PLoS ONE: Glyoxalase-I ist ein neuartiges Prognosefaktor Verbunden mit Magenkrebs Progression

Abstrakt

Glyoxalase I (GLO1), ein Methylglyoxal Entgiftung Enzym wird in der Progression der menschlichen Tumoren beteiligt. Die Rolle der GLO1 bei Magenkrebs Entwicklung oder Progression ist derzeit unklar. Die Expression von GLO1 wurde in primären Magenkrebs Proben mit quantitativen Polymerase-Kettenreaktion, Immunhistochemie (IHC) und Western-Blot-Analysen bestimmt. GLO1 Expression war höher bei Magenkrebs Gewebe, verglichen mit der in benachbarten noncancerous Gewebe. Erhöhte Expression von GLO1 war signifikant mit Magenwand Invasion, Lymphknoten-Metastasen und pathologischen Stadium verbunden sind, eine neue Rolle von GLO1 bei Magenkrebs Entwicklung und Progression hindeutet. Die 5-Jahres-Überlebensrate der unteren GLO1 Ausdruck Gruppen war signifikant höher als die der höhere Expression Gruppen (Log-Rank P
= 0,0373) in IHC-Experimente. Überexpression von GLO1 bei Magenkrebs-Zelllinien erhöht die Zellproliferation, Migration und Invasivität. Umgekehrt Herunterregulierung von GLO1 mit shRNA führte zu einer deutlichen Reduktion der Migration und Invasion Fähigkeiten. Unsere Daten legen nahe, dass eine hohe Expression von GLO1 bei Magenkrebs erhöht die Metastasierung Fähigkeit der Tumorzellen In-vitro-
und in vivo
, und seine Wirksamkeit als potentieller Marker für die Erkennung und Prognose unterstützen von Magenkrebs

Citation:. Cheng WL, Tsai MM, Tsai CY, Huang YH, Chen CY, Chi HC et al. (2012) Glyoxalase-I ist ein neuartiges Prognosefaktor Verbunden mit Magenkrebs Progression. PLoS ONE 7 (3): e34352. doi: 10.1371 /journal.pone.0034352

Editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 8. Dezember 2011; Akzeptiert: 27. Februar 2012 um; Veröffentlicht: 29. März 2012

Copyright: © 2012 Cheng et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit durch Zuschüsse aus Chang-Gung University, Taoyuan, Taiwan (NMRPD 150311, NMRPD170441-42, CMRPG 640042-43, CMRPG 670291-93) unterstützt wurde und der National Science Council der Republik China (NSC 95-2314-B-182 -027, 97-2314-B-182-009-MY2 99-2314-B-182-022). Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs ist die vierthäufigste Form von Krebs und die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle weltweit [1]. Die Bösartigkeit ist die sechsthäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle in Taiwan [2]. Proper-Screening kann die Erkennung von Magenkrebs vor Symptomentwicklung in einem heilbaren Stadium zu erleichtern [3]. Die Bestimmung der Expressionsprofile von Schlüsselmolekülen in den verschiedenen Bahnen im Magenkrebsprogression beteiligt sind, können in der Diagnose, Prognose und Vorhersage der Tumorprogression unterstützen.

Tumorinvasion und Metastasierung sind wichtige Schritte in den aggressiven Phänotyp von Krebserkrankungen des Menschen zu bestimmen und die Hauptursachen für Krebs-Todesfälle dar [4]. Hohe Expression von migrationsbezogene Faktoren, wie Cyclooxygenase-2 (COX-2) [5], Vascular endothelial growth factor (VEGF) [6], CXC Chemokin-Liganden (CXCL) -8- [7], Chemokine (CXC-Motiv) -Rezeptor (CXCR) -2 und CXCL-1 [8], sind mit Magenkrebs Progression. Mehrere potenzielle onkogene Wege (Proliferation /Stammzell, NF-kappaB und Wnt /β-Catenin) sind in der Mehrzahl der Magenkrebs dereguliert [9]. Somit wird eine weitere Aufklärung der genauen molekularen Ereignisse zu Magenkrebs Progression und Identifizierung von wertvollen diagnostischen oder prognostische Marker und neue therapeutische Strategien würden von signifikanten klinischen Wert führt.

Glyoxalase I (auch GLO1 genannt) ist ein wesentlicher Bestandteil in Bahnen zur Entgiftung von Methylglyoxal (MG), eine der Nebenprodukte der Glykolyse [10], [11], [12] führt. GLO1 Expression in verschiedenen menschlichen Krebserkrankungen des Kolons, der Brust, der Prostata und Melanomen [13], [14], [15] erhöht, [16], [17]. Jüngste Studien haben berichtet, dass die Überexpression von GLO1 mit Tumorprogression und Medikamentenresistenz assoziiert ist [17]. Aus unseren früheren Daten wurde bei Magenkrebs Proben unter Verwendung von cDNA-Microarray [18] GLO1 upregulation beobachtet. Allerdings bleiben die spezifische Rolle der GLO1 während Magen tumorigenesis und ihre klinische Bedeutung etabliert werden.

Unsere Experimente zeigen deutlich, dass GLO1 häufig überexprimiert bei Magenkrebs und mit Krebsmetastasen assoziiert. Bemerkenswert ist, die Expression von GLO1 ist signifikant höher in fortgeschrittenen Stadien von Magenkrebs. Darüber hinaus Veränderungen der Expression von GLO1 bei Magenkrebs-Zelllinien beeinflusst die Zellmigration und Invasion Fähigkeiten.

Materialien und Methoden

Ethik Statement

Das Studienprotokoll wurde von der Medical genehmigt Ethik und klinische Studien Ausschuss des Chang Gung Memorial Hospital (IRB NO. 95-0472B). Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen Patienten erhalten

Themen

Die 114 Patienten (64 Männer und 50 Frauen, Durchschnittsalter 66 Jahre, Bereich 28-86 Jahre). Mit Magenkrebs bei der Diagnose Chang Gung Memorial Hospital von 2000 bis 2005 wurden in die Studie eingeschlossen. Alle Patienten erhielten eine Operation für primären Magenkrebs ohne vorherige Chemotherapie oder Strahlentherapie. Jeder Patient wurde nach Magenresektion unterzogen (35 Patienten wurde eine Gastrektomie und 79 teilweise Gastrektomie).

Clinicopathological Studien

Resektates pathologisch untersucht wurden, mit den Kriterien der japanischen Allgemeine Regeln für Magenkrebs-Studie [19] und der American Joint Committee on Cancer (AJCC) (pTNM) Klassifikationssystem [20]. Clinicopathological Parameter enthalten Patienten nach Alter und Geschlecht, Tumorlokalisation und Größe, brutto (Borrmann ist) Tumor-Typ, Wand Invasion, Resektionsrand, histologischen Typ, Lymphknotenmetastasen, Gefäßinvasion, lymphatische Invasion und perineuralen Invasion. Nach der Entlassung hatten alle Patienten regelmäßige Nachuntersuchungen in der Ambulanz von Chang Gung Memorial Hospital, bis zum Tod oder zu Beginn der Vorbereitung dieses Artikels.

Real-time quantitative reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR
)

qRT-PCR wurde durchgeführt, wie in einem früheren Bericht beschrieben [21]. Die folgenden Primer wurden verwendet: Mensch GLO1
qRT-PCR (Vorwärts-Primer, 5'-TGAGGATAAAAATGACATCCCTA- AAGA-3 'und Reverse-Primer, 5'-TGTGTCAGCTCAAGTGTAGCTTTC-3'), Human 18S rRNA qRT-PCR (vorwärts-Primer, 5'-CGAGCCGCCTGGATACC-3 'und Reverse-Primer, 5'-CCTCAGTT CCGAAAACCAACAA-3').

Die Produktion von Anti-GLO1 Antikörper

Die cDNA, die in voller Länge GLO1
wurde in pGEX-4T1 geklont. Lysate von E. coli
BL21 Stamm wurden mit Glutathion-Agarose-Kügelchen (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) gereinigt. Lösliche Proteine ​​wurden unter Verwendung von Chromatographie mit Glutathion-Agarosekügelchen gereinigt, gemäß den Anweisungen des Herstellers, mit Adjuvans emulgiert und verwendet, um Kaninchen zu immunisieren. Polyklonale Antikörper hergestellt und affinitätsgereinigt, wie zuvor beschrieben [22]. Die Spezifität der in-house GLO1 wurde mit Western-Blot-Analyse (Abbildung S1) validiert.

Immunoblot-Analyse

Ganzzelllysate, Kernextrakte und bedingte Medien wurden aus menschlichem Gewebe oder stabil GLO1 vorbereitet Zuschlagszelllinien. Western-Blot wurde unter Verwendung von monoklonalen Antikörpern gegen humanes HIF-1α (Abcam, San Francisco, CA) durchgeführt wird, p65 (Epitomic, Burlingame, CA) oder p50 (Millipore, Billerica, MA) oder polyklonalen Antikörper gegen menschliches GLO1 (in-house, Verdünnung, 1:500), CXCL1 (PeproTechs Inc., Rocky Hill, NJ), CXCL8 (R &.. D Systems Inc., Minneapolis, MN), VEGF (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)

Immunhistochemie (IHC)

Formalin-fixierte und in Paraffin eingebetteten Gewebe wurden mit IHC untersucht mit dem polyklonalen Antikörper gegen die menschliche GLO1 in-house produziert (Verdünnung, 1:3000) und der Avidin-Biotin-Komplex (ABC ) Verfahren, wie [23] oben beschrieben, [24]. Vergleiche wurden zwischen der Intensität der Färbung von Karzinomzellen und gutartige oberflächliche Epithel durchgeführt, die auf dem gleichen Objektträger aufgebracht wurden. Für semi-quantitative Analyse von GLO-1-Immunreaktivität, ein Histoscore (H) -scoring System wurde verwendet, [25]. Kurz gesagt, der negative Gruppe von Krebszellen bestand ohne nachweisbare (-) oder nur Spuren Anfärben für GLO-1 (+1). Die positive Gruppe bestand aus Krebszellen mit mäßigen (+2) oder hoch (3) von GLO-1-Immunreaktivität. Die H-Scoring wurde von zwei unabhängigen Pathologen berechnet und gemittelt, für jeden Patienten die anfängliche Punktzahl geblendet. Die Ergebnisse wurden durch Multiplikation des Prozentsatzes an positiven Zellen (P) durch die Intensität (I) hat, nach der Formel: H = P × I. Zum Beispiel hatte ein Abschnitt, in dem 10% des Gewebes eine Anfärbung Score von +1, 60% einen Wert von 2 und 30% ein Wert von +3, H = (10 × 1) + (60 × 2) + (30 × 3) = 220.

Einrichtung von GLO1 über~~POS=TRUNC in SC-M1-Zelllinie

Die SC-M1-Zelllinie niedrigeren Niveau von GLO1 ausdrückt verwendet wurde. Die Transfektion von GLO1
cDNA wurde mit Lipofectamin-Reagenz (Life Technologies, Grand Island, NY) durchgeführt. Nach einer Inkubationszeit von 24 h wurden die Zellen auf Medium, das G418 zur Auswahl übertragen, und wurden dann in die Proliferation, Migration und Invasion Assays verwendet.

Einrichtung von GLO1 Knockdown in TSGH und AGS Zelllinien

Zwei menschliche Magenkrebszelllinien, AGS und TSGH, wurden eingesetzt. Die kurzen haarnadel RNA (shRNA) Targeting-Sequenzen GLO1
(TRCN0000118630 ​​und TRCN0000118631) wurden von der National RNA-Interferenz Core Facility (Institut für Molekularbiologie, Academia Sinica, Taiwan) erworben. Die spezifische Repression von GLO1 wurde mit Western-Blot-Analyse bestätigt.

Zellproliferationsassays

Die Zellen (1 × 10 ^{4) wurden bei 37 ° C auf einer 6 cm Platte gewachsen unter 5 % CO _{2. Zu jedem Zeitpunkt wurde die Wachstumsrate der Zellen durch Zellzählung bestimmt. Die Ergebnisse werden als fache Veränderung relativ zu jedem Steuerwert angegeben.}}

In-vitro-Assays
Migration und invasive Aktivität

Die Wirkung von GLO1 Erschöpfung oder Überexpression auf die Migration und invasive Aktivität von Magenkrebszelllinien wurde mit Hilfe eines schnellen beurteilt in vitro
Assay (Transwell-Technik), wie zuvor beschrieben [26].

RNA-Präparation und Microarray-Analyse

Der GLO1-zum Schweigen gebracht Klon TSGH (KG2) und Steuer-Zell-Klon (C1) wurden kurz mit eiskaltem PBS gespült und in Trizolreagenz (Invitrogen) zur RNA-Extraktion lysiert. Genexpressionsprofile zwischen KG2 und C1-Zellen wurden mit dem menschlichen U133A GenChip (Affymetrix, Santa Clara, CA) analysiert nach dem Protokoll des Herstellers [27].

Die statistische Analyse

Die GLO1 Ausdrücke jede Untergruppe von clinicopatholgoical Parameter in Tabelle 1 sind als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) der IHC-Score der Patienten in dieser Untergruppe ausgedrückt. Der Kolmogorov-Smirnov-Test ist ein nicht-parametrischer Testproben mit einer Referenzwahrscheinlichkeitsverteilung zu vergleichen. Gegebenenfalls gibt der Mann-Whitney-U oder der exakte Test nach Fisher wurde für Vergleiche zwischen den beiden Gruppen angelegt, während Kruskal-Wallis oder Pearson-Chi-Quadrat-Test verwendet wurde, mehr als zwei Gruppen zu vergleichen. Die Beziehung zwischen den Daten aus den zwei verschiedenen Untersuchungen erhalten wurde mit dem Spearman-Korrelationstest analysiert. Die Patienten wurden bis zum Zeitpunkt der Manuskripterstellung oder Tod überwacht. Krebs-spezifische Überleben Ergebnis wurde durch die Anwendung der Kaplan-Meier-Methode für alle Patienten, mit Ausnahme derjenigen bestimmt, die von chirurgischen Komplikationen gestorben. Die Log-Rank-Test wurde die prognostische Bedeutung der einzelnen Variablen auf das Überleben zu vergleichen eingesetzt. Die Cox-Proportional-Hazards-Modell wurde in der multivariaten Analyse verwendet, um die unabhängige Prädiktoren für das Überleben zu identifizieren. P
Werte. ≪ 0,05 wurden als signifikant betrachtet

Ergebnisse |

GLO1 mRNA und Protein-Ebene in
Magenkrebs-Patienten hochregulierten

Mit cDNA-Microarray, wir haben mehrere aufreguliert Gene aus Magengewebe identifiziert, im Vergleich zu benachbarten Geweben nontumorous [18]. Unter diesen Genen konzentrierten wir uns auf GLO1
als molekulares Ziel für Magenkrebs. Expression von GLO1 wurde in Krebsgeweben gemessen und verglichen mit der in angepaßten nontumorous Magenschleimhaut, qRT-PCR unter Verwendung von (n = 89) (Tabelle 2) oder IHC (n = 114) (Tabelle 1). Die Daten aus qRT-PCR-Experimente zeigten GLO1 Überexpression (≥1.5-fach) in 51 (57,3%) von Magenkrebsgewebe verglichen mit noncancerous Gewebe. Die mittlere GLO1 Expression im Tumorgewebe war 2,87-fach, dass in noncancerous Gewebe. Unsere Ergebnisse bestätigten eine deutliche Steigerung der GLO1 Expression in Tumorgeweben ( P
= 0,005, bei einer Stichprobe Kolmogorov-Smirnov-Test).

Die Expression von GLO1 Protein in gepaarte Proben wurde weiter analysiert unter Verwendung von Western Blotting. 1A stellt GLO1 Ausdruck in acht repräsentativen Patienten. Gleiche Mengen an Gesamtprotein mit Coomassie-Blau nach SDS-PAGE, gefärbt wurden als Ladekontrolle verwendet. Alle Krebsgewebe von Magenkrebs Proben (G1 bis G8) hochregulierten GLO1 Ausdruck, verglichen mit angepassten noncancerous angrenzenden Schleimhaut (Abb. 1A) angezeigt.

Immunostaining zeigt GLO1 Protein-Überexpression in Magenkrebsgewebe

Um festzustellen, ob GLO1 upregulation mit dem klinischen Verlauf von Magenkrebs korreliert ist, wurde IHC ausgeführt auf Paraffin-fixierten Magenkrebsgewebe und angepasst noncancerous Schleimhaut von 114 Patienten. Vier Paare von repräsentativen Fällen (a /b, c /d, e /f und g /h) sind in Abbildung 1B gezeigt. IHC Daten für noncancerous mucosa Pendants (a, c, e und g) und Krebsgeweben (b, d, f und h) wurden paarweise verglichen. Dunkelbraun Immunfärbung war vor allem in Krebszellen weit verbreitet, während Niveaus der Färbung niedriger waren in Stromazellen oder Fibroblasten von Magenkrebsgewebe. Starke Färbung für GLO1 wurde in fortgeschrittenem Magentumorzellen, im Gegensatz zu schwache oder keine Färbung in normalen Magen-Epithelzellen (Fig. 1B, obere Tafel) häufig beobachtet. Die Färbung war intensiver bei den fortgeschrittenen Magenkrebs Stadien [Stufe III in Fig. 1B (f, h)], im Vergleich zu den Stadien I [Abb. 1B (b)] und II [Fig. 1B (d)]. Unter den 114 analysierten Patienten betrug die mittlere IHC-Score in Tumorgeweben 139,8 ± 62,8, was als wesentlich größer war (36,7 ± 40,4) in der entsprechenden angrenzenden Schleimhaut (n = 87) ( P
< 0,001 Wilcoxon, Vorzeichen-Rang-Test). Weiterhin paarigen Vergleich der Immunreaktivität für GLO1 (n = 87) zeigten, dass die IHC Noten von Krebsgewebe als die höher waren der nontumorous Pendants in 77 (88,5%) der Patienten, gleich in drei Patienten (3,4%), und die untere in sieben Patienten (8,0%).

GLO1 Ausdruck und
klinische Korrelationen

GLO1 Expression im Tumorgewebe nicht signifikant mit dem Alter, Tumorlokalisation oder histologischen Typ (Tabellen 1 und 2) verbunden war. Höhere GLO1 waren in den T3 /T4 Gruppen evident, wo die Serosa Oberfläche der Magenwand durch Krebs eingedrungen wurde, im Vergleich zu dem in T1 /T2 Gruppen, in denen keine Invasion war offensichtlich ( P
= 0,015 für qRT - PCR und P
= 0,001 für IHC; 2A; Tabellen 1 und 2).. Expression von GLO1 war signifikant erhöht, mit Metastasen in den Lymphknoten ( P
= 0,001 für qRT-PCR und P
< 0,001 für IHC; Fig. 2B; Tabellen 1 und 2) . Höhere Expression zeigte sich bei Patienten mit lymphatischer Invasion ( P
= 0,001 und P
= 0,016 für qRT-PCR und IHC sind; den Tabellen 1 und 2) und perineuralen Invasion ( P
= 0,024 für qRT-PCR, Tabelle 2). Erhöhte GLO1 Expression wurde nicht mit Gefäßinvasion oder Fernmetastasen assoziiert, peritoneale Aussaat oder Lebermetastasen einschließlich in beiden qRT-PCR und IHC-Experimente. Expression von GLO1 war signifikant höher bei Patienten mit fortgeschrittenen pathologischen Stadien (III /IV) von Magenkrebs, im Vergleich zu denen in den früheren pathologischen Stadien (I /II) ( P
= 0.001 und P
< 0,001 für qRT-PCR und IHC, beziehungsweise) (2C;. die Tabellen 1 und 2)

Überleben Ergebnisse

die mittlere Dauer des Follow-up-Periode für. 52 Überlebenden war 70,4 Monate (Bereich: 28-119 Monate). Vier Patienten starben an postoperativen Komplikationen und sechs anderer Ursachen. Fifty-zwei Patienten starben an Magenkrebs Progression zurückzuführen ist. Die kumulative Fünfjahresüberlebensrate der 114 Patienten betrug 49,3% nach Gastrektomie. Um den Einfluss der GLO1 Ausdruck auf das Überleben Ergebnis zu bestimmen, wurde der Patient in zwei Gruppen eingeteilt, höhere und niedrigere Ausdrücke, nach dem Cutoff-Wert, die einen signifikanten Unterschied zeigen würde (Rang log P
< 0,05) Überlebensraten zwischen zwei Gruppen. Der Median (= 140), obere Quartil (= 180 oder 75 ^{Perzentil) und unteren Quartil (= 90 oder 25 Perzentil) von IHC-Scores unserer Patienten wurden zunächst die Cutoff-Werte zu bestimmen, getestet. Unter ihnen sind nur die untere Quartil einen signifikanten Unterschied im Überleben Ergebnis zeigen konnte. Feige. 2D veranschaulicht die kumulative Überlebenskurven der Patienten in den niedrigeren und höheren Expressions GLO1 Gruppen unterteilt nach einem Cutoff IHC-Score von 90. Die 5-Jahres-Überlebensrate der unteren GLO1 Expressionsgruppen als die der höhere Expressions Gruppen signifikant höher war ( 69,6% vs. 43,3%; log-Rank P
= 0,0373) in IHC-Experimente. Univariate Analyse offenbart eine Reihe signifikanter Prognosefaktoren, von Lymphknotenmetastasen, Fernmetastasen, peritoneale Aussaat, Gefäßinvasion, Lymph-Invasion, die Tiefe der Invasion, Krankheitsstadium, Lebermetastasen und perineuralen Invasion, zusätzlich einschließlich Status Ausdruck zu GLO1. Weitere wichtige Parameter waren histologischen Typ, Tumorgröße und Bruttotyp (Tabelle 1). Ferner wird in der multivariaten Analyse die unabhängige prognostische Faktoren das Überleben des Patienten zu beeinflussen enthalten Lymphknotenmetastasen (relatives Risiko = 5,954, 95% CI = 1,183 bis 29,977, P
= 0,031) und Fernmetastasen (relatives Risiko = 2,464, 95% CI = 1,030-5,896, P
= 0,043).}

Die Überexpression von GLO1 in SC-M1 verbessert die Zellproliferation, Migration und Invasion Aktivitäten.

Bestimmung der Auswirkungen von über~~POS=TRUNC von GLO1
in SC-M1-Zellen, die Zellproliferation, Migration und Invasion Aktivitäten untersucht wurden. Nach zwei Wochen der Transfektion wurde die stabile Expression von GLO1 Protein hergestellt. 3A zeigt 2,36-fache und 2,29-fach höhere GLO1 Ausdruck sind. Die Zellproliferation wurde durch Zellzählung und angegeben als eine Falte der Steuerung für bis zu fünf Tage bestimmt. GLO1
-überexprimierende zeigten Zellen signifikant ( P
< 0,01) höhere Proliferationsraten (1.86- oder 2,06-fach) als die transfiziert mit Kontrollvektor am Tag 5 (Abb. 3B). Außerdem GLO1
-überexprimierende angezeigt Zellen signifikant ( P
< 0,01) höhere Migrationsraten (5.53- oder 4,57-fach) und invasive Fähigkeiten (3.7- oder 3,47-fach) als ihre Steuer Pendants (Fig. 3C und D). Bilder der Zelldichte wurden für zwei Steuer und zwei überexprimierenden Zelllinien (linke Felder in den Fig. 3C und D) gezeigt.

Hinunter-expression von GLO1 in TSGH oder AGS-Zellen die Zellmigration und Invasion Aktivitäten reduziert

Unsere Ergebnisse bestätigen eine hohe Expression von GLO1 in fortgeschrittenem Magenkrebs, im Vergleich zu nicht-karzinogene Magenschleimhaut. Um zu bestimmen, ob GLO1 Ausdruck mit Invasivität von Magenkrebs-Zelllinien verbunden ist, wurden die Wirkungen von GLO1 Depletion mittels short hairpin (sh) RNA-Plasmiden auf die Tumorzellinvasion Aktivitäten TSGH oder AGS-Zellen beurteilt. ShRNA-Expressionsvektoren, die Antisense-GLO1 Sequenz kodieren, wurden transfiziert in TSGH und AGS Zelllinien hohe Konzentrationen von endogenem GLO1 Ausdruck zu bringen. GLO1 Expression wurde in TSGH-KG1, -KG2 (0.32- und 0.14-fach) und AGS-KS1, -KS2 (0.26- und 0.21-fach) Sublinien signifikant unterdrückt, verglichen mit derjenigen in den Steuervektoren transfizierten Zellen ( C1, C2; Fig. 4A und B). KG1 und KG2 GLO1 verarmten Zellen zeigten signifikant ( P
< 0,05) reduzierte Migrationsraten (0.16- oder 0,044-fache, beziehungsweise) und Invasion Fähigkeiten (0.43- oder 0,29-fache, beziehungsweise) als Steuervektor transfizierten Zellen (Fig. 4C und D). Ähnliche Ergebnisse wurden mit AGS-KS Zellen (KS1 und KS2) (Fig. 4E und F) erhalten. Unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass kollektiv GLO1 sich positiv auf die Migration und Invasion Fähigkeiten von Magenkrebszellen reguliert.

Down-Expression von GLO1 führt zu einer verminderten Expression von Genen bei der Metastasierung-assoziierten Wegen beteiligt

Um festzustellen, ob die GLO1 Protein beeinflusst die Metastasierung im Zusammenhang mit Genen, die wir genomweite Expression von KG2 und C1 verglichen. Mehrere Gene hochreguliert (≥1.5-fach) in C1, im Vergleich zu KG2, wurden ausgewählt. MetaCore ™ Analyse [28] zeigten, dass die Top-Ranking molekularen Wege in KG Klonen verändert adhesion_cytokines und Haftung Wege waren. Proteine ​​[wie Matrix-Metalloproteinase (MMP), CXCL8 und CXCL1] in diesen Bahnen beteiligt waren herunterreguliert auf GLO1 Silencing. Unter den Cytokin-verwandten Wege, eine hohe Expression von VEGF, CXCL8, CXCR2 und CXCL1 mit Krebsmetastasen und Progression [8], [29]. Zuvor Daniel J. et al.
[30] berichtet, dass Überexpression von GLO1 stromal cell-derived factor-1 erhöhen könnte (SDF-1), CXCR4 und VEGF-Expression in hypoxischen endothelialen Vorläuferzellen Kultur in hoher Glukose. Daher untersuchten wir auch die Expression von VEGF in KG stabile Linien.

Wir weiterhin die Expressionsmuster von Proteinen in VEGF oder Cytokin-verwandten Wege über Western Blot-Analyse bestätigt. Die Niveaus von Zielgenen, einschließlich CXCL1, CXCL8, CXCR2 und VEGF wurden in TSGH-KG stabilen Zelllinien (KG1 und KG2), verglichen mit Vektor-transfizierten Kontrollen (Fig. 5A) signifikant inhibiert. Darüber hinaus sind die Ebenen der NF &kgr; B und HIF1-α, bekannten Transkriptionsfaktoren der pro-angiogene Wachstumsfaktoren (wie CXCL8, CXCL1 und VEGF) [31] wurden in den Kernen der TSGH-KG stabilen Zelllinien reduzierte , im Vergleich zu Kontrollzellen (Abb. 5A). MMP2 und MMP9, die Schlüsselenzyme für Abbau von Typ-IV-Kollagen, wird angenommen, dass eine kritische Rolle bei der Tumorinvasion und Metastasierung spielen [32]. Bemerkenswert ist, Erschöpfung der GLO1 führte zu einer starken Unterdrückung von MMP2 und MMP9 Aktivitäten (Abb. 5B). Unsere Daten zeigen, dass GLO1 die Aktivierung von Metastasen-assoziierte Signalwege in Magenkrebszellen reguliert. Basierend auf diesen Ergebnissen, schlagen wir vor, dass GLO1 Magenkrebs Zellmigration und Invasion zumindest teilweise vermittelt durch die Aktivierung von CXCL1, CXCL8 und VEGF vermittelt.

zeigt IHC Koexpression von GLO1 mit CXCL1 und CXCR2-Proteine ​​und ihre Über- Expression in Magenkrebsgewebe

Frühere Studien haben berichtet, dass Zytokin-Rezeptor-Interaktion und VEGF-signal~~POS=TRUNC mit malignen Erkrankungen Merkmale bei Magenkrebs assoziiert sind [8], [33]. Zuvor unsere Gruppe eine signifikante Assoziation von CXCR2 und CXCL1 Überexpression zeigten (n = 116) mit Magenkrebs Progression [8]. Konsequent wurde ausschließlich in IHC-Analyse, eine positive signifikante Korrelation zwischen den Werten von GLO1 und CXCL1 oder CXCR2 in Krebsgewebe (Spearman-Korrelationskoeffizient = 0,238 und 0,293 gefunden; P
= 0,013 und P
= 0,003). Darüber hinaus Immunfärbung von aufeinanderfolgenden Abschnitte zeigten signifikante Expression von GLO1, CXCL1 und CXCR2 Proteine ​​in Tumor Epithelzellen [Abb. 5C (b), (d) und (f)], im Gegensatz zu keine oder geringe Expression in nicht-krebsartigen Gewebe [Fig. 5C (a), (c) und (e)].

Diskussion

Wie die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Tod, eine schwierige Krankheit nach wie vor Magenkrebs. Daten aus dieser Studie zeigten, dass eine Hochregulierung von GLO1 in Magenkrebsgewebe signifikant mit Tumorprogression und fortgeschrittenen Stadien der Erkrankung assoziiert ist. Concordantly, Patienten mit niedriger GLO1 Ebenen hatten bessere Krankheitsprognose. Außerdem qRT-PCR und IHC-Experimente offenbart eine Korrelation von erhöhten GLO1 Ausdruck mit lokalen Tumorprogression und Lymphknoten-Invasion. Wir beobachteten eine deutliche Abnahme bei der Metastasierung und Invasion Fähigkeiten GLO1-defizienten Zellen, gleichzeitig mit verringerten Gehalten von mehreren Metastasen-assoziierten Faktoren, einschließlich VEGF, CXCL1, CXCL8, MMPs und CXCR2. In der IHC-Studie eine positive signifikante Korrelation zwischen GLO1 und CXCL1 Expressionsmuster in reseziert Proben von Magenkrebs beobachtet. Außerdem wurden erhöhte GLO1 und begleitende CXCL1 Überexpression in Patienten mit Magenkrebs signifikant mit Überleben korreliert. Unsere Ergebnisse liefern direkte Nachweise für die Beteiligung von GLO1 bei Magenkrebs Progression und die Macht durch Wechsel seiner Downstream-Migration und Invasion Wege.

Hohe Expression von GLO1 hat zu verschiedenen Krebsarten in Verbindung gebracht worden [16], [17] . Jüngste Studien haben eine entscheidende Rolle von GLO1 in verschiedenen Krebsarten in der Entfernung von Methylglyoxal (MG) vorgeschlagen, die karzinostatische betrachtet wird, was in der Entwicklung von Inhibitoren GLO1 als Antitumormittel [34], [35]. So hohe Expression von GLO1 wird in Krebszelle Resistenz gegen Apoptose durch Antitumormittel [36] induziert beteiligt. Sakamoto et al.
[36] vorgeschlagen, dass GLO1 nicht nur ein Tumor ist, sondern auch ein Arzneimittelresistenzmarker. Konsequent (Daten nicht gezeigt) die GLO1-Knockdown-Klone auf mehrere Chemotherapien empfindlich waren wie Camptothecin, Etoposid. Klinisch unsere Ergebnisse zeigen, dass GLO1 stark in Magenkrebs exprimiert wird und signifikant mit der Tumorprogression und fortgeschrittenen Stadien der Krankheit.

glykolytischen Veränderungen in Krebszellen stellen eine metabolische Anpassung an hypoxischen Tumoren über die Wirkung von Hypoxie- induzierte Transkriptionsfaktor (HIF-1) [37], [38]. Darüber hinaus spielen die Transkriptionsfaktoren, HIF1-α und NF-kappaB, eine entscheidende Rolle in verschiedenen Prozessen, wie Entzündung, mikrobiellen Tötung und Krebsprogression [39]. Tumorhypoxie erscheint stark mit Tumorausbreitung, maligne Progression und Therapieresistenz in Verbindung gebracht werden. Der HIF-1α Weg wird in der Karzinogenese von Magenkrebs [39] deutlich beteiligt. Zusätzlich immunhistochemische Expression von HIF-1α Zielgenen (Glut1, VEGF, CA9, iNOS) mit Magentumorprogression assoziiert [40]. Unter den onkogenen Wege, NF &kgr; B-Signalisierung in einem signifikanten Anteil von Magenkrebs erhöht [9]. Außerdem mehrere Beweislinien Trägerübersprechens zwischen der NF &kgr; B und HIF-1α Signalwege [41]. In unseren Experimenten Spiegel sowohl HIF-1α und NF-kappaB wurden in den Kernen auf GLO1 Silencing bei Magenkrebs-Zelllinien, reduziert zusammen mit Zielgenen (VEGF, CXCL1, CXCL8, MMPs).

In unserem Studie abnorm erhöhten GLO1-Expression wurde mit progressiven Phänotypen, wie Magenwand Invasion, Lymphknoten-Metastasen, Krankheitsstadium und lymphatische Invasion assoziiert. Zuvor berichteten wir, dass erhöhte CXCL1 und CXCR2 bei Magenkrebs mit Tumorprogression assoziiert ist, und dass das Plasma CXCL1 Ebene kann eine nützliche zirkulierende Biomarker für Magenkrebs Diagnose sein [8]. Hier haben wir direkte klinische Beweise für eine starke Korrelation zwischen den Expressionsmuster von GLO1 und CXCL1 oder CXCR2 erhalten. GLO1 Expression kann mit der Aktivierung von Cytokin-Rezeptor assoziiert und VEGF-Signalwege in Verbindung gebracht werden, ein möglicher Mechanismus für eine verbesserte Beweglichkeit und invasive Fähigkeit darstellt. Unsere Ergebnisse bestätigen die Überexpression von GLO1 in Magenkarzinom und seine starke Assoziation mit fortgeschrittenen Stadien und einer schlechten Prognose. Frühere Studien von unserer Gruppe haben, dass SPARC gezeigt [18], CLIC1 [42], SLPI [43], CXCL1, CXCL8 und CXCR2 sind stark exprimiert und in Verbindung mit fortgeschrittenen Stadien und einer schlechten Prognose von Magenkrebs [8]. Diese neuen potentiellen Biomarkern können deshalb aufgebracht werden, um die Spezifität und Sensitivität von Magenkrebsdiagnose zu verbessern. Die weitere Entwicklung und Bestätigung der Nützlichkeit dieser Marker in größeren Patientengruppen werden möglicherweise zu klinischen Anwendungen führen.

Hintergrundinformationen
S1 Abbildung.
Die Spezifität der in-house GLO1 wurde durch Western-Blot-Analyse bestätigt. Kaninchen polyklonales anti-GLO1 Antikörper (rechtes Bild) und negative Kontrolle Präimmunseren (linkes Bild) verwendet. Die GLO1 Proteinebene wurde in TSGH-C1 und -KG2 Magen-Zelllinien mit dem hauseigenen GLO1 Antikörper bestimmt. β-Actin wurde als interne Kontrolle für insgesamt Zelllysaten verwendet
doi:. 10.1371 /journal.pone.0034352.s001
(TIF)

• PLoS ONE: Die räumliche Verteilung der LGR5 + Zellen korreliert mit Magenkrebs Progression
• PLoS ONE: Stathmin1 Spielt onkogene Rolle und ist ein Ziel von microRNA-223 in Magenkrebs