Hintergrund
Die chronische Entzündung spielt eine kausale Rolle bei Magentumor Initiation. Die Identifizierung von prädiktiven Biomarkern von Magen-Entzündung zu tumorigenesis wird uns helfen, Magenkrebs von atrophischen Gastritis zu unterscheiden und die Diagnose im Frühstadium Magenkrebs etablieren. Phospholipase C epsilon 1 (PLCε1) wird berichtet, eine entscheidende Rolle bei der Entzündung und Tumorentstehung spielen. Diese Studie zielte darauf ab, die klinische Bedeutung der PLCε1 bei der Initiierung und Progression von Magenkrebs zu untersuchen.
Zunächst wird die mRNA und Protein-Expression von PLCε1 durch reverse Transkription analysiert -PCR und West in normalen Magenschleimhaut epithelialen Zelllinie GES-1 und Magenkrebs-Zelllinien AGS Blotting, SGC7901 und MGC803. Die Ergebnisse zeigten sowohl mRNA und Proteinniveaus PLCε1 wurden in Magenkrebszellen im Vergleich zu normalen Magenschleimhaut Epithelzellen hochreguliert. Zweitens wurde dieses Ergebnis durch immunhistochemischen Nachweis in einem Gewebe-Mikroarray mit 74 gepaart Magenkrebs und benachbarten normalen Geweben bestätigt. Drittens zeigte eine Unabhängigkeit immunhistochemischen Analyse von 799 chronische atrophische Gastritis Gewebeproben, dass PLCε1 Expression in atrophische Gastritis Gewebe wurden nach unten reguliert seit PLCε1 Ausdruck in 524 (65,6%) atrophische Gastritis negativ war. Darüber hinaus abgestimmt klinischen Gewebe von atrophischen schweren Gastritis und Magenkrebs-Patienten die bisherigen Ergebnisse durch die Analyse von mRNA und Protein-Ebene die Expression von PLCε1 in klinischen Proben zur weiteren Bestätigung verwendet.
Unsere Ergebnisse legen nahe, dass PLCε1 Protein ein potentieller Biomarker sein kann Magenkrebs von Entzündung Läsion zu unterscheiden und könnte ein großes Potenzial in Anwendungen wie Diagnose und Vorwarnzeit von Frühphasen-Magenkrebs haben
Citation:. Chen J Wang W, Zhang T, Ji J, Qian Q, Lu L, et al. (2012) Differentielle Expression von Phospholipase C Epsilon 1 ist im Zusammenhang mit chronischer atrophischer Gastritis und Magenkrebs. PLoS ONE 7 (10): e47563. doi: 10.1371 /journal.pone.0047563
Editor: Javier S. Castresana, Universität von Navarra, Spanien
Empfangen: 22. Juni 2012; Akzeptiert: 18. September 2012; Veröffentlicht am: 15. Oktober 2012
Copyright: © Chen et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden
Finanzierung:. Diese Arbeit wurde von National Key Grundlagenforschung Programm von China (973 Project) (2010CB933900), New Century Excellent Talent des Ministeriums für Bildung von China (NCET-08-0350), spezielle Infektionskrankheiten Key Project of China (2009ZX10004-311), National unterstützt Natural Science Foundation of China (31170961 und 31100717), Shanghai Science and Technology Fund (12ZR1415800) und Shanghai Jiao Tong University Innovation Fund für Graduierte (Z-340-007). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung
Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen
Einführung
Magenkrebs ist die vierte gemeinsame Tumoren in Welt. Die Inzidenz von Magenkrebs ist aufgrund der jüngsten Änderungen des Lebensstils und Diäten Gewohnheiten in China stetig zu [1]. Wie für Magenkrebs, hängen die Überlebensraten auf die frühe Diagnose der Krankheit. Typischerweise wird die früher ein Krebs erkannt und diagnostiziert wird, desto erfolgreicher wird die Behandlung sein. Daher ist es sehr wichtig, die Rate der Frühdiagnose und frühe Behandlung für Magenkrebs zu verbessern. Wir haben versucht, einen frühen Magenkrebs Vorwarnzeit System herzustellen, das auf die Genexpression Microarray-Analyse seit 2005 [2]. Inzwischen haben wir gehofft, auch die Früherkennung von Magenkrebszellen zu finden in vivo und Videos Multi-Mode-Bildgebungstechniken gezielt [3] - [7]. Allerdings ist fehlen Biomarker für Magenkrebs immer noch das größte Hindernis für eine frühzeitige Diagnose. Heute ist es allgemein anerkannt, dass Helicobacter pylori Die Phosphoinositid-spezifischer Phospholipase C (PLC) eine große Familie darstellt, die die Hydrolyse von Phosphatidylinositol 4 katalysiert, 5-bisphosphat in zwei wichtige sekundäre Botenstoffe, Diacylglycerin und Inositol-1,4,5-triphosphat, die sechs Familien von Säugetier-PLC-Isoformen umfassen (β, γ, δ, ε, ζ und η) [11] - [13]. Unter ihnen ist PLCε ein neu identifiziertes Mitglied der SPS-Familie [12]. Es ist ein Schlüssel nachgeschalteten Effektor von Ras-Familie kleiner GTPasen: Ras, Rap1 und Rap2 [12], [14], [15] Vor kurzem viel Arbeiten berichtet, dass PLCε1 eine entscheidende Rolle bei der Tumorentstehung spielt. Entzündung. PLCε1 Ausdruck ist gefunden worden, mit der menschlichen Blasenkrebs zu korrelieren, und der Zuschlag von PLCε1 In-vitro- Darüber hinaus PLCε erforderlich war, in der Aktivierung der Cytokin-Produktion in nicht-immune Hautzellen in einer Vielzahl von entzündlichen Reaktionen und diese wichtige Funktion der PLCε weiter in transgenen Mäusen wurde bestätigt überexprimierenden PLCε [21], [22]. Auf der anderen Seite, nuclear factor kappa B (NF &kgr; B) -Weg [23] PLCε wurde in humanen Keratinozyten für die Tumor-Nekrose-Faktor (TNF &agr;) -induzierten Chemokin (C-C-Motiv) -Ligand 2 (CCL2) Expression erforderlich und wirkt mit. Eine solche Funktion der PLCε in Entzündung ist einzigartig unter den SPS-Isozyme [13]. Kürzlich wurden zwei Einzel-Nukleotid-Polymorphismus (SNP) rs2274223 und rs11187870 in PLCε1 Loci wurden als neue Anfälligkeit Locus für Magenkrebs in Chinese identifizierten Bevölkerung durch breite Gen-Assoziations-Analyse (GWAS) Genom [24] - [26]. Diese Ergebnisse bestätigten die Assoziation zwischen PLCε1 und Risiko von Magenkrebs. In dieser Studie untersuchten wir die Expressionsmuster von PLCε1 in menschlichen Magengewebe, einschließlich normal, atrophische Gastritis, und Tumorgewebe und machte eine Hypothese über die Rolle der PLCε1 bei chronischen Entzündungen und Tumorgenese von Magenkrebs. Im Vergleich zu normalen Geweben, fanden wir, dass PLCε1 Protein wurde in Magenkrebs Geweben stark exprimiert, während sie nach unten reguliert wurde in atrophischen Magengewebe. Unsere Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass PLCε1 eine potenziell vielversprechende Biomarker zur Unterscheidung von Magenkrebs von atrophischer Gastritis sein und könnte ein potentieller Biomarker für die Diagnose im Frühstadium Magenkrebs sein. Ethic Statements die Studie wurde von der Ethikkommission der Sun Yat-sen University Cancer Center und der Ethikkommission des Ersten Affiliated Hospital der Shanghai Jiao Tong University, und eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von jeder Person erhalten genehmigt wurde. Zelllinien Die SV40-transformierten unsterblichen Magenepithelzellen Zelle GES-1 wurden in unserem Institut erhalten und gepflegt wie empfohlen [27]. Drei Magenkrebszelllinien AGS, SGC7901 und MGC803 wurden von der chinesischen Akademie der Wissenschaften Cell Bank of Type Culture Collection erhalten und aufbewahrt in unserem Labor. Alle Zelllinien wurden in Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Kälberserum (FCS) (Sigma Chemical, St. Louis, MO), 100 Einheiten /ml Penicillin und 0,1 mg /ml Streptomycin. Die Zellen wurden bei 37 ° C in einer befeuchteten Kammer mit 5% CO 2 gehalten. Total RNA aus Zellen und Geweben Proben wurde extrahiert unter Verwendung von das Trizol-Reagens (Invitrogen) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die extrahierte RNA wurde mit RNase-freier DNase vorbehandelt, und 2 &mgr; g RNA aus jeder Probe wurde für die cDNA-Synthese geprimt mit zufälligen Hexameren verwendet. Für PCR-vermittelte Amplifikation von PLCε1 cDNA, einer anfänglichen Amplifizierung PLCε1 spezifischen Primern wurde für 10 min um 30 Denaturierung Zyklen bei 95 ° C für 60 s, gefolgt von 95 ° C mit einem Denaturierungsschritt durchgeführt, Primer-Annealing bei 55 ° C für 30 s, und Primerextension bei 72 ° C für 30 s. Nach Abschluss der Zyklusschritte wird eine abschließende Extension bei 72 ° C für 5 min durchgeführt wurde, bevor die Reaktion gestoppt wurde und bei 4 ° C gelagert. Expressionsdaten wurden auf den geometrischen Mittelwert der normalisierten housekeeping Glyceraldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) -Gens die Variabilität in Expressionsniveaus zu steuern. Reverse Transkriptions-PCR wurde unter Verwendung der Primer Express Software Version 3.0 (Applied Biosystems) ausgeführt. Die Sequenzen der Sense- und Antisense-Primer waren wie folgt: 5'-GCAAGAAGTGGCCTTCTCAG-3 '(F) und 5'-GAACTTGAAGGGAGGGCATT -3' (R) für PLCε1, 5'-GCTCCTCCTGAGCGCAAG-3 '(F) und 5' CATCTGCTGGAAGGTGGACA -. 3 '(R) für GAPDH Western Blotting Die Zellen wurden in Abtastpuffer [62,5 mmol /l Tris-HCl (pH 6,8), 2% SDS, 10% Glycerin geerntet und 5% 2-h-Mercaptoethanol]. Alle frischen Gewebe wurden in flüssigem Stickstoff zu Pulver geerdet und dann mit dem Abtastpuffer lysiert. Proteinkonzentration wurde durch Bradford-Assay (Bio-Rad Laboratories) bestimmt. Gleiche Mengen an Proteinen wurden auf 9% Polyacrylamid-SDS-Gelen (SDS-PAGE) aufgetragen, elektrophoretisch getrennt und auf Polyvinylidenfluorid-Membranen (Amersham Pharmacia Biotech) transferiert. Die Membran wurde mit Anti-Kaninchen-Antikörper PLCε1 (; Sigma 1:250) inkubiert. und eine verstärkte Chemilumineszenz-Kits (Amersham Pharmacia Biotech) nach den Anweisungen des Herstellers; PLCε1 Expression wurde mit Meerrettich-Peroxidase-konjugiertem Ziege-anti-Kaninchen-IgG (Amersham Pharmacia Biotech 1:2,000) nachgewiesen. β-Actin nachgewiesen mit einem anti-β-Actin-Kaninchen-Antikörper (1:1,000 Verdünnung; Sigma) wurde als Ladekontrolle verwendet Die Patienten, Gewebeproben und Gewebemicroarray Patienten mit atrophischen. Gastritis und Krebs wurden von Patienten ausgewählt, die für die oberen Magen-Darm-Endoskopie für Routine-Screening für Magenkrebs bei der ersten Affiliated Hospital der Shanghai Jiao Tong University und Sun Yat-sen University Cancer Center von Januar 2003 bis Dezember geplant waren 2009. Wir Patienten ausgeschlossen, die hatten erhielten anti-Ulcus-Mittel oder Antibiotika für bis zu zwei Monate vor der Prüfung und diejenigen, die Geschichten von Magenkrebs, Magen- oder Zwölffingerdarmgeschwür hatte, oder Magen-Operation. . Hematoxylin und Eosin (H & E) Färbung auf die Patientengewebe wurde getan, um histopathologischen Merkmale bestimmen Das Ausmaß der Atrophie in drei Schweregrade eingeteilt wurde, gemäß dem Auftreten von Schleimhautfalten und Vaskulatur, wie folgt: mild (transparente feine Blutgefäße und gelblich auf den unteren Körper beschränkt Verfärbungen, mit dicken Schleimhautfalten), mittel (klar transparente Blutgefäße und gelb-graue Verfärbung bis zur Mitte und Oberkörper, mit verdünntem und Schleimhautfalten verengt) und schwerer (klar transparent große Blutgefäße und graygreenish Verfärbung bis zum Oberkörper, mit dem Verschwinden von Schleimhautfalten auf Luftinsufflation). Die Anwendung dieser Kriterien wird von den früheren Berichten über die Konsistenz zwischen Endoskopie und histologische Befunde für atrophische Gastritis [28], [29] gerechtfertigt. Wenn beide Endoskopie und histologische Befunde wurden bestätigt, 799 atrophische Gastritis Patienten einschließlich 281 mild, 265 moderat und 253 schwere wurden jeweils in unsere Studie aufgenommen. Die 799 Patienten wurden eingeschlossen 439 männlich und 320 weiblich, mit einem Medienzeitalter von 35,6 Jahren (Bereich 18-55 Jahre). Jeder Tumorprobe einen histologischen Grad auf der Grundlage der Weltgesundheitsorganisation zugewiesen wurde (WHO) Einstufungskriterien. Alle Patienten mit Magenkrebs wurden mit der 7. Ausgabe der Internationalen Union gegen Krebs (UICC) Tumor-Node-Metastase (TNM) Staging-System in Szene gesetzt. Patienten mit Krebs wurden in unsere Studie aufgenommen, wenn ihre Diagnose histologisch bestätigt wurde. Die normalen Geweben wurden aufgenommen, wenn ihre endoskopische Diagnostik normal war. Nach dem Screenen H & E-gefärbten Objektträger für optimale Tumorgewebe und normalem umgebendem Gewebe Tumor mit einem Abstand von 10 cm vom Tumor konstruierten wir TMA mit 74 paarweise von Tumorgeweben gleitet und auf die Tumorgewebe benachbart (zusammen mit Shanghai Biochip , Shanghai, China) .Die 74 Magenkrebs-Patienten (im Alter von 40-84 Jahre =, Durchschnittsalter = 63,77 Jahre; 23 weibliche und 35 männliche) enthalten 36 frühen Fällen (pTNM Stufe I = 11, pTNM Stufe II = 25) und 36 fortgeschrittenen Fällen (pTNM Stufe III = 32, pTNM Stufe IV = 6). Unter diesen 6 (0,81%) wurden als gut differenziertes Adenokarzinom klassifiziert, 40 (54,1%) als mäßig differenzierten und 25 (33,8%) als schlecht differenzierten Adenokarzinom. Immunhistochemische Analyse in 74 angepaßten menschlichen Magenkrebsgewebe und 799 atrophische Gastritis Proben wurde verwendet, um die Expressionsmuster von PLCε1 Proteins zu bestimmen. Kurz gesagt, in Paraffin eingebettete Proben wurden in 4 &mgr; m Schnitte geschnitten und bei 60 ° C gebacken für 2 h durch Entparaffinierung mit Xylol folgte und rehydratisiert. Die Schnitte wurden in EDTA antigen Retrieval Puffer getaucht und für antigenische Retrieval wärmten, wonach sie mit 3% Wasserstoffperoxid in Methanol behandelt wurden mit 1% Rinderserumalbumin durch Inkubation endogene Peroxidase-Aktivität, gefolgt abzuschrecken unspezifische Bindung zu blockieren. (; Sigma 1:50) über Nacht bei 4 ° C wurden die Schnitte mit Kaninchen-anti- PLCε1 inkubiert. Normales Ziegenserum wurde als negative Kontrolle verwendet. Nach dem Waschen Gewebeschnitte wurden mit biotinyliertem anti-Kaninchen-Sekundärantikörper (Zymed), gefolgt von einer weiteren Inkubation mit Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Komplex (Zymed) behandelt. Gewebeschnitte wurden dann in 3, 3'-Diaminobenzidin getaucht und counterstained mit 10% Mayers Hämatoxylin, dehydriert und montiert. PLCε1 Immunreaktivität wurde von drei Pathologen unabhängig bewertet ( WW, QQ und LL), die Ergebnisse bei Patienten geblendet wurden. Der prozentuale Anteil der positiv gefärbten Zellen und die Intensität der Anfärbung Zellen wurde von jedem Beobachter bestimmt, und der Durchschnitt von 3 Scores berechnet. Wir haben 10 Hochleistungsfeldern zufällig ausgewählt (Vergrößerung × 400; 100 Zellen pro Hochleistungsfeld) und zählte 1000 Zellen. Wenn der Mittelwert des Prozentsatzes der PLCε1-positive Zellen auf 0% oder 100% liegt, ist die Standardabweichung (SD) nahe 0; und, wenn der Mittelwert etwa 50% beträgt, ist die SD etwa 5%. Somit muss die SD nicht mit dem Mittelwert erhöhen. In dieser Studie wurde PLCε1 Ausdruck wie folgt bewertet: Gewebe mit positivem Zytoplasma-Färbung in ≤25% der Zellen wurde negativ bewertet, und das Gewebe mit positiven zytoplasmatische Färbung in > 25% der Zellen positiv [30] abgestuft Alle statistischen Analysen wurden unter Verwendung der 17,0 SPSS Statistik-Software-Paket durchgeführt. Der Wilcoxon-Test-Methode wurde verwendet, um diejenigen abgestimmt Magentumoren Gewebe im Tissue Microarray zu analysieren. Der Test und Fisher Exact Tests verwendet diejenigen Magenkrebs und schwere atrophische Gastritis, zu analysieren und wurden auch die Bedeutung der Beziehung zwischen PLCε1 Expression und klinisch-pathologische Merkmale zu bestimmen, durchgeführt. Jedes Experiment wurde unabhängig mindestens zweimal mit ähnlichen Ergebnissen durchgeführt. p Ergebnisse
( H. Pylori
) spielt eine kausale Rolle bei der chronischen Entzündung (Gastritis), die zu Malignität bei der Auslösung und hat als eine bestimmte Humankarzinogen Internationale Agentur für Krebsforschung (IARC) [8] eingestuft worden - [10]. Ferner, basierend auf den histologischen Unterschiede zwischen chronischer Gastritis und Magenkrebs, ist Magenkrebs im Frühstadium oft durch Endoskopie nachgewiesen. Somit Untersuchung der molekularen und biologischen Veränderungen, einschließlich Gen-Amplifikation und Aktivierungen, die von chronischer Gastritis Magenkrebs auftreten, können einige neue Einblicke in die Pathologie dieser Krankheit und neue prognostische Marker bereitzustellen. Doch bis heute gibt es nur wenige Berichte über die Adressierung speziellen Biomarkern, die Magen-Entzündung von Magen-tumorigenesis unterscheiden kann.
und in vivo
gehemmt Blasentumorwachstum [16], [17]. Ferner wurde berichtet, dass PLCε1 wird in Hautkrebs überexprimiert [18]. In PLCε - /- Mäuse zeigten sie deutliche Resistenz gegen Tumorbildung und auf die 12-O-Tetradecanoylphorbol-13-Acetat (TPA) -induce Hautentzündung [18], [19]. Nachfolgende Studien zeigten, dass PLCε eine entscheidende Rolle in der spontanen Darmtumorentstehung mit Vermehrung der Angiogenese und Entzündung, die durch die adenomatöse Polyposis coli (APC) mit gespielt Min /+ Mausmodell [20].
Materialien und Methoden
RNA Extraktion und Reverse-Transcription-PCR
Immunhistochemie
Scoring von PLCε1 Immunhistochemie
<. h3> statistische Analyse
. ≪ 0,05 in allen Fällen berücksichtigt wurde als statistisch signifikant
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