 deutlich die Invasion der HGC-27-Zellen gehemmt, und CD151 cDNA-Transfektion die invasive Fähigkeit von HGC-27-vshRNACD151 gerettet, aber nicht, dass der HGC-27-vshRNA Integrin α3 Zellen. Darüber hinaus hemmte Integrin α3 Antikörper die Invasion der HGC-27-vshRNACD151-cDNA-CD151-Zellen (Abb. 3E, F). Diese Ergebnisse legen nahe, die koordinierte Funktion der CD151-Integrin α3-Komplex und darauf hingewiesen, dass ein hohes Maß an CD151 und Integrin α3 sind mit der erhöhten metastatischen Potential von GC-Zellen in Verbindung gebracht.

Die Expression von CD151 oder Integrin α3 ist eine positive Korrelation mit Bösartige Phänotypen von HGC durch Immunhistochemie

Die Expression von CD151 und Integrin α3-Protein wurde in 76 primären HGC Patienten mit Gewebe-Mikroarrays (TMA) untersucht. CD151-Protein Immunoreaktivität an der Zellmembran lokalisiert (Fig. 4A). In Tumorgeweben zeigte CD151 Expression beträchtliche Heterogenität in den verschiedenen Proben (Fig. 4a1, b1, c1 und d1). CD151 ^{hoch für 50% (38/76) der gesamten Kohorte entfielen. Wie in Tabelle 1 gezeigt, CD151 wurde hoch signifikant mit Tumorgröße korreliert ( p = 0,021
), Tiefe der Invasion ( p = 0,004
), Lymphknotenbefall ( p =
0,028) und eine hohe Tumorstadium ( p =
0,002). Jedoch können auch andere klinische Merkmale, einschließlich Alter, Geschlecht und Tumordifferenzierung, wurden nicht signifikant auf die Expression von CD151 verwandt.}

Die Membranen der Tumorzellen positiv gefärbt für Integrin α3 (Fig. 4a2, b2, c2, und d2). In allen analysierten Geweben, ein hohes Maß an Integrin α3 Expression wurden in 27 HGC Gewebeproben (35,52%) festgestellt. Übereinstimmend mit den Ergebnissen der früheren Studien [16], [18], Patienten mit hohen Expressions Integrin α3 eher aggressive Eigenschaften aufweisen. Integrin α3 ^{Hoch Patienten größere Tumoren zeigten ( p =
3.46E-4), eine größere Tiefe der Invasion ( p =
0,001), höhere Tumorstadium ( p =
0,005) und mehr Beteiligung der Lymphknoten ( p =
0,040) als Patienten mit niedrigem Integrin α3 Expression (Tabelle 1).}

Die Überexpression von CD151 und /oder Integrin α3 sind unabhängig Factors Vorhersage der Prognose von HGC Patienten

bis zum letzten Follow-up, die 3- und 5-Jahres-OS Raten in der Gesamtbevölkerung waren 53,0 und 40,78%, die 5-Jahres-OS in der CD151 ^{geringe Gruppe als signifikant höher war in der CD151 high-Gruppe (68,42% vs.
23,68% bzw. p
= 0,007, Fig. 4B) und die postoperativen 5-Jahres-OS von HGC Patienten war in der Integrin α3 niedriger als im Integrin α3 high-Gruppe (66,67% vs.
13,51%, p = 6.67
E-6). Bewertung der kombinierten Wirkung von CD151 und Integrin α3 auf die Prognose von HGC zeigte, dass die 5-Jahres-OS von CD151 hoch /Integrin α3 Hoch Patienten (Gruppe III, n = 23) war 17,40%, das war deutlich niedriger als die von CD151 low /Integrin α3 niedrig Patienten (77.78% Gruppe I, n = 27) und entweder niedrig Patienten (Patienten mit entweder niedrigen CD151 oder niedrigen Integrin α3 allein) (23,08%, Gruppe II , n = 26, Fig. 4C und D).}

Univariate Analyse zeigte, dass die Tumorgröße, Tiefe der Invasion, Lymphknotenbefall, hohe Tumorstadium, hohe CD151-Expression, hohes Maß an Integrin α3 und Co-Expression von CD151 und Integrin α3 waren Prädiktoren für OS. Weitere Merkmale wie Alter, Geschlecht und Differenzierung hatte keine prognostische Bedeutung für OS (Tabelle 2). Multivariate Cox Proportional-Hazards-Modell zeigte, dass die Tiefe der Invasion ein unabhängiger prognostischer Indikator für OS war (Tabelle. 2).

Diskussion

Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigte, dass CD151 auf höheren Niveaus exprimiert wurde in GC-Zellen und Tumorgeweben als in HGEC Zellen und Nicht-Tumorgeweben, die mit früheren Berichten über CD151 Expression in einer Vielzahl von Tumoren, einschließlich intrahepatischen Cholangiokarzinom, HCC, Brust-, Lungen-, Dickdarm- und Prostatakrebs [15] im Einklang steht, [19] [20], [21]. Darüber hinaus ist unsere Studie zeigte, dass CD151 einen funktionellen Komplex mit Integrin α3 bildet, und Herabregulation von CD151 oder Integrin α3 Expression deutlich die Invasion und Metastasierung von HGC-Zellen in vitro gehemmt. Klinisch unsere Ergebnisse zeigten, dass hohe CD151-Expression oder der Co-Überexpression von CD151 und Integrin α3 kann mit GC ungünstig prognostische Bedeutung für die Patienten haben.

Die erste Hinweise darauf, dass CD151 fördert die Metastasierung von einer Studie kam die zeigen, dass ein Antikörper mit unbekannter Spezifität gehemmt Metastasenbildung durch ein menschliches Epidermoidkarzinom Zeile in vivo
. Der Antikörper erkannte CD151 und hemmte die Zellmigration ohne Haftung oder Proliferation zu beeinflussen [22]. Die Überexpression von CD151 wurde in vielen Tumorarten nachgewiesen und erhöhte CD151-Expression wurde mit einer schlechten Prognose in Brust-, Bauchspeicheldrüsen- und nicht-kleinzelligem Lungenkrebs sowie HCC in Verbindung gebracht worden. Weiterhin wurde CD151 gezeigt, dass ein besserer Indikator für die Prognose bei Patienten mit Prostatakrebs als histologische Grading zu sein [23]. In der vorliegenden Studie zeigten zwei Linien von Beweisen, dass die Überexpression von CD151 von klinischer Bedeutung in HGC ist. Zunächst wurde mehr CD151 Überexpression häufig in HGC Patienten mit schlechter Prognose beobachtet. Zweitens erhöhte Expression von CD151 verbessert die Invasion und Metastasierung von HGC-Zellen. Darüber hinaus ergab klinischen Daten, dass erhöhte CD151 Expression anderen häufig verwendeten klinischen Parametern wie erhöhte Tumorgröße und schlechte Differenzierung zur Vorhersage HGC Prognose übertroffen. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass CD151 spielt eine wichtige Rolle bei der Progression der HGC. In der vorliegenden Studie zeigen wir, dass CD151 in Wechselwirkung tritt α3 in HGC Zellen mit Integrin. Modulation der Expression von α3 in HGC-27-vshCD151-cDNA-CD151-Zellen zeigte die Bildung eines funktionellen CD151-Integrin α3 Komplex Integrin und zeigte, dass die gleichzeitige Überexpression von CD151 und Integrin α3 wurde mit einem erhöhten metastatischen Potential von HGC Zellen assoziiert . In Anbetracht der traditionellen Rolle α3 in HGC von Integrin [16], ist es sinnvoll, dass CD151-Überexpression annehmen kann Metastasierung /Invasion in GC fördern.

Aufgrund ihrer hydrophoben Natur Tetraspaninen assoziieren miteinander und mit anderen Membran Proteine ​​[24]. Tatsächlich ist es gut etabliert, dass Tetraspaninen bieten eine Signalisierungsplattform in der Plasmamembran durch die Bildung von Tetraspanin angereicherten Mikrodomänen (TEMs) [6], [7]. Bisher wurden verschiedene Arten von Membranproteinen, einschließlich der Wachstumsfaktorrezeptoren, Integrinen, Immunglobulindomänen und EWI-F (eine Unterfamilie der Ig-Proteine) wurden in TEMs [25] zu finden. Darüber hinaus haben die Funktionen dieser Membranproteine ​​berichtet innig mit TEMs zugeordnet werden. Zum Beispiel wurden verschiedene Kombinationen von Tetraspaninen bilden TEMs gefunden, die Funktion von Wachstumsfaktor-Rezeptoren und Integrin zu beeinflussen. Noch wichtiger ist, ist das Expressionsniveau der einzelnen Tetraspaninen in TEMs auch eine signifikante Wirkung auf die assoziierte Proteine ​​[26], [27]. In neueren Studien, knock-down von CD151 wurde gezeigt, dass die Bildung von TEMs und CD151 Löschung hemmte die Funktion mehrerer Membranproteine ​​zu beeinträchtigen, was darauf hinweist, dass CD151 eine kritische Rolle bei der TEM-Bildung spielt und Funktion [7], [26]. Des Weiteren Sperrung von CD151 beeinträchtigt deutlich die Invasivität und metastatischen Potential von Tumorzellen, und die Ausrichtung der CD151-Protein oder TEMs eine viel versprechende therapeutische Strategie geworden ist [23]. In der vorliegenden Studie wurde die Expression von CD151 gezeigt für OS ein unabhängiger Prädiktor zu sein. Allerdings war die kombinierte Expression von CD151 und Integrin α3 ein zuverlässiger Prädiktor für OS als CD151 oder α3-Integrin-Expression allein für die These, dass beide CD151 und Integrin α3 eine wichtige Rolle bei HGC spielen. Daher sind unsere Ergebnisse von Bedeutung sind und legen nahe, dass CD151 oder CD151-Integrin α3-Komplex kann mit GC bei der Behandlung von Patienten wichtige Ziele sein.

Abschließend CD151-Überexpression ist ein Prädiktor für schlechte Ergebnisse bei Patienten mit HGC und CD151 oder CD151-Integrin α3 Komplex könnte zur Behandlung von HGC potentielle Ziele sein.

• PLoS ONE: PKG II Hemmt EGF /EGFR-induzierte Migration von Magenkrebszellen
• PLoS ONE: Wiederherstellung von miR-1228 * Expression Unterdrückt Epithelial-mesenchymale Transition in Magenkrebs