PLoS ONE: Die räumliche Verteilung der LGR5 + Zellen korreliert mit Magenkrebs Progression

Abstrakte

In dieser Studie haben wir die Prävalenz, histoanatomical Verteilung und Tumor biologische Bedeutung des Wnt Zielproteins und Krebsstammzellmarker LGR5 getestet Tumoren des menschlichen Gastrointestinaltrakt. Differentielle Expression von LGR5 wurde auf Transkriptions (real-time Polymerase-Kettenreaktion) und Translationsebene untersucht (Immunhistochemie) in malignen und entsprechenden nicht-malignen Geweben von 127 Patienten mit sechs verschiedenen Primärtumorstellen, dh Speiseröhre, Magen, Leber, Bauchspeicheldrüse, Darm- und Rektum. Die klinisch-pathologische Bedeutung von LGR5 Expression wurde bei 100 Patienten mit Magenkarzinom (GC) untersucht. Nicht-neoplastische Gewebe in der Regel nur sehr wenige verstreute LGR5 beherbergte ^{+ Zellen. Die entsprechenden Karzinome der Speiseröhre, Magen, Leber, Pankreas, Kolon und Rektum zeigten signifikant mehr LGR5 + Zellen sowie deutlich höhere LGR5-mRNA im Vergleich mit dem entsprechenden nicht-neoplastischem Gewebe. Doppelfärbungsexperimente ergaben eine Coexpression mit den LGR5 putative Stammzellmarker CD44, Musashi-1 und ADAM17. Als nächstes testeten wir die Hypothese, dass die aufeinanderfolgenden Änderungen der Magen-Karzinogenese, das heißt chronische atrophische Gastritis, intestinale Metaplasie und invasives Karzinom, welche mit einer Neuverteilung der LGR5 zugeordnet sind + Zellen. Interessanterweise ist die räumliche Verteilung der LGR5 verändert: in nicht-neoplastischen Magenschleimhaut, LGR5 + Zellen vorherrschend im Schleimhauthalsbereich gefunden wurden; in intestinale Metaplasie LGR5 + Zellen wurden in der Krypta Basis lokalisiert und in GC LGR5 + Zellen an der luminalen Oberfläche vorhanden waren, das Tumorzentrum und der Invasionsfront. Die Expression von LGR5 im Tumorzentrum und Invasion vor GC korrelierte signifikant mit dem lokalen Tumorwachstum (T-Kategorie) und der Knoten Ausbreitung (N-Kategorie). Darüber hinaus Patienten mit LGR5 + GCs hatten eine kürzere mediane Überlebenszeit (28,0 ± 8,6 Monate) als Patienten mit LGR5 - GCs (54,5 ± 6,3 Monate). Unsere Ergebnisse zeigen, dass LGR5 differentiell in Magen-Darm-Tumoren exprimiert wird und dass die räumliche Verteilung der histoanatomical LGR5 + Zellen werden muss in Betracht gezogen, wenn ihre Tumor biologische Bedeutung gesucht wird}

Citation. Simon E, Petke D, Böger C, Behrens HM, Warneke V, Ebert M, et al. (2012) Die räumliche Verteilung der LGR5 ^{+ Zellen korreliert mit Magenkrebs Progression. PLoS ONE 7 (4): e35486. doi: 10.1371 /journal.pone.0035486}

Editor: Irina V. Lebedeva, Enzo Life Sciences, Inc., Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 5. Juli 2011; Akzeptiert: 16. März 2012; Veröffentlicht: 18. April 2012

Copyright: © 2012 Simon et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Autoren haben keine Unterstützung oder Finanzierung zu berichten

konkurrierende Interessen:.. Die Autoren, dass keine Interessenkonflikte bestehen erklärt haben

Einführung

Magen-Darm-Karzinome gehören zu den häufigsten bösartigen Erkrankungen sind und eine führende Ursache für Krebstod weltweit [1], [2]. Die Gründe für die schlechten Prognosen sind komplex: viele Krebserkrankungen des Magen-Darm-Trakt sind in fortgeschrittenen Stadien diagnostiziert ohne Heilbehandlung, gibt es keine verlässlichen Tumormarker, die eine frühe Diagnose oder Screening von Hochrisikogruppen zulassen. Die Behandlungsmöglichkeiten sind in lokal fortgeschrittenen und metastasierten Erkrankung beschränkt, und eine beträchtliche Anzahl von Tumoren wieder auftreten trotz anfänglicher therapeutische Reaktion [3]. Eine putative Erläuterung einer unwirksamen Therapie ist das Vorhandensein von Krebsstammzellen (CSC). Die CSC-Hypothese postuliert, dass ein Tumor ein Konglomerat heterogener Zellpopulationen ist. Nur eine Subpopulation dieses Konglomerat unterhält die Fähigkeit der Koloniebildung und damit Rezidiv und Metastasierung. CSCs sind resistent gegen eine Chemotherapie, zu Rezidiven führen, Progression und schließlich Tod des Patienten [4], [5]. Während das CSC-Modell zunehmend akzeptiert wird, Identifizierung und Bestätigung der so genannten Stammzellmarker in nativem menschlichem Gewebe ist schwierig und weitgehend fehlen. Vor kurzem hat die Leucin-reiche, G-Protein-gekoppelten Rezeptor (GPCR) und Wnt Zielgen LGR5
als neuartige Stammzellmarker des Dünndarms, des Dickdarms und in den Haarfollikeln von Mäusen identifiziert wurde [6] . Die Expression von LGR5 in mehreren anderen Organen zeigt an, dass es eine globale Marker adulter Stammzellen darstellen. Es ist jedoch wenig über seinen Ausdruck in der Leber-Magen-Darm-Trakt des Menschen bekannt.

In dieser Studie haben wir diese Lücke von Informationen zu füllen soll und testete die Hypothese, dass die Krebsstammzellmarker LGR5 hat prognostische und tumorbiologischen Bedeutung.

Materialien und Methoden

Themen

Formalin-fixierte und in Paraffin eingebetteten bösartigen und entsprechenden nicht-malignen Gewebe von 127 Patienten sechs anatomischen Stellen des umfassend Leber-Magen-Darm Darm-Trakt (zB Speiseröhre, Magen, Leber, Pankreas, Kolon und Rektum) wurden aus den Archiven der Institute für Pathologie der Christian-Albrechts-Universität zu Kiel und der Charité-Universitätsmedizin Berlin (beide Deutschland) abgerufen werden. (; Tabelle 1 1995-2008) Alle Patienten wurden entweder Universitätsklinikum Schleswig-Holstein (1997-2009) oder der Charité-Universitätsmedizin Berlin betrieben. Unfixierte, frisch gefrorenes Gewebe war von 105 dieser Patienten mit acht verschiedenen Tumorarten, dh Barrett-Adenokarzinom (9 Patienten) und Plattenepithelkarzinom (7) der Speiseröhre, Darm (19) und diffuse (21) zur Verfügung Magenkrebs geben, Adenokarzinom des Dickdarms (19) und des Rektums (20), hepatozelluläres Karzinom (HCC; 4) und Cholangiokarzinom (CC; 6). Die Patientencharakteristika sind in Tabelle 1

Eine unabhängige Serie von 487 Magenkrebs-Patienten zusammengefasst aus dem Archiv des Instituts für Pathologie der Christian-Albrechts-Universität (Tabelle 2 und Tabelle 3) abgerufen wurde. Diese Patienten hatten entweder ganz oder teilweise Gastrektomie für Adenokarzinome des Magens oder der Ösophago-Magen-Kreuzung unterzogen. Jede Resektat hatte durch ausgebildete chirurgische Pathologen histologische Untersuchung unterzogen. Die Zeit der Tod des Patienten wurde von der Epidemiologische Krebsregister
des Bundeslandes Schleswig-Holstein, Deutschland, erhalten. Follow-up-Daten der Patienten noch am Leben wurden aus dem Krankenhaus Datensätze abgerufen und durch die Hausärzte zu kontaktieren.

Ethik Statement

Alle Gewebeproben wurden als Teil eines diagnostischen oder therapeutischen Chirurgie erhalten durchgeführt, nachdem der Patient gab informierte Zustimmung geschrieben. Patienten-Proben für die Untersuchung wurden bieten pseudonymisierter und analysiert anonym, so dass keine personenbezogenen Daten werden in der Datenbank enthalten sind. Die Studie wurde von der Ethikkommission der Universitätsklinik in Kiel, Deutschland genehmigt wurde (vgl. Nummer D 453/10).

Real-time-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion
Reverse

Gesamt-RNA isoliert aus kultivierten Zellen und kryokonservierten Gewebe mit Mirvana miRNA Isolation Kit Ambion (Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland) durch eine DNase-Behandlung, gefolgt mit Turbo DNA-frei-Kit (Ambion). RNA-Qualität wurde in einem 1,5% Agarosegel bewertet. Für die cDNA-Synthese, 2 &mgr; g Gesamt-RNA wurde revers transkribiert unter Verwendung Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit (Roche Diagnostics, Mannheim, Deutschland). Gen-spezifische Primer wurden synthetisiert durch Biomers.net (Ulm, Deutschland) (Tabelle S1). Echtzeit-Reverse-Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (real-time RT-PCR) wurde die LightCyler® durchgeführt 480 Probes Master (Roche) und das LightCycler® 480-System (Roche). Die Vergleichs Ct-Werte wurden normalisiert, die der drei Housekeeping-Genen: Homo sapiens Succinat-Dehydrogenase-Komplex, der Untereinheit A, Flavoprotein (F p) (SDHA), Homo sapiens Calpain 2 (Capn2)
und Cyclophilin C ( CYCC)
. Keine Template-Kontrollen (keine cDNA in PCR) wurden für jedes Gen führen unspezifische oder genomischen Amplifikation und Primer Dimerisierung zu erkennen. Alle Experimente in Duplikaten durchgeführt.

Erzeugung und Reinigung eines anti-LGR5-Antikörper

Polyklonale Antiseren wurden gegen die carboxy-terminalen Schwanz des menschlichen LGR5 Rezeptor erzeugt. Kaninchen wurden mit drei verschiedenen Peptiden der Identität SPAYPVTESCHLSSVAFVPCL (genannt Cterm) immunisiert, RSKHPSLMSINSDDVEKQSC (genannt 11b), CSITYDLPPSSVPSPAYPVTE (genannt 12) von Pineda-abservice (Berlin, Deutschland). Monospezifische IgG wurde durch schnelle Protein-Flüssigchromatographie mit ÄKTAprime ™ -System (GE Healthcare, Uppsala, Schweden) unter Verwendung einer Protein A-Säule (GE Healthcare) gereinigt. Für alle nachfolgenden Analysen, das heißt Immunofluoreszenz, Immunzytochemie, Western-Blot und Immunhistochemie, die monospezifischen IgG-Fraktion wurde affinitätsgereinigtem gegen die immunisierenden Peptide durch den Pineda-abservice. In Dot-Blot und immunhistochemischen Untersuchungen analysiert, die monospezifischen IgG-Anti-LGR5-11b Antikörper zeigte eine hohe Affinität zusammen mit starken und spezifischen Immunfärbung. Daher wurde dieser Antikörper in dieser Studie verwendet. Die Reaktivität und Spezifität des monospezifischen Antikörpers wurde durch Western-Blot charakterisiert; Immunofluoreszenz und immunzytochemische Assays.

Plasmidkonstrukt

für LGR5 Expression Konstrukt wurde erzeugt, indem die gesamte codierende Sequenz des menschlichen LGR5
(NM_003667.2) durch PCR (Tabelle S1 Verstärken ). (-), Um das Subklonieren des amplifizierten Fragments in den Expressionsvektor pcDNA3.1 erleichtern, ist der Vorwärts-Primer enthielt eine NheI-Restriktionsstelle Adapter und der Reverse-Primer enthielt eine BamHI-Stelle und eine c-Myc-Tag, um die erfolgreiche Transfektion überprüfen. PCR-Fragmente und der pcDNA3.1 (-) Expressionsvektor wurden getrennt mit NheI und BamHI vor der Ligation mit T4-Ligase (Roche) verdaut. Das Plasmid wurde durch Spaltung mit NheI und BamHI und DNA-Sequenzierung Reaktions-Kits mit ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready, Version 2.0 (PE Applied Biosystems, Langen, Deutschland).

Zellkultur und Transfektion prüft

der menschliche Magenkrebszelllinie MKN74 wurde von der japanischen Gesundheits Science Research Ressourcenbank (Osaka, Japan) und MKN45 von der deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (Braunschweig, Deutschland) erhalten. HEK293 EBNA-Zellen wurden von Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) erworben. Die Zellen wurden in RPMI 1640 Medium (MKN74, MKN45) oder Dulbeccos Modified Eagle Medium (HEK293), ergänzt mit 10% (MKN74, HEK293) bzw. 20% (MKN45) fötales Rinderserum, 100 U /ml Penicillin und 100 ug /ml gezüchtet Streptomycin (PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich). DNA-Transfektion von HEK293 EBNA, MKN74 und MKN45 Zellen wurde unter Verwendung von Lipofectamin LTX-Reagenz (Invitrogen) erfolgt nach den Anweisungen des Herstellers. Kurz gesagt, wurden Zellen in Sechs-Well-Platten kultiviert. Stabile Transfektion von MKN74 und MKN45 mit Expressionsplasmiden durchgeführt wurde, wie zuvor beschrieben [7]. Für die transiente Transfektion von HEK293-Zellen 1 &mgr; g Plasmid-DNA und 5 &mgr; l Lipofectamine LTX Reagenz wurden in 500 ul Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium ohne Serum verdünnt. Nach Inkubation für 30 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Mischung in HEK293 Zellen gegeben. Achtundvierzig Stunden nach der Transfektion wurden die transfizierten Zellen geerntet und RNA oder Proteine ​​wurden isoliert. Die Zellen mit dem Vektor pcDNA3.1 transfiziert (-) allein und untransfizierten Zellen dienten als negative Kontrollen

Immunofluoreszenz

Vierundzwanzig Stunden nach auf CultureSlides (BD Biosciences, Erembodegem, Belgien) Impfen. Zellen wurden mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen, in 7.03 acetone:methanol fixiert (20 min -20 ° C) und anschließend mit 0,1% Triton-X (5 Minuten, Raumtemperatur) permeabilisiert. Die Objektträger wurden dann mit c-Myc monoklonalen Maus-Antikörper (Clontech, Mountain View, CA, USA) über Nacht bei 5 ° C in einer feuchten Kammer inkubiert, gefolgt von einem anti-Maus-Alexa Fluor 555 konjugierten sekundären Antikörper (Invitrogen). Zu erkennen wurden die erfolgreiche Transfektion von LGR5, Zellen mit anti-LGR5-Antikörper, gefolgt von einem Anti-Kaninchen-Sekundär-Antikörper, konjugiert mit Alexa Fluor 488 (Invitrogen), die jeweils für eine Stunde bei Raumtemperatur. Das Weglassen der primären Antikörper auf LGR5 HEK293 EBNA-Zellen als negative Kontrolle diente. Montage und Gegenfärbelösung erfolgte mit Vectashield Hart-Set mit DAPI (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA).

Immunzytochemie

immunzytochemische Färbung auf Formalin-fixierten durchgeführt wurde, Paraffin- MKN45 Magenkrebszellen eingebettet sind. Zu diesem Zweck wurden MKN45-Zellen in kleinen Agarosekügelchen eingebettet, wie zuvor beschrieben [8]. Weiterverarbeitung und Immunfärbung mit Anti-LGR5-Antikörper (Verdünnung 1:1000) wurde durchgeführt nach der immunhistochemischen Analysen von humanen Gewebeschnitten (siehe unten). Das Weglassen des primären Antikörpers auf LGR5 transfizierten MKN45 Zellen als negative Kontrolle diente, während die Spezifität der anti-LGR5-Antikörper-Färbung durch Inkubation des Antikörpers mit dem immunisierenden Peptid blockiert wurde bestätigt.

Western-Blot

Protein-Lysate wurden durch Inkubation von menschlichen Magengewebe und kultivierten Zellen des Magens mit ProteoJET ™ Mammalian Cell Lysisreagenz (Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) und Protease-Inhibitor-Cocktail (Complete EDTA-frei, Roche) erhalten. Protein-Proben wurden in Laemmli-Puffer (60 mM Tris-HCl pH 6,8, 2% Natriumdodecylsulfat, 10% Glycerin, 5% β-Mercaptoethanol und 0,01% Bromphenolblau) durch Erhitzen auf 95 ° C für 10 Minuten denaturiert und wurden anschließend loaded auf 4% auf 16,5% SDS-Polyacrylamidgelen und sichtbar gemacht, indem sie mit Coomassie-blau-Färbung. Nach der Trennung Proteine ​​auf ungefärbten Polyacrylamidgele wurden auf eine Nitrocellulosemembran (Amersham, Freiburg, Deutschland) überführt, Immunoblotting mit dem Anti-LGR5-Antikörper (Verdünnung 1:20,000) und einem anti-β-Actin-Antikörper (1:10,000; klonieren AC-15, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) gleich Beladungsmengen zu gewährleisten. Membran gebundene HRP markierte sekundäre Antikörper (DakoCytomation, Glostrup, Dänemark) wurden durch verstärkte Chemilumineszenz unter Verwendung des ECL-Systems (Amersham) nachgewiesen. Das Weglassen des primären Antikörpers als negative Kontrolle diente, während die Spezifität der anti-LGR5-Antikörper-Färbung durch Inkubation des Antikörpers mit dem immunisierenden Peptid blockiert wurde bestätigt.

Histologie

Für die histologische Analysen, Gewebe- Proben wurden in 10% neutralisiert Formalin und in Paraffin eingebettet. Entparaffinierte Schnitte wurden mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) gefärbt. Magenkarzinom wurde nach der WHO-Klassifikation klassifiziert [9]. Die pTNM Phase wurde nach dem 7 bestimmt ^{th Ausgabe der Internationalen Union gegen Krebs [10].}

Tissue Micro Array Konstruktion

Formalin-fixierte und in Paraffin eingebetteten Gewebeproben waren verwendet, um Gewebemikroarrays erzeugen, wie zuvor beschrieben [11]. Vier Mikrometer Abschnitte des resultierenden Tumorgewebe Mikroarrayblocks wurden zur weiteren Analyse geschnitten. Erfolgreiche Übertragung von Tumorgewebe wurde mikroskopisch unter Verwendung von H &bestätigt haben. E-gefärbten Schnitten

Immunhistochemie

Für die Immunhistochemie, in Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Abschnitte verwendet wurden. (1:200; Novocastra Laboratories Ltd., Newcastle, GB) Immunfärbung wurde mit dem anti-LGR5-Antikörper (Verdünnung 1:1000), einem monoklonalen Antikörper gegen CD44 durchgeführt und kommerziellen polyklonalen Antikörpern gegen LGR5 (LGR5 ^{com , 1:400; Abcam, Inc., Cambridge, MA, USA), ADAM17 (Verdünnung 01.50; Sigma-Aldrich) und Musashi-1 (1:500; Chemicon international Inc., Temecula, CA, USA). Nach 20 Minuten blockiert mit Wasserstoffperoxid Block (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA), nur 5 Minuten Behandlung mit Ultra-V-Block (Thermo Scientific) und Inkubation mit dem primären Antikörper wurde in einer feuchten Kammer bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Die Objektträger wurden zwischen den Schritten mit Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) gewaschen. Immunreaktionen wurden mit dem n-Histofine Einfache Stain MAX PO-System (Nichirei Bioscience, Tokyo, Japan) und DAB-Substrat (Linaris, Wertheim-Bettingen, Deutschland) sichtbar gemacht. Für Doppelfärbung von LGR5 mit CD44, ADAM17 und Musashi-1 wurden freie Bindungsstellen mit Maus-IgG und Kaninchen-IgG-Kontrolle (Abcam), verdünnt in Antikörper-Verdünnungsmittel (Zytomed Systems, Berlin, Deutschland) nach DAB-Behandlung blockiert. Die Proben wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt. Weglassen der primären Antikörper dienten als negative Kontrollen. Nicht-neoplastische menschlichen Magen (CD44) und Hirngewebe (LGR5 com, LGR5 und Musashi-1) diente als Positivkontrolle.}

Evaluierung von Immunfärbung

Immunostaining von nicht-neoplastischen Epithel und Tumorzellen wurde durch Anlegen eines Immunreaktivität Punktesystem (IRS) erzielt. Kurz gesagt, dokumentiert der Kategorie A die Intensität der Immunfärbung als 0 (keine Immunfärbung), 1 (schwach), 2 (mittel) und 3 (stark). Kategorie B dokumentiert den Anteil der immunoreaktiven Zellen als 0 (negativ), 1 (gestreute positive Zellen; ≤1%), 2 (2-10% positive Zellen), 3 (11-50%), 4 (51-80%) und 5 (> 80%). Die Zugabe der Kategorie A und B ergab eine IRS im Bereich von 0 bis 8 für jeden Einzelfall ab. Die verteilungs Änderungen von LGR5 ^{+ Zellen in 100 whole mount Abschnitte der intestinalen Typ Magenkrebs erzielt wurde wie folgt: Die Zahl der immunoreaktiven Zellen wurde als 0 (negativ) kategorisiert, 1 (< 10 positive Zellen), 2 (10 -50-positive Zellen) und 3 (> 50 positive Zellen) getrennt für die luminale Oberfläche, Tumorzentrum und der Invasionsfront}

Statistische Analysen

Statistische Analysen der PASW Statistics mit 18 durchgeführt wurden. Statistikpaket (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Vergleiche zwischen den Gruppen wurden unter Verwendung des exakten Fisher-Test getestet. Korrelation von LGR5 Ausdruck innerhalb einer Gruppe wurde von Kendall-Tau Rang Ordnung Korrelation etabliert. Überlebenskurven wurden mit der Kaplan-Meier-Methode und Unterschiede im Überleben durch den Log-Rank-Test bewertet ausgestattet. Die Bedeutung von Korrelationen von LGR5 Expression in Primärtumoren und entsprechenden nicht-malignen Gewebe wurde durch den Wilcoxon-Test bewertet. Echtzeit-RT-PCR-Daten, die mit einem gekoppelten zweiseitigen t-Test bewertet wurden, wurde logarithmiert etwa normalverteilten Daten zu erhalten. P-Werte. ≪ 0,05 als statistisch signifikant betrachtet wurden

Ergebnisse |

LGR5-mRNA wird differentiell in Leber-Magen-Darm-Karzinomen exprimiert

LGR5 Berichten zufolge in murinen Stammzellen exprimiert wurde von die Darmkrypten [12] und wurde in Darmkrebs-Zelllinien [13] häufig überexprimiert. Um seine Expression in nicht-neoplastischen und neoplastischen menschlichen Gewebe zu untersuchen, untersuchten wir die Transkriptions Expression von LGR5 in humanen klinischen Proben, bestehend aus einer breiten Palette von Leber-Magen-Darm-Karzinome. Echtzeit-RT-PCR-Analyse wurde an einer Reihe von 105 Patienten durchgeführt, umfassend bösartige und entsprechenden nicht-malignem Gewebe, aus dem gleichen Patienten erhalten, von acht verschiedenen Tumorarten: Ösophagus [Barrett-Adenokarzinome (9 Patienten) und Plattenepithel-Karzinomen ( 7)], Magen [Darm (19) und diffusen Typ (21) Magenkarzinomen] Leber [HCC (4), CCs (6)], des Dickdarms (19) und Rektum (20; Tabelle 1)
<. p> LGR5-mRNA war signifikant unterschiedlich in Adenokarzinomen der Speiseröhre zum Ausdruck gebracht (p = 0,007), Magen [Darm-Typ (p = 0,006) und diffusen Typ (p = 0,013)] Leber [CCs (p = 0,022)], Darm- (p < 0,001) sowie Rektum (p = 0,002) im Vergleich zu dem angepaßten nicht-neoplastischen Gewebe. .

Ein polyklonaler anti-LGR5-, jedoch wurde keine differentielle Expression in Plattenepithelkarzinomen der Speiseröhre (p = 0,503) und HCCs im Vergleich zu den entsprechenden nicht-neoplastischen Geweben (Abbildung 1 p = 0,545) gefunden Antikörper erkennt menschliche LGR5 Transfektion in HEK293 und MKN45 Zellen

im Anschluss an die histoanatomical Verteilung von LGR5 in menschlichen Geweben zu erforschen und seine klinisch-pathologische Bedeutung zu untersuchen, ein LGR5-spezifischen Antikörper ausgelöst wurde, da die im Handel erhältliche Antikörper tat nicht unsere Forderungen (2A) zu erfüllen. Um auszuschließen, Kreuzreaktivität des neu erzeugten Antikörper mit den strukturell ähnlichen LGRs, LGR4 und LGR6 wir eine Sequenzabgleich mit dem National Center for Biotechnology Information
Ausrichtungswerkzeug im Voraus durchgeführt (Daten nicht gezeigt). Keine Sequenzhomologie wurde mit LGR4 oder LGR6 in dem Bereich des LGR5 Peptids ergab für die Immunisierung verwendet. Für die Auswahl eines hochspezifischen Antikörpers gegen LGR5 geklonte cDNA voller Länge wurde in HEK293-EBNA-Zellen transfiziert und als positives Ziel darstellende Immunofluoreszenz verwendet. Die LGR5 cDNA wurde direkt mit einem myc-Epitop markiert, die die Auswertung der Transfektion mit einem Anti-myc tag-Antikörpers ermöglicht. Verwendung von Immunfluoreszenz wurde der anti-myc-Tag Antikörper-Bindung nach Inkubation gefunden mit LGR5 /HEK293-Zellen, aber nicht in einem leeren Vektor transfizierten Zellen (Vektor /HEK293), nicht-transfizierte HEK293-Zellen oder in der negativen Kontrolle von LGR5 /HEK293-Zellen inkubiert mit Antikörperverdünnungsmittel anstelle des primären Antikörpers. Das gleiche Ergebnis wurde erhalten, wenn wir die Anti-LGR5-Antikörper (Abbildung 3) verwendet wird, spezifische Markierung von LGR5 demonstrieren.

Die Spezifität von LGR5-Immunmarkierung wurde weiter mit validierten Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten MKN45 Magen Krebszellen. Die Zellen wurden in einer Weise hergestellt und gefärbt, die die Verarbeitung von klinischen menschlichen Gewebeproben Parallelen. Immunzytochemische Analysen auf Paraffinschnitten eine positive Färbung von anti-LGR5-Antikörper auf MKN45 Zellen zeigte stabil mit LGR5 cDNA (LGR5 /MKN45). Stattdessen leeren Vektor transfizierten MKN45-Zellen (Vektor /MKN45) sowie die negative Kontrolle (Auslassung des primären Antikörpers) und die Peptidkontrolle (Vorinkubation des Antikörpers mit dem immunisierenden Blockierungspeptid) von LGR5 /MKN45-Zellen zeigten keine Bindung des Antikörpers (Abbildung S1).

LGR5 Protein durch anti-LGR5-Antikörper im menschlichen spezifisch nachgewiesen transfizierten MKN74 Zellen

die menschlichen Magenkrebszelllinien MKN74, bekannt, dass eine zu besitzen moderate LGR5-mRNA-Expression (Daten nicht gezeigt) und menschlichen nicht-neoplastischen Magen, sehr niedrige LGR5 Expression aufweisen (Abbildung 1) wurden gewählt, um die Reaktivität und Spezifität der anti-LGR5-Antikörper auf Proteinebene zu charakterisieren.

im Western-Blot-Analyse wurde LGR5 Protein spezifisch durch die monospezifischen anti-LGR5-Antikörper bei einer Verdünnung von 1:20,000 anerkannt. Identifiziert eine Bande mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 100 kDa in MKN74 Zelllysaten (Abbildung 4), die die Molekülmasse für LGR5 Protein berechnet einstimmt. Im Gegensatz dazu wurde keine Bande in Lysaten von menschlichen nicht-neoplastische Magengewebe nachgewiesen, die eine Kreuzreaktivität von anti-LGR5-Antikörper mit zellulären Proteinen ausschließt. In Übereinstimmung mit mRNA-Expressionsdaten, eine stärkere Expression von LGR5 Protein wurde in MKN74 Zellen stabil mit LGR5 cDNA, im Vergleich zu MKN74 Kontrolle Zellen, die mit dem leeren Vektor beobachtet. LGR5 Protein-Expression in menschlichen nichtneoplastische Magenschleimhaut war über der Nachweisgrenze von Western-Blot, keine Band anzeigt. Weglassen des anti-LGR5-Antikörper oder vorherige Inkubation des Antikörpers mit dem immunisierenden Peptid zeigt keine Proteinbanden blockiert, respectively. Nachweis von β-Actin-Protein (etwa 43 kDa; Abbildung 4) diente als Ladekontrolle und bestätigt gleichmäßig Proteinmengen in allen Spuren

LGR5 ausgedrückt in nicht-neoplastischen und neoplastischen Gewebe des hepato-gastrointestinalen geladen. Trakts

die Expression und Verteilung der histoanatomical LGR5 anschließend durch Immunhistochemie in einer Reihe von 127 Gewebeschnitten, die aus entsprechenden nicht-neoplastischen und neoplastischen Gewebe des hepato-Gastrointestinaltrakt, umfassend den Ösophagus (14 Patienten) untersucht wurde, Magen (32), Leber (24), der Bauchspeicheldrüse (17), Dickdarm (20) und des Rektums (20; Tabelle 1). Aus dieser Kohorte neoplastischen und entsprechenden nicht-neoplastischen Gewebeproben von 105 Patienten wurden auch auf der Transkriptionsebene untersucht (siehe oben).

LGR5 Ausdruck der gesamten Kohorte in 65 Fällen positiv war (51%) aller nicht-malignen Gewebe und 103 Fällen (81%) aller Krebsgewebe. Lokalisierung von LGR5 Expression wurde als hauptsächlich zytoplasmatische beobachtet, während auch eine sporadische Membran oder Kernmembran akzentuiert Ausdruck kam. Ein LGR5-Immunreaktivität wurde in allen Gewebebestandteilen, d.h. Stromazellen, Endothelzellen, Zellen in dem nicht-neoplastischen Epithels und in Krebszellen (Abbildung 5) gefunden. LGR5-Immunreaktivität in Stroma-Zellen wurde in 49 (39%) aller nicht-malignen Geweben und in 80 Fällen (63%) aller Krebsgeweben beobachtet. Ein endothelialen Immunreaktivität von LGR5 wurde in 42 Fällen (33%) aller Gewebe.

In der nicht-malignen Epithel beobachtet, LGR5 in der Regel in wenigen verstreuten Zellen nahe der Basalmembran der Magenschleimhaut Einheit gefunden wurde, Pankreasgänge und die kolorektalen Krypten. LGR5 wurde nicht in der Plattenepithel der Speiseröhre, intrahepatischen Gallengänge und Hepatozyten (Figur 6) gefunden. Für alle Gewebetypen abgesehen von Speiseröhrengewebe war der Mittelwert von IRS signifikant höher bei Tumorgewebe gegenüber dem angepassten nicht-malignen Gewebe, unsere Ergebnisse auf der Transkriptionsebene bestätigt (Tabelle 1).

LGR5 ist in verstreuten Zellen des normalen Magenschleimhaut

die Existenz von multipotenten Stammzellen, die im murinen Magen wurde von klonalen Markierungs Studien nachgewiesen. Die definitive Identifizierung dieser Zellen scheiterte bisher die Nichtverfügbarkeit von spezifischen endogenen Marker wegen [14]. Mit Serienschnitte von einer Manschettenresektion Probe erhalten, die in der Regel für die Behandlung von Übergewicht erhalten wird, und zeigten keine histologischen Anzeichen von Magenkrebs oder chronische Gastritis, suchten wir nach LGR5 ^{+ Epithelzellen. Interessanterweise zerstreuten LGR5 + Zellen wurden in der Schleimhaut Halsbereich zwischen dem foveolae und Drüsen (Abbildung 7).}

LGR5 gefunden wird koexprimiert mit anderen potentiellen Magen Stammzellen oder Vorläuferzellmarker

Stammzellen von nicht-neoplastischem Gewebe und KSZ werden üblicherweise durch die Expression von mehr als einem einzigen Stammzellmarker [15] identifiziert und validiert. Mit Immunhistochemie analysierten wir als nächstes die Co-Expression von LGR5 mit anderen mutmaßlichen CSC-Marker, das heißt ADAM17, CD44, Musashi-1 [16] - [21]. ADAM17 wurde ausgewählt, da frühere Studien ADAM17 als putative Stammzellenmarker des Magens identifiziert [8]. Immunostaining (entweder Doppelfärbung oder Färbung von Serienschnitten) wurde auf einem Magenkrebs Probe und auf gesunden nicht-entzündeten Magenschleimhaut durch Schlauchmagen-Operation erhalten durchgeführt. Im Allgemeinen zeigten nur wenige verstreute Zellen positive Immunfärbung für einen und /oder anderen vermeintlichen Stammzellmarker. Interessanterweise birgt die nichtneoplastische Magenschleimhaut-Zellen, die jeweils ADAM17 ^{+ /LGR5 + (was etwa ein Drittel aller immunoreaktive Zellen) und ADAM17 + /LGR5 - (zwei Drittel) und ADAM17 - /LGR5 + (einige verstreute Zellen; 2C-E)}

Musashi-1 (MSH-1) wurde als vermeintliche Stammzellmarker im Mausdarm beschrieben. und menschlichen Magen [18], [22] und als CSC Marker in Tumoren [23]. In neoplastischen und nicht-neoplastischen Magengewebe positiv gefärbten Zellen bestehen überwiegend aus Msh-1 ^{+ /LGR5 - (etwa zwei Drittel aller immunoreaktive Zellen), in geringerem Maße von Msh-1 + /LGR5 + (ein Drittel), und nur wenige Msh-1 - /LGR5 + Zellen (2F-H). Schließlich wird die Oberflächenmarker von Darm- und Magenkrebsstammzellen CD44 [21], [24] ergab eine Verteilung vergleichbar mit Msh-1 (Abbildung 2 I, J). Zusammenfassend Diese Ergebnisse unterstützen die Hypothese, daß unsere Anti-LGR5-Antikörper-Zellen mit Stammzellexpressionsmuster in den menschlichen Magenschleimhaut erkennt.}

Die räumliche Verteilung der LGR5 + Zellen Veränderungen während Tumorigenese

die aufeinanderfolgenden Änderungen in der Magenschleimhaut, die die Entwicklung von invasivem Krebs voraus werden als "präkanzerösen cascade" bekannt ist, erstmals 1975 beschrieben, in denen normale Magenschleimhaut durch chronische atrophische Gastritis transformiert wird und entwickelt multifokale Atrophie und intestinale Metaplasie, gefolgt von das Auftreten von Dysplasie und schließlich invasives Karzinom [25]. Als nächstes testeten wir die Hypothese, dass die oben genannten histopathologischen Veränderungen der Magenschleimhaut mit einer Neuverteilung der LGR5 ^{+ vermeintlichen Stammzellen verbunden sind. Wir untersuchten systematisch die histoanatomical Verteilung von LGR5 + Zellen in 100 Patienten mit Darm-Typ Magenkrebs. Ganze Berge Gewebeschnitte wurden verwendet, die eingeschlossen nichtneoplastische, metaplastischen und neoplastischen Krebsgewebe. Es war offensichtlich, dass die histoanatomical Verteilung von LGR5 + Zellen (7 siehe Abbildung) geändert: in nicht-neoplastischen und nicht-metaplastischen Magenschleimhaut, einige verstreute LGR5 + Zellen in der Schleimhaut Halsbereich gefunden wurden (Abbildung 7A, E). Im intestinalen Metaplasie, eine leicht erhöhte Anzahl von LGR5 + Zellen wurden am Boden der metaplastischen Krypten (7B, F) lokalisiert. Allerdings Magenkrebs in Darm-Typ die Lokalisierung und Anzahl der LGR5 + Zellen wurde auffallend verändert. In Magenkrebs, LGR5 + Zellen waren bei der luminalen Oberfläche (7C, G), im Tumorzentrum (zwischen luminalen Oberfläche und Invasionsfront) und an der Invasionsfront (Abbildung 7D). Interessanterweise die Verteilung der LGR5 + Magenkrebszellen zeigten charakteristische Muster: Die LGR5 + Zellen in kohäsive patches einer veränderlichen Anzahl von Tumorzellen erfolgte im Bereich von < 10, 10-50 und sogar > 50 Tumorzellen gebildet wird, oft Gradienten der Färbungsintensitäten abnimmt. Die gesamte Verteilung dieser LGR5 + Tumorzellflecken war uneben und inhomogen. Gemeinsam haben wir eine Zunahme der Anzahl und Intensität der LGR5 beobachtet + Zellen von nicht-neoplastischen Epithelien zu Magenkrebs unsere Real-time RT-PCR und Immunhistochemie Daten angepasst (nichtneoplastische gegen neoplastische) Patientenfällen unterstützen (siehe Tabelle 1). Unsere Ergebnisse des veränderten Verteilungsmuster von LGR5 + Zellen steht im Einklang mit jenen, die von Takeda et al. für Darmkrebs [26].}

Die Expression von LGR5 in intestinalen Typ Magenkrebs korreliert mit dem Wachstum der lokalen Tumor und Knoten Ausbreitung

Es wird postuliert, dass CSC Einfluss die Prognose eines Patienten durch ihre Fähigkeit Tumor zu bilden Kolonien Zelle, eine unverzichtbare Voraussetzung für die Metastasierung und Wiederauftreten der Krankheit. Um die Bedeutung von LGR5 für Magenkrebs erforschen, korreliert die Expression von LGR5 in intestinalen Typ Magenkrebs mit verschiedenen klinisch-pathologischen Eigenschaften der Patienten.

• PLoS ONE: Erniedrigte von Active SMAD2 Korrelieren mit einer schlechten Prognose bei Magenkrebs
• PLoS ONE: Glyoxalase-I ist ein neuartiges Prognosefaktor Verbunden mit Magenkrebs Progression