PLOS ONE: glyoxalase-I est un roman Pronostic facteur associé à cancer gastrique Progression

Résumé

glyoxalase I (GLO1), une enzyme de détoxification méthylglyoxal, est impliquée dans la progression des tumeurs malignes humaines. Le rôle de GLO1 dans le développement du cancer de l'estomac ou de la progression est actuellement incertaine. L'expression de la GLO1 a été déterminée dans des échantillons de cancer gastrique primaires en utilisant une réaction en chaîne par polymérase quantitative, immunohistochimie (IHC) et analyse western blot. l'expression GLO1 était plus élevée dans les tissus du cancer de l'estomac, comparativement à celle dans les tissus non cancéreux adjacents. Une expression élevée de GLO1 était significativement associée à l'invasion gastrique mur, métastase ganglionnaire et le stade pathologique, ce qui suggère un nouveau rôle de GLO1 dans le développement du cancer de l'estomac et de la progression. Le taux de survie à 5 ans des groupes d'expression GLO1 inférieurs était significativement supérieure à celle des groupes d'expression plus élevés (log rank P
= 0,0373) dans les expériences IHC. Surexpression de GLO1 dans des lignées cellulaires de cancer gastrique augmente la prolifération cellulaire, la migration et l'invasivité. A l'inverse, la régulation négative de GLO1 avec shRNA a conduit à une réduction marquée de la migration et de l'invasion des capacités. Nos données suggèrent fortement que l'expression élevée de GLO1 dans le cancer gastrique augmente la capacité de la métastase des cellules tumorales in vitro
et in vivo
, et soutiennent son efficacité comme un marqueur potentiel pour la détection et le pronostic du cancer gastrique

Citation:. Cheng WL, Tsai MM, Tsai CY, Huang YH, Chen CY, Chi HC, et al. (2012) glyoxalase-I est un roman Pronostic facteur associé à la progression du cancer gastrique. PLoS ONE 7 (3): e34352. doi: 10.1371 /journal.pone.0034352

Editeur: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Etats-Unis d'Amérique

reçues: 8 Décembre 2011; Accepté le 27 Février 2012; Publié le 29 Mars, 2012 |

Droit d'auteur: © 2012 Cheng et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Ce travail a été soutenue par des subventions de l'Université Chang-Gung, Taoyuan, Taiwan (NMRPD 150311, NMRPD170441-42, CMRPG 640042-43, CMRPG 670291-93) et le Conseil national des sciences de la République de Chine (NSC 95-2314-B-182 -027, 97-2314-B-182-009-MY2, 99-2314-B-182-022). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

le cancer gastrique est la quatrième forme la plus courante de cancer et la deuxième cause de mortalité liée au cancer dans le monde [1]. La malignité est la sixième cause de décès liés au cancer à Taiwan [2]. le dépistage approprié peut faciliter la détection du cancer gastrique avant l'apparition des symptômes à un stade curable [3]. Détermination des profils d'expression des molécules clés dans les différentes voies de signalisation impliquées dans la progression du cancer de l'estomac peut faciliter le diagnostic, le pronostic et la prédiction de la progression tumorale.

invasion tumorale et les métastases sont des étapes essentielles dans la détermination du phénotype agressif des cancers humains , et constituent les principales causes de décès liés au cancer [4]. Une expression élevée de facteurs liés à la migration, telles que la cyclo-oxygénase 2 (COX-2) [5], facteur de croissance vasculaire endothélial (VEGF) [6], chemokine CXC ligand (CXCL) -8 [7], une chimiokine (CXC motif) récepteur (CXCR) -2 et CXCL-1 [8], sont associés à la progression du cancer gastrique. Plusieurs voies oncogéniques potentiels (prolifération /souches cellulaires, NF-kB, et Wnt /β-caténine) sont déréglementés dans la majorité des cancers gastriques [9]. Ainsi, plus d'élucidation des événements moléculaires exacts conduisant à la progression du cancer de l'estomac et de l'identification de marqueurs diagnostiques ou pronostiques précieux et de nouvelles stratégies thérapeutiques serait une valeur clinique importante.

glyoxalase I (également appelé GLO1) est une composante essentielle dans des voies conduisant à la désintoxication du méthylglyoxal (MG), l'un des produits secondaires de la glycolyse [10], [11], [12]. GLO1 l'expression est augmentée dans plusieurs cancers humains du côlon, du sein, de la prostate et le mélanome [13], [14], [15], [16], [17]. Des études récentes ont rapporté que la surexpression de GLO1 est associée à la progression du cancer et de la résistance aux médicaments [17]. De nos données précédente, GLO1 surexpression a été observée dans les échantillons de cancer gastrique en utilisant l'ADNc microarray [18]. Toutefois, le rôle spécifique de GLO1 durant la tumorigenèse gastrique et sa signification clinique reste à établir.

Nos expériences montrent clairement que GLO1 est fréquemment surexprimé dans le cancer gastrique et associé à des métastases cancéreuses. Notamment, l'expression de GLO1 est significativement plus élevée dans les stades avancés de cancer gastrique. En outre, les modifications de l'expression des GLO1 dans des lignées cellulaires de cancer gastrique affecte la migration cellulaire et l'invasion des capacités.

Ethique Déclaration
Matériels et méthodes

Le protocole d'étude a été approuvé par le médecin Comité d'éthique et humain essai clinique de l'hôpital Chang Gung Memorial (CISR NO. 95-0472B). Le consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les patients

des sujets

Les 114 patients (64 hommes et 50 femmes; âge médian, 66 ans, la gamme 28-86 ans). diagnostiqués avec le cancer de l'estomac au Chang Gung Memorial Hospital 2000-2005 ont été inclus dans cette étude. Tous les patients ont reçu une chirurgie pour un cancer gastrique primaire sans chimiothérapie ou une radiothérapie antérieure. Chaque patient a été soumis à une résection gastrique (35 patients ont subi une gastrectomie totale et 79 gastrectomie partielle).

études clinicopathologiques

spécimens exérèse ont été examinés pathologiquement en utilisant les critères du Règlement général japonais pour l'étude du cancer gastrique [19] et le Comité américain mixte sur le cancer (AJCC) système (pTNM) de classification [20]. paramètres clinicopathologiques inclus l'âge du patient et le sexe, l'emplacement et la taille tumorale, brute (de Borrmann) type de tumeur, envahissement de la paroi, la marge de résection, le type histologique, métastase ganglionnaire, l'invasion vasculaire, invasion lymphatique, et l'invasion périneural. Après la sortie, tous les patients avaient des visites de suivi périodiques au service de consultations externes de Chang Gung Memorial Hospital jusqu'à la mort ou le début de la préparation de cet article.

en temps réel la réaction quantitative en chaîne par polymérase de transcription inverse (qRT-PCR )

qRT-PCR a été effectuée comme décrit dans un précédent rapport [21]. Les amorces suivantes ont été utilisées: GLO1
qRT-PCR (amorce sens, 5'-TGAGGATAAAAATGACATCCCTA- AAGA-3 ', et l'amorce inverse, 5'-TGTGTCAGCTCAAGTGTAGCTTTC-3'), 18S humains ARNr qRT-PCR humaine (amorce sens, 5'-CGAGCCGCCTGGATACC-3 ', et l'amorce inverse, 5'-CCTCAGTT CCGAAAACCAACAA-3').

production d'anticorps anti-GLO1
codant

L'ADNc pleine longueur GLO1
a été clone dans pGEX-4T1. Lysats de E. La souche BL21 d'coli ont été purifiées avec des billes de glutathion-agarose (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Les protéines solubles ont été purifiés en utilisant une Chromatographie avec des billes glutathion-agarose, selon les instructions du fabricant, émulsionnée avec un adjuvant, et utilisé pour immuniser des lapins. Des anticorps polyclonaux ont été produits et purifiés par affinité, comme décrit précédemment [22]. La spécificité de GLO1 en interne a été validée en utilisant une analyse western blot (Figure S1).

Analyse immunoblot

lysats de cellules entières, des extraits nucléaires et les médias conditionnels ont été préparés à partir de tissu humain ou GLO1 stable lignées de cellules knockdown. Western blot a été réalisée en utilisant des anticorps monoclonaux dirigés contre HIF-1α humaine (Abcam, San Francisco, CA), p65 (Epitomic, Burlingame, CA), ou p50 (Millipore, Billerica, MA) ou des anticorps polyclonaux contre GLO1 humaine (en interne, dilution, 1:500), CXCL1 (PeproTech Inc., Rocky Hill, NJ), CXCL8 (R &.. D Systems Inc., Minneapolis, MN), VEGF (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA):

immunohistochimie (IHC)

formaline fixes et les tissus enrobés de paraffine ont été examinés avec IHC en utilisant l'anticorps polyclonaux contre GLO1 humaine produite en interne (dilution, 1:3000) et le complexe avidine-biotine (ABC procédé) comme décrit précédemment [23], [24]. Des comparaisons ont été effectuées entre l'intensité de coloration des cellules de carcinome de l'épithélium superficiel et bénin, qui ont été placés sur la même lame. Pour une analyse semi-quantitative de GLO-1 immunoréactivité, un Histoscore (H) système -scoring a été utilisé [25]. En bref, le groupe négatif composé de cellules cancéreuses sans détectable (-) ou seulement des traces de coloration pour GLO-1 (+1). Le groupe positif composé de cellules cancéreuses avec des niveaux modérés (+2) ou élevé (+3) de GLO-1 immunoréactivité. Le H-score a été calculé et en moyenne par deux pathologistes indépendants, aveuglés au score initial pour chaque patient. Les résultats ont été notés en multipliant le pourcentage de cellules positives (P) de l'intensité (I), selon la formule: H = P x I. Par exemple, une section dans laquelle 10% du tissu avait un indice de coloration de 1, 60% un score de 2, et 30% un score de 3, H = (10 x 1) + (60 x 2) + (30 x 3) = 220.

Création d'GLO1 sur-expression dans la lignée cellulaire SC-M1

La lignée cellulaire SC-M1 exprimant niveau inférieur de GLO1 a été utilisé. La transfection de GLO1
ADNc a été réalisée avec Lipofectamine Réactif (Life Technologies, Grand Island, NY). Après une incubation de 24 h, les cellules ont été transférées dans un milieu contenant du G418 pour la sélection, et ont ensuite été utilisés dans la prolifération, la migration et les essais d'invasion.

Création d'GLO1 knockdown dans des lignées cellulaires TSGH et AGS

Deux lignées cellulaires de cancer gastrique humain, AGS et TSGH, ont été utilisés. Les ARN en épingle à cheveux court (shRNA) ciblant des séquences GLO1
(TRCN0000118630 ​​et TRCN0000118631) ont été achetés à l'ARN interférence national de base Facility (Institut de biologie moléculaire, Academia Sinica, Taiwan). La répression spécifique de GLO1 a été confirmée par une analyse western blot.

La prolifération cellulaire test

cellules (1 x 10 ^{4) ont été cultivées sur une plaque de 6 cm à 37 ° C sous 5 % de CO _{2. A chaque point de temps, le taux de croissance des cellules a été déterminée par comptage des cellules. Les résultats sont donnés en tant que facteur de variation par rapport à la valeur de chaque contrôle.}}

In vitro
analyse de la migration et l'activité invasive

L'effet de GLO1 épuisement ou over-expression la migration et l'activité invasive des lignées cellulaires de cancer gastrique a été évaluée au moyen d'un rapide in vitro
dosage in (technique Transwell), comme décrit précédemment [26].

préparation de l'ARN et l'analyse de puces à ADN

Le clone GLO1-taire TSGH (KG2) et clone de cellules de contrôle (C1) ont été rincées brièvement avec du PBS glacé et lysées dans le réactif Trizol (Invitrogen) pour l'extraction de l'ARN. profils d'expression génique entre les cellules KG2 et C1 ont été analysées avec le U133A humain GeneChip (Affymetrix, Santa Clara, CA) selon le protocole du fabricant [27].

L'analyse statistique

Les expressions de GLO1 de chaque sous-groupe de paramètres clinicopatholgoical dans le tableau 1 sont exprimés en moyenne ± écart-type (SD) du score IHC des patients dans ce sous-groupe. Le test de Kolmogorov-Smirnov est un test non paramétrique pour comparer les échantillons avec une distribution de probabilité de référence. Le cas échéant, le Mann-Whitney U ou le test exact de Fisher a été appliqué pour des comparaisons entre les deux groupes, tandis que le test du chi-carré de Kruskal-Wallis ou Pearson a été utilisé pour comparer plus de deux groupes. La relation entre les données obtenues à partir des deux examens différents a été analysée avec le test de corrélation de Spearman. Les patients ont été suivis jusqu'à ce que le moment de la préparation du manuscrit ou la mort. la survie des résultats spécifiques du cancer a été déterminée en appliquant la méthode de Kaplan-Meier pour tous les patients, sauf ceux qui sont morts de complications chirurgicales. Le test du log-rank a été utilisé pour comparer la signification pronostique des variables individuelles sur la survie. Le modèle de Cox des risques proportionnels a été utilisé dans l'analyse multivariée pour identifier les facteurs prédictifs indépendants de la survie. P
valeurs <. 0,05 ont été considérées comme significatives

Résultats

GLO1 ARNm et de protéines niveaux sont surexprimés chez les patients atteints de cancer gastrique

Utilisation d'ADNc microréseau, nous ont identifié plusieurs gènes surexprimés dans les tissus gastriques, par rapport aux tissus adjacents non tumoral [18]. Parmi ces gènes, nous nous sommes concentrés sur GLO1
comme une cible moléculaire pour le cancer gastrique. L'expression de GLO1 a été mesurée dans les tissus cancéreux et comparée à celle de la muqueuse gastrique non tumoral identifié, en utilisant la qRT-PCR (n = 89) (tableau 2) ou IHC (n = 114) (Tableau 1). Les données provenant des expériences qRT-PCR a révélé GLO1 surexpression (≥1.5 fois) à 51 (57,3%) de tissus de cancer de l'estomac, comparativement à des tissus non cancéreux. La moyenne GLO1 expression dans les tissus tumoraux était 2,87 fois celle dans les tissus non cancéreux. Nos résultats ont confirmé une augmentation significative de l'expression GLO1 dans les tissus tumoraux ( P
= 0,005, un échantillon test de Kolmogorov-Smirnov).

Expression de la protéine GLO1 dans des échantillons appariés a encore été analysées à l'aide occidentale buvard. Figure 1A présente l'expression de GLO1 chez huit patients représentatifs. Des quantités égales de protéines totales colorées avec du bleu de Coomassie après SDS-PAGE ont été utilisés comme témoin de chargement. Tous les tissus cancéreux à partir d'échantillons de cancer gastrique (G1 à G8) affichés expression GLO1 upregulated, par rapport à appariés muqueuse adjacente noncancerous (Fig. 1A).

immunocoloration démontre la protéine GLO1 sur-expression dans les tissus cancéreux gastriques

Pour établir en outre si GLO1 surexpression est corrélée avec la progression clinique du cancer gastrique, IHC a été réalisée sur les tissus de cancer gastrique paraffine fixe et adaptée muqueuse noncancerous de 114 patients. Quatre paires de cas représentatifs (a /b, c /d, e /f, g /h) sont représentés sur la figure 1B. les données IHC pour leurs homologues non cancéreuses de la muqueuse (a, c, e et g) et de tissus cancéreux (b, d, f et h) ont été comparés par paires. immunocoloration brun foncé a été principalement répandue dans les cellules cancéreuses que les niveaux de coloration étaient plus faibles dans des cellules ou des fibroblastes de tissus de cancer gastrique stromales. Une forte coloration pour GLO1 a été fréquemment observée dans les cellules tumorales gastriques avancés, contrairement à faible ou aucune coloration dans les cellules de l'épithélium gastrique normale (Fig. 1B, panneau supérieur). La coloration était plus intense aux stades de cancer gastrique avancé [de stade III de la Fig. 1B (f, h)] par rapport aux étapes I [Fig. 1B (b)] et II [Fig. 1B (d)]. Parmi les 114 patients analysés, la moyenne des notes IHC dans les tissus tumoraux était 139,8 ± 62,8, ce qui est significativement supérieure à celle (36,7 ± 40,4) dans la mise en correspondance muqueuse adjacente (n = 87) ( P
< 0,001 , Wilcoxon test). En outre, jumelé comparaison de immunoréactivité pour GLO1 (n = 87) a révélé que les scores IHC de tissus cancéreux étaient supérieurs à ceux des homologues non tumoral dans 77 (88,5%) patients, égale chez trois patients (3,4%), et plus faible dans sept patients (8,0%).

expression GLO1 et corrélations cliniques

GLO1 expression dans le tissu tumoral n'a pas été associée de façon significative avec l'âge, la localisation de la tumeur ou le type histologique (tableaux 1 et 2). Des niveaux plus élevés de GLO1 étaient évidents dans les T3 /groupes T4 où la surface séreuse de la paroi gastrique a été envahie par le cancer, par rapport à celui de T1 groupes /T2 où aucune invasion était évidente ( P
= 0,015 pour qRT - PCR et P
= 0,001 pour IHC; la figure 2A; tableaux 1 et 2).. L'expression de GLO1 a été augmenté de façon significative, avec des métastases aux ganglions lymphatiques ( P
= 0,001 pour qRT-PCR et P
< 0,001 pour IHC;. La figure 2B; tableaux 1 et 2) . expression supérieur était évidente chez les patients avec envahissement ganglionnaire ( P
= 0,001 et P
= 0,016 pour qRT-PCR et IHC respectivement; les tableaux 1 et 2) et de l'invasion périneural ( P
= 0,024 pour qRT-PCR, tableau 2). L'expression accrue de GLO1 n'a pas été associée à l'invasion vasculaire ou de métastases à distance, y compris l'ensemencement péritonéale ou des métastases du foie, dans les deux expériences qRT-PCR et IHC. L'expression de GLO1 était significativement plus élevé chez les patients présentant plusieurs stades pathologiques avancés (III /IV), du cancer gastrique, par rapport à celles des stades pathologiques précédemment (I /II) ( P = 0,001 et
P
< 0,001 pour qRT-PCR et IHC, respectivement) (figure 2C;. les tableaux 1 et 2)

Survival résultats

la durée moyenne de la période de suivi pour. 52 survivants était de 70,4 mois (extrêmes, 28-119 mois). Quatre patients sont décédés de complications postopératoires et six autres causes. Cinquante-deux patients sont décédés en raison de la progression du cancer gastrique. Le taux de survie globale cumulative de cinq ans des 114 patients était de 49,3% après gastrectomie. Pour déterminer l'influence de l'expression GLO1 sur la survie des résultats, le patient a été divisé en deux groupes, les expressions supérieures et inférieures, en fonction de la valeur de coupure qui démontrerait une différence significative (log rank P
< 0,05) les taux de survie entre les 2 groupes. La médiane (= 140), quartile supérieur (= 180 ou 75 ^{e percentile), et le quartile inférieur (= 90 ou 25 e percentile) de IHC scores de nos patients ont d'abord été testés pour déterminer les valeurs de coupure. Parmi eux, seul le quartile inférieur pourrait montrer une différence significative dans la survie des résultats. Figue. 2D illustre les courbes de survie cumulatifs des patients dans les groupes GLO1 expression inférieurs et supérieurs, répartis selon une coupure Le score IHC de 90. Le taux de survie à 5 ans des groupes d'expression GLO1 inférieure était significativement supérieure à celle des groupes d'expression plus élevés ( 69,6% vs 43,3%; log rank P
= 0,0373) dans les expériences IHC. L'analyse univariée a révélé un certain nombre de facteurs pronostiques significatifs, y compris l'état de métastase ganglionnaire, métastases à distance, l'ensemencement péritonéale, l'invasion vasculaire, invasion lymphatique, profondeur de l'invasion, le stade pathologique, les métastases du foie et de l'invasion périneural, en plus de GLO1 expression. D'autres paramètres importants sont le type histologique, taille de la tumeur et le type brut (tableau 1). En outre, dans l'analyse multivariée, les facteurs pronostiques indépendants influençant la survie des patients inclus métastase ganglionnaire (risque relatif = 5,954, IC à 95% = 1,183 à 29,977, P
= 0,031) et de métastases à distance (risque relatif = 2.464, IC à 95% = 1,030 à 5,896, P
= 0,043).}

surexpression de GLO1 dans SC-M1 améliore les activités de prolifération cellulaire, la migration et l'invasion.

Pour déterminer les effets de la sur-expression de GLO1
dans les cellules SC-M1, la prolifération cellulaire, la migration et les activités d'invasion ont été testés. Au bout de deux semaines de transfection, une expression stable de la protéine GLO1 a été établie. La figure 3A représente 2,36 fois et 2,29 fois plus élevé expression GLO1, respectivement. La prolifération cellulaire a été déterminée par comptage cellulaire et indiquée comme un pli de commande pour un maximum de cinq jours. GLO1
-overexpressing cellules exposées de manière significative ( P
< 0,01) des taux plus élevés de prolifération (1.86- ou 2,06 fois) que celles transfectées avec le vecteur de contrôle le jour 5 (figure 3B.). En outre, GLO1
-overexpressing cellules affichées de manière significative ( P
< 0,01) des taux plus élevés de migration (5.53- ou 4,57 fois) et les capacités invasives (3.7- ou 3,47 fois) que leur homologues de commande (Fig. 3C et D). Images de densité cellulaire ont été montrés pour deux contrôle et deux sur-exprimant des lignées cellulaires (panneaux de gauche sur les figures. 3C et D).

Sous-expression de GLO1 dans TSGH ou cellules AGS réduit les activités de migration cellulaire et l'invasion

Nos résultats ont confirmé une expression élevée de GLO1 dans le cancer gastrique avancé, par rapport à la muqueuse gastrique noncancerous. Pour déterminer si l'expression est associée à GLO1 invasivité des lignées cellulaires de cancer gastrique, les effets de l'épuisement GLO1 court en épingle à cheveux à l'aide (SH) des plasmides d'ARN sur des activités de l'invasion des cellules tumorales ou des cellules AGS TSGH ont été évaluées. ShRNA vecteurs d'expression codant pour la séquence anti-sens GLO1 ont été transfectés dans des lignées de cellules AGS et TSGH exprimant des niveaux élevés de GLO1 endogène. expression GLO1 était significativement réprimée dans TSGH lignées-KG1, -KG2 (0.32- et 0,14 fois) et AGS-KS1, -KS2 (0.26- et 0,21 fois), respectivement, par rapport à celle dans les cellules transfectées avec les vecteurs de contrôle ( C1, C2;. les figures 4A et B). cellules KG1 et KG2 GLO1 appauvries exposées de manière significative ( P
< 0,05) les taux de migration réduits (0.16- ou 0,044 fois, respectivement) et les capacités d'invasion (0.43- ou 0,29 fois, respectivement) que vecteur de commande les cellules transfectées (Fig. 4C et D). Des résultats similaires ont été obtenus avec les cellules AGS-KS (KS1 et KS2) (Fig. 4E et F). Nos résultats suggèrent collectivement que GLO1 régule positivement la migration et l'invasion des capacités des cellules de cancer de l'estomac.

Bas-expression des résultats GLO1 dans l'expression réduite des gènes impliqués dans les voies de métastases associées

Pour savoir si la protéine GLO1 affecte les gènes liés à la métastase, nous avons comparé l'expression du génome entier de KG2 et C1. Plusieurs gènes régulés à la hausse (≥1.5 fois) C1, par rapport à KG2, ont été sélectionnés. MetaCore ™ analyse [28] a révélé que les voies moléculaires de haut rang modifiés dans les clones KG étaient adhesion_cytokines et voies d'adhérence. Les protéines [tels que la matrice métalloprotéinase (MMP), CXCL8 et CXCL1] impliqués dans ces voies ont été régulés à la baisse sur GLO1 silencing. Parmi les voies de cytokines associées, une expression élevée de VEGF, CXCL8, CXCR2, et CXCL1 sont associés à des métastases du cancer et à la progression [8], [29]. Auparavant, le juge Daniel et al.
[30] ont rapporté que la surexpression de GLO1 pourrait améliorer cellules stromales-derived factor-1 (SDF-1), CXCR4, et l'expression de VEGF dans hypoxique endothéliale culture de cellules progénitrices en haute glucose. Par conséquent, nous avons également analysé l'expression du VEGF dans KG lignées stables.

Nous avons validé en outre les profils d'expression des protéines dans le VEGF ou les voies liées aux cytokines par analyse western blot. Les niveaux de gènes cibles, y compris CXCL1, CXCL8, CXCR2, et le VEGF, ont été significativement inhibée dans TSGH-KG lignées cellulaires stables (KG1 et KG2), par rapport aux témoins de vecteur transfectées (Fig. 5A). En outre, les niveaux de NF-kB et HIF1-α, des facteurs de transcription connus des facteurs de croissance pro-angiogéniques (par exemple CXCL8, CXCL1, et le VEGF) [31], ont été réduits dans les noyaux de TSGH kg lignées cellulaires stables , par rapport à des cellules témoins (Fig. 5A). MMP2 et MMP9, les enzymes clés pour dégradants collagène de type IV, sont soupçonnés de jouer un rôle crucial dans l'invasion tumorale et les métastases [32]. Notamment, l'épuisement des GLO1 a conduit à la suppression marquée des activités de MMP2 et MMP9 (Fig. 5B). Nos données indiquent que GLO1 régule l'activation des voies de signalisation associées à la métastase des cellules cancéreuses gastriques. Sur la base de ces résultats, nous proposons que GLO1 médie la migration des cellules de cancer de l'estomac et de l'invasion au moins partiellement médiée par l'activation de CXCL1, CXCL8 et VEGF.

IHC montre coexpression de GLO1 avec CXCL1 et des protéines CXCR2 et son sur- expression dans les tissus cancéreux gastriques

des études antérieures ont rapporté que l'interaction du récepteur de cytokine et les voies de signalisation du VEGF sont associés à des caractéristiques de malignité dans le cancer gastrique [8], [33]. Auparavant, notre groupe a montré une association significative de CXCR2 et CXCL1 surexpression (n = 116) avec la progression du cancer gastrique [8]. Toujours, dans l'analyse IHC, une corrélation positive significative a été trouvée exclusivement entre les scores de GLO1 et CXCL1 ou CXCR2 dans les tissus cancéreux (coefficient de corrélation de Spearman = 0,238 et 0,293; P
= 0,013 et P
= 0,003, respectivement). En outre, immunomarquage des coupes consécutives a révélé une expression significative de protéines GLO1, CXCL1 et CXCR2 dans les cellules épithéliales tumorales [Fig. 5C (b), (d) et (f)], contrairement à ce faible ou nulle expression dans des tissus non cancéreux [Fig. 5C (a), (c) et (e)].

Discussion

Comme la deuxième cause la plus fréquente de décès liés au cancer, le cancer gastrique reste une maladie difficile. Les données de la présente étude a démontré que la régulation positive de GLO1 dans les tissus du cancer de l'estomac est significativement associée à la progression des tumeurs et des stades avancés de la maladie. Concordante, les patients avec des niveaux de GLO1 inférieurs avaient un meilleur pronostic de la maladie. En outre, des expériences qRT-PCR et immunohistochimie révèlent une corrélation entre une expression accrue de GLO1 avec la progression tumorale locale et de l'invasion des ganglions lymphatiques. Nous avons observé une diminution marquée dans les métastases et l'invasion des capacités de GLO1-cellules déficientes, concomitantes avec des niveaux réduits de plusieurs facteurs de métastases associées, y compris VEGF, CXCL1, CXCL8, MMP et CXCR2. Dans l'étude IHC, une corrélation positive significative entre les GLO1 et les modes d'expression de CXCL1 a été observée dans les échantillons réséquées de cancer gastrique. De plus, GLO1 élevée et CXCL1 concomitante sur-expression chez les patients atteints de cancer gastrique ont été significativement corrélés avec la survie. Nos résultats fournissent des preuves directes appuyant la participation des GLO1 dans la progression du cancer de l'estomac et de la puissance par l'alternance de ses migration et l'invasion des voies en aval.

Haute expression de GLO1 a été liée à plusieurs cancers [16], [17] . Des études récentes ont suggéré un rôle essentiel de GLO1 dans plusieurs types de cancer à l'élimination de méthylglyoxal (MG), qui est considéré carcinostatique, ce qui entraîne le développement d'inhibiteurs GLO1 comme agents antitumoraux [34], [35]. Ainsi, une expression élevée de GLO1 est impliquée dans la résistance des cellules cancéreuses à l'apoptose induite par les agents anti-tumorales [36]. Sakamoto et al.
[36] a proposé GLO1 est non seulement d'une tumeur, mais aussi un marqueur de résistance aux médicaments. Systématiquement, les GLO1 knockdown-clones sont sensibles à plusieurs agents chimiothérapeutiques tels que la camptothécine, l'étoposide (données non présentées). Cliniquement, nos résultats indiquent que GLO1 est fortement exprimé dans le cancer gastrique et significativement associée à la progression des tumeurs et des stades avancés de la maladie.

altérations glycolytiques dans les cellules cancéreuses représentent une adaptation métabolique à des tumeurs hypoxiques par l'action de l'hypoxie induite par le facteur de transcription (HIF-1) [37], [38]. En outre, les facteurs de transcription, HIF1-a et de NF-kB, jouent un rôle crucial dans les divers procédés, tels que l'inflammation, la destruction microbienne et la progression du cancer [39]. Tumeur hypoxie semble être fortement associée à la propagation de la tumeur, la progression maligne, et une résistance à la thérapie. La voie HIF-1α est clairement impliqué dans la carcinogenèse du cancer gastrique [39]. En outre, l'expression des gènes cibles immunohistochimique de HIF-1α (Glut1, VEGF, CA9, iNOS) est associée à la progression de la tumeur gastrique [40]. Parmi les voies oncogéniques, la signalisation de NF-kB est élevée dans une proportion significative des cancers gastriques [9]. En outre, plusieurs lignes de soutien de preuves diaphonie entre le NF-kB et HIF-1alpha voies de signalisation [41]. Dans nos expériences, les niveaux des deux HIF-1α et NF-kB ont été réduits en noyaux sur GLO1 silençage dans des lignées cellulaires de cancer gastrique, ainsi que des gènes cibles en aval (VEGF, CXCL1, CXCL8, MMPs).

Dans notre étude, anormalement expression GLO1 élevée a été associée à des phénotypes progressives, telles que l'invasion gastrique mur, métastases ganglionnaires, stade pathologique, et l'invasion lymphatique. Précédemment, nous avons indiqué que CXCL1 élevée et CXCR2 dans le cancer gastrique est associée à la progression de la tumeur, et que le niveau de CXCL1 de plasma peut être un marqueur biologique circulant utile pour le diagnostic du cancer gastrique [8]. Ici, nous avons obtenu la preuve clinique directe d'une forte corrélation entre les profils d'expression de GLO1 et CXCL1 ou CXCR2. GLO1 expression peut être associée à l'activation des récepteurs de cytokines associées et des voies de signalisation de VEGF, ce qui représente un mécanisme potentiel pour améliorer la mobilité et la capacité invasive. Nos résultats confirment surexpression de GLO1 dans le carcinome gastrique et sa forte association avec des stades avancés et de mauvais pronostic. Des études antérieures de notre groupe ont montré que SPARC [18], CLIC1 [42], SLPI [43], CXCL1, CXCL8 et CXCR2 sont fortement exprimés et associé à un stade avancé et un mauvais pronostic du cancer gastrique [8]. Ces nouveaux biomarqueurs potentiels peuvent donc être appliquées pour améliorer la spécificité et la sensibilité du diagnostic du cancer gastrique. La poursuite du développement et la confirmation de l'utilité de ces marqueurs dans des cohortes de patients plus importants seront potentiellement conduire à des applications cliniques.

Renseignements à l'appui
Figure S1.
La spécificité de GLO1 en interne a été validée par une analyse western blot. Lapin anticorps polyclonaux anti-GLO1 (image de droite) et les sérums pré-immuns contrôle négatif (image de gauche) ont été utilisés. Le niveau de protéine GLO1 a été déterminée dans TSGH-C1 et -KG2 lignées de cellules gastriques avec l'anticorps dans la maison-GLO1. β-actine a été utilisée comme contrôle interne pour les lysats cellulaires totaux
doi:. 10.1371 /journal.pone.0034352.s001
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