PLoS ONE: Glyoxalase-I er en roman Prognose Factor Associated med Gastric Cancer Progression

Abstract

Glyoxalase I (GLO1), en Methylglyoxal avgiftning enzym, er innblandet i utviklingen av menneskelige kreftformer. Rollen GLO1 i magekreft utvikling eller progresjon er foreløpig uklart. Uttrykket av GLO1 ble bestemt i primærmagekreft prøver ved hjelp av kvantitativ polymerase chain reaction, immunhistokjemi (IHC), og western blotting analyser. GLO1 ekspresjon var høyere i magekreft vev, sammenlignet med den i tilstøtende noncancerous vev. Forhøyet uttrykk for GLO1 var signifikant assosiert med mage veggen invasjon, lymfeknutemetastase, og patologisk stadium, noe som tyder på en ny rolle GLO1 i magekreft utvikling og progresjon. Den 5-års overlevelse av de lavere GLO1 uttrykk gruppene var signifikant større enn for de høyere uttrykk grupper (log rank P
= 0,0373) i IHC eksperimenter. Over-uttrykk for GLO1 i magekreft cellelinjer øker celleproliferasjon, migrasjon og invasivitet. Omvendt, nedregulering av GLO1 med shRNA førte til en markert reduksjon i migrasjon og invasjon evner. Våre data antyder sterkt at høyt uttrykk for GLO1 i magekreft øker metastase evne tumor celler in vitro Hotell og in vivo
, og støtte sin effekt som en potensiell markør for påvisning og prognose av magekreft

Citation. Cheng WL, Tsai MM, Tsai CY, Huang YH, Chen CY, Chi HC, et al. (2012) Glyoxalase-I er en roman Prognose Factor Associated med Gastric Cancer Progresjon. PLoS ONE 7 (3): e34352. doi: 10,1371 /journal.pone.0034352

Redaktør: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, USA

mottatt: 08.12.2011; Godkjent: 27 februar 2012; Publisert: 29 mars 2012

Copyright: © 2012 Cheng et al. Dette er en åpen-tilgang artikkelen distribueres under betingelsene i Creative Commons Attribution License, som tillater ubegrenset bruk, distribusjon og reproduksjon i ethvert medium, forutsatt den opprinnelige forfatteren og kilden krediteres

Finansiering:. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Chang-Gung University, Taoyuan, Taiwan (NMRPD 150311, NMRPD170441-42, CMRPG 640042-43, CMRPG 670291-93) og National Science Council of republikken Kina (NSC 95-2314-B-182 -027, 97-2314-B-182-009-MY2, 99-2314-B-182-022). Finansiører hadde ingen rolle i studiedesign, datainnsamling og analyse, beslutning om å publisere, eller utarbeidelse av manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklært at ingen konkurrerende interesser eksisterer

Innledning

Magekreft kreft~~POS=HEADCOMP er den fjerde vanligste kreftformen og den nest høyeste årsaken til kreft-relaterte dødelighet på verdensbasis [1]. Malignitet er den sjette største årsaken til kreft-relaterte dødsfall i Taiwan [2]. Riktig screening kan lette påvisning av magekreft før symptomutvikling på en helbredelig stadium [3]. Fastsettelse av uttrykket profiler av nøkkelmolekyler i flere veier som er involvert i magekreft progresjon kan hjelpe til diagnose, prognose og prediksjon av tumorprogresjon.

Tumor invasjon og metastasering er viktige skritt i å bestemme den aggressive fenotype av kreft hos mennesker , og utgjør de viktigste årsakene til kreft-relaterte dødsfall [4]. Høy ekspresjon av migrasjonsrelaterte faktorer, slik som cyklooksygenase 2 (COX-2) [5], vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) [6], CXC kjemokin ligand (CXCL) -8 [7], chemokine (CXC motiv) reseptor (CXCR) -2, og CXCL-1 [8], er forbundet med magekreft progresjon. Flere potensielle onkogene trasé (spredning /stamcelle, NF-kB, og Wnt /β-catenin) er deregulert i de fleste av magekreft [9]. Dermed vil ytterligere klarlegging av de nøyaktige molekylære hendelser som fører til magekreft progresjon og identifisering av verdifulle diagnostiske eller prognostiske markører og nye terapeutiske strategier være av betydelig klinisk verdi.

Glyoxalase I (også kalt GLO1) er en viktig komponent på veier som fører til avgiftning av Methylglyoxal (MG), en av sideprodukter for glykolyse [10], [11], [12]. GLO1 ekspresjon økes i flere humane kreft i tykktarm, bryst, prostata, melanom og [13], [14], [15], [16], [17]. Nyere studier har rapportert at over-ekspresjon av GLO1 er forbundet med progresjon av kreft og medikamentresistens [17]. Fra vår forrige data, ble GLO1 oppregulering observert i magekreft prøver å bruke cDNA microarray [18]. Men den spesifikke rollen GLO1 under mage tumorigenesis og klinisk betydning gjenstår å bli etablert.

Våre eksperimenter viser tydelig at GLO1 er ofte over-uttrykt i magekreft og assosiert med kreft metastasering. Spesielt, er uttrykk for GLO1 betydelig høyere i avanserte stadier av magekreft. Videre endringer uttrykk for GLO1 i magekreft cellelinjer påvirker celle migrasjon og invasjon evner.

Materialer og metoder

Etikk erklæringen

Studien protokollen ble godkjent av Medical etikk og menneske Clinical Trial komiteen av Chang Gung Memorial Hospital (IRB NO. 95-0472B). Skriftlig informert samtykke ble innhentet fra alle pasienter

Fag

De 114 pasienter (64 menn og 50 kvinner, median alder, 66 år, range 28-86 år). Diagnostisert med magekreft på Chang Gung Memorial Hospital 2000-2005 ble inkludert i denne studien. Alle pasientene fikk kirurgi for primær magekreft uten forutgående kjemoterapi eller strålebehandling. Hver pasient ble utsatt for gastrisk reseksjon (35 pasienter gjennomgikk total gastrektomi og 79 delvis gastrektomi).

Clinicopathological studier

resected prøvene ble undersøkt patologisk ved hjelp av kriteriene fra den japanske Generelle regler for Gastric Cancer Study [19] og det amerikanske Joint Committee on Cancer (AJCC) (pTNM) klassifiseringssystem [20]. Clinicopathological parametere inkludert pasientens alder og kjønn, tumor plassering og størrelse, brutto (Borrmann s) tumor type, vegg invasjon, reseksjon margin, histologisk type lymfeknutemetastaser, vaskulær invasjon, lymfatisk invasjon, og perinevral invasjon. Etter utskrivning hadde alle pasientene periodiske oppfølgingsbesøk ved poliklinisk avdeling Chang Gung Memorial Hospital inntil døden eller begynnelsen av utarbeidelsen av denne artikkelen.

Sanntids kvantitativ revers transkripsjon polymerase chain reaction (QRT-PCR )

QRT-PCR ble utført som beskrevet i en tidligere rapport [21]. De følgende primere ble anvendt: human GLO1
QRT-PCR (forover-primer, 5'-TGAGGATAAAAATGACATCCCTA- AAGA-3 ', og revers primer, 5'-TGTGTCAGCTCAAGTGTAGCTTTC-3'), humane 18S rRNA QRT-PCR (forover primer, 5'-CGAGCCGCCTGGATACC-3 ', og omvendt primer, 5'-CCTCAGTT CCGAAAACCAACAA-3').

Produksjon av anti-GLO1 antistoff

cDNA som koder for full-lengde GLO1
ble klonet i pGEX-4T1. Lysates fra E. coli BL21
stamme ble renset med glutation-agarose perler (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Løselige proteiner ble renset ved hjelp av kromatografi med glutation-agarose perler, i henhold til produsentens instruksjoner, emulgert med adjuvans, og brukes til å immunisere kaniner. Polyklonale antistoffer ble fremstilt og affinitetsrenset, som tidligere beskrevet [22]. Spesifisiteten av in-house GLO1 ble validert ved hjelp av western blot analyse (Figur S1).

immunoblotanalyse

Hele cellelysater, kjerneekstrakter, og betinget media ble fremstilt fra humant vev eller stabil GLO1 knockdown cellelinjer. Western blotting ble utført ved bruk av monoklonale antistoffer mot humant HIF-1α (Abcam, San Francisco, CA), p65 (Epitomic, Burlingame, CA), eller p50 (Millipore, Billerica, MA) eller polyklonale antistoffer mot humant GLO1 (in-house, fortynning, 1:500), CXCL1 (Peprotech Inc., Rocky Hill, New Jersey), CXCL8 (R &.. D Systems Inc., Minneapolis, MN), VEGF (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, California)

Immunohistokjemi (IHC)

Formalin-fiksert og parafininnstøpte vev ble undersøkt med IHC ved bruk av polyklonale antistoff mot humant GLO1 produsert in-house (fortynning, 1:3000) og avidin-biotin kompleks (ABC ) -metoden, som beskrevet tidligere [23], [24]. Sammenligninger ble utført mellom intensiteten av fargingen av carcinoma celler og benign overflateepitel, som ble plassert på den samme lysbilde. For semi-kvantitativ analyse av GLO-en immunoreaktivitets, ble en Histoscore (H) -scoring systemet som brukes [25]. I korthet, den negative gruppe besto av kreftceller med ingen detekterbar (-) eller kun spor farging for GLO-1 (1). Den positive gruppen besto av kreftceller med moderate (2) eller høye nivåer (+3) av GLO-en immunoreaktivitets. Den H-scoring ble beregnet og gjennomsnitt av to uavhengige patologer, blindet for den innledende score for hver pasient. Resultatene ble bedømt ved å multiplisere prosentandelen av positive celler (P) av intensiteten (I), i henhold til formelen: H = P x I. For eksempel, en seksjon i hvilken 10% av vev hadde en farging score på 1, 60% en score på 2, og 30% en score på 3, H = (10 x 1) + (60 x 2) + (30 × 3) = 220.

Etablering av GLO1 over-uttrykk i SC-M1 cellelinje

SC-M1 cellelinje som uttrykker lavere nivå av GLO1 ble brukt. Transfeksjon av GLO1
cDNA ble utført med Lipofectamine Reagens (Life Technologies, Grand Island, New York). Etter inkubasjon i 24 timer, ble cellene overført til medium som inneholder G418 for utvalget, og ble deretter brukt i spredning, migrasjon og invasjon analyser.

Etablering av GLO1 knockdown i TSGH og AGS cellelinjer

To menneskelige mage kreft cellelinjer, AGS, og TSGH, var ansatt. De korte hårnål RNA (shRNA) sekvenser målretting GLO1
(TRCN0000118630 ​​og TRCN0000118631) ble kjøpt fra National RNA interferens Kjerne Facility (Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, Taiwan). Den spesifikke undertrykkelse av GLO1 ble bekreftet ved hjelp av western blot-analyse.

celleproliferasjonsanalyse

celler (1 x 10 ^{4) ble dyrket på en 6 cm plate ved 37 ° C under 5 % CO _{2. Ved hvert tidspunkt, ble veksten av cellene bestemt ved celletelling. Resultatene er gitt som ganger endring i forhold til hver kontroll verdi.}}

In vitro
analyse av migrasjon og invasiv aktivitet

Effekten av GLO1 uttømming eller over-uttrykk på migrasjon og invasiv aktivitet av mage kreft cellelinjer ble vurdert ved hjelp av en rask in vitro
assay (Transwell teknikk), som tidligere beskrevet [26].

RNA forberedelse og microarray analyse

GLO1-stilnet klone TSGH (KG2) og kontrollcelle klone (C1) ble skylt kort med iskald PBS og lysert i TRIzol reagens (Invitrogen) for RNA ekstraksjon. Genuttrykk profiler mellom KG2 og C1 celler ble analysert med den menneskelige U133A Genechip (Affymetrix, Santa Clara, CA) i henhold til produsentens protokoll [27].

Statistisk analyse

GLO1 uttrykk hver undergruppe av clinicopatholgoical parametre i tabell 1 er uttrykt som gjennomsnitt ± standardavvik (SD) av IHC-stillingen av pasientene i denne undergruppe. Den Kolmogorov-Smirnov test er en parametrisk test for å sammenligne prøvene med en referanse sannsynlighetsfordeling. Der det er hensiktsmessig, ble Mann-Whitney U eller Fishers eksakte test brukt for sammenligninger mellom de to gruppene, mens Kruskal-Wallis eller Pearsons kji-kvadrat test ble brukt for å sammenligne mer enn to grupper. Forholdet mellom data fra de to forskjellige undersøkelser ble analysert med Spearmans korrelasjonstest. Pasientene ble fulgt til tidspunktet for manuskriptet forberedelse eller død. Kreftspesifikk overlevelse utfallet ble fastsatt ved å benytte Kaplan-Meier metoden for alle pasienter, bortsett fra dem som døde av kirurgiske komplikasjoner. Den log-rank test ble benyttet for å sammenligne den prognostiske betydningen av individuelle variabler på overlevelse. Den Cox modellen ble ansatt i multivariat analyse for å identifisere de uavhengige prediktorer for overlevelse. P
verdier. ≪ 0,05 ble vurdert som signifikante

Resultater

GLO1 mRNA og protein nivåer er oppregulert i mage kreftpasienter

Ved hjelp av cDNA microarray, vi har identifisert flere oppregulert gener fra gastrisk vev, sammenlignet med tilstøtende nontumorous vev [18]. Blant disse genene, fokuserte vi på GLO1
som molekylære mål for magekreft. Ekspresjon av GLO1 ble målt i kreftvev, og sammenlignet med det i matchet nontumorous gastrisk mucosa, ved hjelp av QRT-PCR (n = 89) (tabell 2) eller IHC (n = 114) (tabell 1). Data fra QRT-PCR eksperimenter viste GLO1 overekspresjon (≥1.5 ganger) i 51 (57,3%) av magekreft vev, sammenlignet med noncancerous vev. Gjennomsnittlig GLO1 uttrykk i tumorvev var 2,87 ganger at i noncancerous vev. Våre resultater bekrefter en betydelig økning i GLO1 uttrykk i tumorvev ( P
= 0,005, one-sample Kolmogorov-Smirnov test).

Expression of GLO1 protein i parvise prøver ble analysert videre med vestlig blotting. Figur 1A presenterer GLO1 uttrykk i åtte representative pasienter. Like mengder av de totale proteiner farget med Coomassie-blå etter SDS-PAGE ble anvendt som kontroll lasting. Alle kreft vev fra magekreft prøver (G1 til G8) vises oppregulert GLO1 uttrykk, sammenlignet med matchet noncancerous tilstøtende slimhinnen (Fig. 1a).

Farging demonstrerer GLO1 protein over-uttrykk i magekreftvevet

for ytterligere å etablere om GLO1 oppregulering er korrelert med klinisk progresjon av magekreft, ble IHC utført på parafin fast mage kreft vev og matchet noncancerous slimhinner 114 pasienter. Fire par representative tilfeller (a /b, c /d, e /f, og g /h) er vist i figur 1B. IHC data for noncancerous slimhinne kolleger (a, c, e, og g) og kreftvev (b, d, f og h) ble sammenlignet parvis. Mørkebrune farging var mest utbredt i kreftceller, mens nivåene av fargingen var lavere i stromale celler eller fibroblaster av magekreft vev. Sterk farging for GLO1 ble hyppig observert i avanserte gastrisk tumorceller, i motsetning til svak eller ingen farging i normale gastriske epitel-celler (Fig. 1B, øvre panel). Farging var mer intens på avansert ventrikkelcancer stadier [stadium III i fig. 1B (f, h)], sammenlignet med trinn I [fig. 1B (b)] og II [Fig. 1B (d)]. Blant de 114 pasientene som ble analysert, var gjennomsnittlig IHC score i tumorvev var 139,8 ± 62,8, som var betydelig større enn den (36,7 ± 40,4) i matchende tilstøtende slimhinnen (n = 87) ( P
< 0,001 , Wilcoxon signed-rank test). Videre er sammenkoblet sammenligning av immunoreaktivitet for GLO1 (n = 87) viste at IHC score av cancervev var høyere enn for de nontumorous motstykker i 77 (88,5%) pasienter, lik i tre pasienter (3,4%), og lavere i syv pasienter (8,0%).

GLO1 uttrykk og kliniske sammenhenger

GLO1 uttrykk i tumorvev ikke var signifikant assosiert med alder, tumor sted eller histologisk typen (tabell 1 og 2). Høyere nivåer av GLO1 var tydelig i T3 /T4 grupper hvor serøse overflaten av mageveggen ble invadert av kreft, sammenlignet med i T1 /T2 grupper der ingen invasjon var tydelig ( P
= 0,015 for QRT - PCR og P
= 0,001 for IHC, 2A, tabellene 1 og 2).. Uttrykk for GLO1 ble betydelig økt, med spredning til lymfeknuter ( P
= 0,001 for QRT-PCR og P
< 0,001 for IHC Fig. 2B, tabell 1 og 2) . Høyere uttrykk var tydelig hos pasienter med lymfatisk invasjon ( P
= 0,001 og P
= 0,016 for henholdsvis QRT-PCR og IHC, tabellene 1 og 2) og perinevral invasjon ( P
= 0,024 for QRT-PCR, tabell 2). Økt GLO1 uttrykk var ikke assosiert med vaskulær invasjon eller fjernmetastaser, inkludert peritoneal seeding eller levermetastaser, både QRT-PCR og IHC eksperimenter. Uttrykk for GLO1 var signifikant høyere hos pasienter med mer avanserte patologiske stadier (III /IV) av magekreft, sammenlignet med de i tidligere patologiske stadier (I /II) ( P
= 0,001 og P
< 0,001 for QRT-PCR og IHC, henholdsvis) (figur 2C,. tabell 1 og 2)

Survival utfall

den gjennomsnittlig varighet av oppfølgingsperioden for. 52 overlevende var 70,4 måneder (range, 28-119 måneder). Fire pasienter døde av postoperative komplikasjoner og seks av andre årsaker. Femtito pasienter døde på grunn av magekreft progresjon. Den totale kumulative fem års overlevelse av de 114 pasientene var 49,3% etter gastrektomi. For å bestemme innvirkningen av GLO1 uttrykk på overlevelse utfall Pasienten ble delt i to grupper, høyere og lavere uttrykk, i henhold til den grenseverdi som ville vise en signifikant forskjell (log rank P
< 0,05) i overlevelse mellom 2 grupper. Median (= 140), øvre kvartil (= 180 eller 75 ^{th persentil), og nedre kvartil (= 90 eller 25 th persentil) av IHC score til vår pasient ble først testet for å bestemme cutoff-verdier. Blant dem, kan bare den nederste kvartil viser en signifikant forskjell i overlevelse utfall. Fig. 2D illustrerer den kumulative overlevelseskurver for pasienter i de lavere og høyere uttrykk GLO1 grupper, inndelt etter en cutoff IHC poengsum på 90. 5-års overlevelse av de lavere GLO1 uttrykk gruppene var signifikant større enn for de høyere uttrykk gruppene ( 69,6% vs. 43,3%, log rank P
= 0,0373) i IHC eksperimenter. Univariat analyse beskrevet en rekke betydelige prognostiske faktorer, blant annet status av lymfeknutemetastase, fjern metastase, peritoneal såing, vaskulær invasjon, lymfatisk invasjon, dybden av invasjon, patologisk stadium, levermetastase og invasjon perinevral, i tillegg til GLO1 uttrykk. Andre viktige parametre var histologisk type tumor størrelse, og grov type (tabell 1). Videre i multivariat analyse, de uavhengige prognostiske faktorer som påvirker pasientens overlevelse inkludert lymfeknutemetastase (relativ risiko = 5,954, 95% KI = 1,183 til 29,977, P
= 0,031) og fjernmetastaser (relativ risiko = 2,464, 95% CI = 1,030 til 5,896, P
= 0,043).}

over-uttrykk for GLO1 i SC-M1 forbedrer celle spredning, migrasjon og invasjon aktiviteter.

å fastslå effekten av over-uttrykk for GLO1
i SC-M1 celler, cellevekst, migrasjon og invasjon aktiviteter ble analysert. Etter to uker med transfeksjon, ble stabil ekspresjon av GLO1 protein etablert. Figur 3A viser 2,36 ganger og 2,29 ganger høyere GLO1 uttrykk, respektivt. Celleformering ble bestemt ved celletelling, og er angitt som en fold av styre i opptil fem dager. GLO1
-overexpressing celler viste signifikant ( P
< 0,01) høyere spredningsrater (1.86- eller 2,06 ganger) enn de transfektert med kontroll vektor på dag 5 (Fig 3B.). Videre GLO1
-overexpressing celler viste signifikant ( P
< 0,01) høyere migrasjonsrater (5.53- eller 4,57 ganger) og invasive evner (3.7- eller 3.47-fold) enn deres kontroll motstykker (fig. 3C og D). Bilder av celletetthet ble vist for to kontroll og to over-uttrykker cellelinjer (venstre panel i fig. 3C og D).

Down-uttrykk for GLO1 i TSGH eller AGS cellene reduserer celle migrasjon og invasjon aktiviteter

Våre resultater bekrefter høy uttrykk for GLO1 i avansert magekreft, sammenlignet med noncancerous mageslimhinnen. For å avgjøre om GLO1 uttrykk er knyttet til invasivitet av mage kreft cellelinjer, ble effekten av GLO1 uttømming bruker kort hårnål (sh) RNA plasmider på tumorcelle invasjon aktiviteter TSGH eller AGS celler vurderes. ShRNA ekspresjonsvektorer som koder for antisens-GLO1 sekvensen ble transfektert inn i TSGH og AGS-cellelinjer som uttrykker høye nivåer av endogen GLO1. GLO1 ekspresjon ble betydelig undertrykt i TSGH-KG1, -KG2 (0.32- og 0,14 ganger) og AGS-KS1, -KS2 (0.26- og 0,21 ganger) underlinjer, sammenlignet med det i celler transfektert med kontroll vektorene ( C1, C2; fig. 4A og B). KG1 og KG2 GLO1-utarmet celler viste signifikant ( P
< 0,05) reduserte migrasjonsrater (0.16- eller 0,044 ganger henholdsvis) og invasjons evner (0.43- eller 0,29 ganger, henholdsvis) enn kontroll vektor -transfected-celler (fig. 4C og D). Lignende resultater ble oppnådd med AGS-KS celler (KS1 og KS2) (fig. 4E og F). Våre resultater kollektivt tyder på at GLO1 positivt regulerer migrasjons- og invasjons evner av mage kreftceller.

Down-uttrykk for GLO1 resultater i redusert uttrykk av gener involvert i metastaseassosierte trasé

For å finne ut om den GLO1 protein påvirker metastaserelaterte gener, vi sammenlignet genom-wide uttrykk for KG2 og C1. Flere gener oppregulert (≥1.5 ganger) i C1, sammenlignet med KG2, ble valgt. MetaCore ™ analyse [28] viste at topp-ranking molekylære stier endret i KG kloner var adhesion_cytokines og vedheft veier. Proteiner [for eksempel matriksmetalloproteinase (MMP), CXCL8, og CXCL1] involvert i disse banene ble nedregulert på GLO1 lyddemping. Blant de cytokin relatert trasé blir høy ekspresjon av VEGF, CXCL8, CXCR2, og CXCL1 assosiert med cancer metastase og progresjon [8], [29]. Tidligere Daniel J. et al.
[30] rapporterte at over-ekspresjon av GLO1 kunne forbedre stromal celle-avledet faktor-1 (SDF-1), CXCR4, og VEGF-ekspresjon i hypoksisk endoteliale forløperceller kultur i høy glukose. Derfor har vi også analysert uttrykket av VEGF i KG stabile linjer.

Vi ytterligere validert uttrykk mønstre av proteiner i VEGF eller cytokin-relaterte trasé via western blot analyse. Nivåene av målgener, inkludert CXCL1, CXCL8, CXCR2, og VEGF, ble signifikant hemmet i TSGH-KG stabile cellelinjer (KG1 og KG2), sammenlignet med vektor-transfiserte kontroller (fig. 5A). Videre er nivåene av NF-kB og HIF1-α, kjente transkripsjonsfaktorer av pro-angiogene vekstfaktorer (slik som CXCL8, CXCL1, og VEGF) [31], ble redusert i kjernen av TSGH-KG stabile cellelinjer sammenlignet med kontrollceller (fig. 5A). MMP2 og MMP9, de viktigste enzymer for degraderende type IV kollagen, antas å spille en avgjørende rolle i tumorinvasjon og metastase [32]. Spesielt, uttømming av GLO1 førte til markert undertrykkelse av MMP2 og MMP9 aktiviteter (Fig. 5B). Våre data indikerer at GLO1 regulerer aktiveringen av metastaseassosierte signaliseringsbaner i magekreftceller. Basert på disse funnene, foreslår vi at GLO1 formidler magekreft celle migrasjon og invasjon i det minste delvis mediert gjennom aktivering av CXCL1, CXCL8, og VEGF.

IHC viser koekspresjon av GLO1 med CXCL1 og CXCR2 proteiner og dens over- uttrykk i magekreftvevet

Tidligere studier har rapportert at cytokin reseptor interaksjon og VEGF signalveiene er assosiert med malignitet funksjoner i magekreft [8], [33]. Tidligere vår gruppe viste en signifikant sammenheng med CXCR2 og CXCL1 over-uttrykk (n = 116) med magekreft progresjon [8]. Konsekvent, i IHC analyse, ble en positiv signifikant korrelasjon funnet utelukkende mellom resultatet av GLO1 og CXCL1 eller CXCR2 i kreftvev (Spearmans korrelasjonskoeffisient = 0,238 og 0,293, P
= 0,013 og P
= 0,003, respektivt). Videre farging av påfølgende seksjoner avdekket betydelig uttrykk for GLO1, CXCL1, og CXCR2 proteiner i tumor epitelceller [Fig. 5C (b), (d) og (f)], i motsetning til ingen eller lav ekspresjon i noncancerous vev [fig. 5C (a), (c) og (e)].

Diskusjoner

Som den nest hyppigste årsaken til kreft-dødsfall fortsatt magekreft en utfordrende sykdom. Data fra denne studien viste at oppregulering av GLO1 i magekreft vev er signifikant assosiert med tumorprogresjon og fremskredne stadier av sykdommen. Concordantly, pasienter med lavere GLO1 nivåer hadde bedre sykdom prognose. Videre QRT-PCR og IHC eksperimenter avslørt en sammenheng med økt GLO1 uttrykk med lokal tumorprogresjon og lymfeknute invasjonen. Vi observerte en markert nedgang i metastase og invasjons evner GLO1 fattige celler, samtidig behandling med reduserte nivåer av flere metastaseassosierte faktorer, inkludert VEGF, CXCL1, CXCL8, MMP og CXCR2. I IHC studien ble det observert en positiv signifikant korrelasjon mellom GLO1 og CXCL1 uttrykk mønstre i resected eksemplarer av magekreft. Videre forhøyet GLO1 og samtidig CXCL1 over-uttrykk hos pasienter med magekreft var signifikant korrelert med overlevelse. Våre resultater gir direkte bevis som støtter involvering av GLO1 i magekreft progresjon og makt gjennom veksling av nedstrøms migrasjon og invasjon veier.

Høy uttrykk for GLO1 har vært knyttet til flere typer kreft [16], [17] . Nylige studier har antydet en vital rolle GLO1 i flere krefttyper i fjerning av Methylglyoxal (MG), som er ansett carcinostatic, noe som resulterer i utvikling av GLO1 inhibitorer som anti-tumormidler [34], [35]. Således er høy ekspresjon av GLO1 involvert i kreftcellen resistens mot apoptose indusert av antitumormidler [36]. Sakamoto et al.
[36] foreslått at GLO1 er ikke bare en svulst, men også en medikamentresistensmarkør. Gjennomgående, de GLO1 knockdown-kloner var følsomme for flere kjemoterapeutiske midler slik som camptothecin, etoposid (data ikke vist). Klinisk våre resultater indikerer at GLO1 er sterkt uttrykt i magekreft og signifikant assosiert med tumorprogresjon og fremskredne stadier av sykdommen.

glykolytiske forandringer i kreftcellene utgjør et metabolsk tilpasning til hypoksiske tumorer via virkningen av hypoksi- indusert transkripsjon faktor (HIF-1) [37], [38]. I tillegg er de transkripsjonsfaktorer, HIF1-a og NF-kB, spiller viktige roller i forskjellige prosesser, slik som inflammasjon, mikrobiell dreping og progresjon av kreft [39]. Tumor hypoksi ser ut til å være sterkt assosiert med tumorutbredelse, ondartet progresjon, og resistens overfor terapi. Den HIF-1α veien er tydelig involvert i kreftutvikling av magekreft [39]. I tillegg er immunohistokjemisk ekspresjon av HIF-1α målgener (Glut1, VEGF, CA9, iNOS) forbundet med gastrisk tumorprogresjon [40]. Blant de onkogene trasé, er NF-kB signale forhøyet i en vesentlig del av mage-kreft [9]. Dessuten flere bevislinjer støtte krysstale mellom NF-kB og HIF-1a signalveier [41]. I våre forsøk, ble nivåene av både HIF-1α og NF-kB redusert i kjerner på GLO1 stanse i mage kreft cellelinjer, sammen med nedstrøms målgener (VEGF, CXCL1, CXCL8, MMP).

I vår studie, unormalt forhøyet GLO1 ekspresjon var assosiert med progressive fenotyper, slik som gastrisk vegg invasjon, lymfeknutemetastase, patologisk stadium, og lymfatiske invasjon. Tidligere rapporterte vi at forhøyede CXCL1 og CXCR2 i magekreft er assosiert med tumorprogresjon, og at plasma CXCL1 Nivået kan være en nyttig sirkulerende biomarkør for magekreftdiagnostikk [8]. Her har vi fått direkte kliniske tegn på en sterk sammenheng mellom uttrykk mønstre av GLO1 og CXCL1 eller CXCR2. GLO1 ekspresjon kan være assosiert med aktivering av cytokin-reseptor-assosiert og VEGF signalveier, som representerer en potensiell mekanisme for økt bevegelighet og invasive egenskaper. Våre resultater bekrefter over-uttrykk for GLO1 i magekreft og sin sterke tilknytning til avanserte stadier og dårlig prognose. Tidligere studier av vår gruppe har vist at SPARC [18], CLIC1 [42], SLPI [43], CXCL1, CXCL8, og CXCR2 er høyt uttrykt og assosiert med avanserte stadier og dårlig prognose av magekreft [8]. Disse nye potensielle biomarkører kan derfor anvendes for å forbedre spesifisiteten og sensitiviteten av magekreftdiagnose. Videreutvikling og bekreftelse av nytten av disse markørene i større pasientkullene vil potensielt føre til kliniske anvendelser.

Hjelpemiddel Informasjon
Figur S1.
spesifisitet av in-house GLO1 ble validert av western blot analyse. Kanin polyklonale anti-GLO1 antistoff (høyre bilde) og negativ kontroll pre-immun sera (venstre bilde) ble brukt. Den GLO1 protein nivå ble bestemt i TSGH-C1 og -KG2 mage cellelinjer med in-house GLO1 antistoff. β-actin ble brukt som en intern kontroll for totale cellelysater
doi:. 10,1371 /journal.pone.0034352.s001 plakater (TIF)

• PLoS ONE: Den romlige fordelingen av LGR5 + Cells korrelerer med Gastric Cancer Progresjon
• PLoS ONE: Stathmin1 spiller onkogene rolle og et mål av mikroRNA-223 i Gastric Cancer