PLoS ONE: Glyoxalase-I on uusi ennuste Factor Associated kanssa mahasyövän Progression

tiivistelmä

Glyoxalase I (GLO1), joka on methylglyoxal vieroitus entsyymi, on sekaantunut etenemistä ihmisen syöpäsairauksia. Rooli GLO1 mahalaukun syövän kehittymisessä tai etenemisessä on tällä hetkellä epäselvä. Ilmentyminen GLO1 määritettiin ensisijainen mahasyövässä yksilöitä käyttämällä kvantitatiivista polymeraasiketjureaktio, immunohistokemia (IHC), ja Western blotting-analyysit. GLO1 ilme oli korkeampi mahasyövässä kudoksissa, verrattuna viereisillä noncancerous kudoksissa. Kohonnut ekspressio GLO1 oli merkitsevästi yhteydessä mahalaukun seinämän invaasio, imusolmuke etäpesäke, ja patologinen vaiheessa viittaa uutta roolia GLO1 mahasyövän kehittymisessä ja etenemisessä. 5 vuoden pysyvyys alemman GLO1 ilmaisua ryhmissä oli merkittävästi suurempi kuin korkeamman ilmaisun ryhmät (log rank P
= 0,0373) in IHC kokeissa. Yli-ilmentyminen GLO1 mahasyövän solulinjoissa lisää solujen lisääntymistä, muuttoliike ja invasiivisuus. Toisaalta, alas-säätely GLO1 kanssa shRNA johti huomattavaan vähenemiseen muuttoliikettä ja invaasion kykyjä. Tuloksemme viittaavat vahvasti siihen, että korkea ilmentyminen GLO1 mahasyövän parantaa etäpesäkkeiden kyky syöpäsolujen in vitro
ja in vivo
, ja tukevat sen tehoa mahdollisena merkki havaitsemiseksi ja ennuste mahalaukun syöpä.

Citation: Cheng WL, Tsai MM, Tsai CY, Huang YH, Chen CY, Chi HC, et al. (2012) Glyoxalase-I on uusi ennuste Factor Associated mahalaukun syövän etenemisessä. PLoS ONE 7 (3): e34352. doi: 10,1371 /journal.pone.0034352

Editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, Yhdysvallat

vastaanotettu: 08 joulukuu 2011; Hyväksytty: 27 helmikuu 2012; Julkaistu: 29 maaliskuu 2012

Copyright: © 2012 Cheng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä työ tukivat avustuksia Chang-Keinutie University, Taoyuan, Taiwan (NMRPD 150311, NMRPD170441-42, CMRPG 640042-43, CMRPG 670291-93) ja National Science neuvosto Kiinan tasavallan (NSC 95-2314-B-182 -027, 97-2314-B-182-009-My2, 99-2314-B-182-022). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahasyöpä on neljänneksi yleisin syöpä ja toiseksi korkein syöpään liittyvää kuolleisuutta maailmanlaajuisesti [1]. Maligniteetti on kuudenneksi yleisin syy syöpään liittyvien kuolemien Taiwanissa [2]. Seulontaa voi helpottaa havaitsemista mahasyöpä ennen oireiden kehityksen parannettavissa vaiheessa [3]. Määrittäminen ilmentymisen profiilien keskeisten molekyylien useita reittejä mukana mahasyövässä etenemistä voi auttaa diagnoosi, ennuste ja ennustaminen syövän etenemisen.

Kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden ovat elintärkeitä askelia määritettäessä aggressiivinen fenotyyppi ihmisen syövissä ja muodostavat pääasiallisen syövän syiden liittyvä kuolema [4]. Korkea ilmentyminen maahanmuuttoon liittyvät tekijät, kuten syklo-oksygenaasi 2 (COX-2) [5], endoteelikasvutekijä (VEGF) [6], CXC-kemokiini ligandi (CXCL) -8 [7], kemokiini (CXC-motiivin) -reseptorin (CXCR) -2, ja CXCL-1 [8], jotka liittyvät mahalaukun syövän etenemisessä. Useita mahdollisia onkogeeniset väyliä (lisäkasvu /kantasolu-, NF-KB, ja Wnt /β-kateniinin) on vapautettu useimmissa syöpien [9]. Siten edelleen selvittäminen tarkkaa molekyylitason tapahtumia, jotka johtavat syöpään etenemistä ja arvokkaiden diagnostisten tai prognostisia markkereita ja uusia terapeuttisia strategioita olisi kliinistä merkitystä.

Glyoxalase I (myös kutsutaan GLO1) on keskeinen osa on johtavia reittejä vieroitus Methylglyoxal (MG), joka on yksi sivutuotteiden glykolyysin [10], [11], [12]. GLO1 ilmentyminen lisääntyy useissa ihmisen paksusuoli-, rinta-, eturauhas-, ja melanooma [13], [14], [15], [16], [17]. Viimeaikaiset tutkimukset ovat raportoineet, että yli-ilmentyminen GLO1 liittyy syövän etenemiseen ja lääkeresistenssin [17]. Meidän edellinen data, GLO1 säätelyyn ylöspäin havaittiin mahasyövässä yksilöiden käyttäen cDNA microarray [18]. Kuitenkin erityinen rooli GLO1 aikana mahalaukun kasvaimen kehittymisen ja sen kliinistä merkitystä vielä laadittu.

Kokeilumme osoittavat selvästi, että GLO1 on usein yli-ilmentynyt mahasyövän ja liittyy syövän etäpesäkkeitä. Erityisesti ilmaus GLO1 on merkittävästi suurempi pitkälle edennyt mahasyöpä. Lisäksi muutokset ilmaus GLO1 mahasyövän solulinjoissa vaikuttaa solujen vaeltaminen ja invaasion kykyjä.

Materiaalit ja menetelmät

Ethics lausunto

tutkimusprotokolla hyväksyi Medical etiikka ja Human Clinical Trial komitean Chang Gung Memorial Hospital (IRB NO. 95-0472B). Kirjallinen suostumus saatiin kaikilta potilailta.

Oppiaineet

114 potilasta (64 miestä ja 50 naarasta, mediaani-ikä 66 vuotta välillä 28-86 vuotta) diagnosoitu mahalaukun syöpään Chang Gung Memorial Hospital 2000-2005 otettiin tässä tutkimuksessa. Kaikki potilaat saivat leikkauksen ensisijainen mahasyövän ilman edeltävää kemoterapiaa tai sädehoitoa. Kukin potilas altistettiin mahalaukun resektio (35 potilaalle tehtiin yhteensä gastrectomy ja 79 osittainen gastrectomy).

kliinis tutkimukset

resektoitiin näytteet tutkittiin patologisesti käyttäen kriteerit Japani yleiset säännöt mahasyövän Study [19] ja Amerikan sekakomitean Cancer (AJCC) (pTNM) luokitusjärjestelmä [20]. Kliinis parametrejä olivat potilaan ikä ja sukupuoli, kasvaimen sijainti ja koko, brutto (Borrmann n) kasvaimen tyyppi, seinä invaasio, resektio marginaali, histologinen tyyppi, imusolmuke etäpesäke, verisuonten invaasio, imusuonten invaasio, ja hermoa hyökkäystä. Kotiutuksen jälkeen, kaikilla potilailla oli ajoittain seurantakäynnit klo poliklinikalla Chang Gung Memorial Hospital, kunnes kuolema tai alkuun valmistelun tässä artikkelissa.

Reaaliaikainen kvantitatiivinen RT-PCR (qRT-PCR ) B

qRT-PCR suoritettiin kuten kuvattu aiemmassa raportissa [21]. Seuraavia alukkeita käytettiin: ihmisen GLO1
qRT-PCR: llä (forward-aluke, 5'-TGAGGATAAAAATGACATCCCTA- AAGA-3 ', ja reverse-aluke, 5'-TGTGTCAGCTCAAGTGTAGCTTTC-3'), ihmisen 18S rRNA qRT-PCR (forward-aluke, 5'-CGAGCCGCCTGGATACC-3 ', ja reverse-aluke, 5'-CCTCAGTT CCGAAAACCAACAA-3').

valmistus anti-GLO1 vasta-aineen

koodaava cDNA täyspitkää GLO1
kloonattiin pGEX-4T1. Lysaatit E. coli
BL21-kannan puhdistettiin kanssa glutationiagaroosihelmiin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Liukoiset proteiinit puhdistettiin käyttäen kromatografiaa, jossa glutationiagaroosihelmiin, mukaan valmistajan ohjeiden, emulgoitu adjuvanttiin, ja sitä käytettiin kaniinien immunisointiin. Polyklonaalisia vasta-aineita tuotettiin ja affiniteettipuhdistettua, kuten aiemmin on kuvattu [22]. Spesifisyys in-house GLO1 validoitiin käyttäen western blot-analyysi (kuva S1).

immunoblottianalyysi

kokosolulysaateista tumauutteet, ja ehdollinen media oli valmistettu ihmisen kudoksesta tai vakaa GLO1 knockdown solulinjat. Western blottaus suoritettiin käyttäen monoklonaalisia vasta-aineita ihmisen HIF-1α (Abcam, San Francisco, CA), p65 (Epitomic, Burlingame, CA), tai p50 (Millipore, Billerica, MA) tai polyklonaalisia vasta-aineita ihmisen GLO1 (in-house, laimennus, 1:500), CXCL1 (PeproTech. Inc., Rocky Hill, NJ), CXCL8 (R &D Systems Inc., Minneapolis, MN), VEGF (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA).

immunohistokemia (IHC) B

Formaliinifiksoidusta ja parafinoidut kudokset tutkittiin IHC käyttäen polyklonaalista vasta-ainetta ihmisen GLO1 tuotetaan talon (laimennus, 1:3000) ja avidiini-biotiini kompleksin (ABC ) menetelmällä, kuten aiemmin on kuvattu [23], [24]. Vertailut tehtiin välillä intensiteetti värjäytymisen masoluja ja hyvänlaatuinen pintaepiteelissä, jotka on saatettu samaan dia. Sillä puolikvantitatiivinen analyysi GLO-1 immunoreaktiivisuus, joka on Histoscore (H) -scoring järjestelmää käytettiin [25]. Lyhyesti, negatiivinen ryhmä koostui syöpäsolujen ilman havaittavaa (-) tai vain pieniä värjäystä varten GLO-1 (+1). Positiivinen ryhmä koostui syöpäsolujen, joilla on kohtalainen (+2) tai korkea (+3) ja GLO-1 immunoreaktiivisuus. H-pisteytys laskettiin ja keskimäärin kaksi riippumatonta patologia, sokaisi alkuperäiseen pisteet kullekin potilaalle. Tulokset pisteytettiin kertomalla positiivisten solujen prosenttiosuuden (P), jonka intensiteetti (I), seuraavan kaavan mukaisesti: H = P x I. Esimerkiksi osio joka 10% kudoksesta oli värjäys pisteet +1, 60% pisteet +2, ja 30% pisteet +3, H = (10 x 1) + (60 x 2) + (30 x 3) = 220.

perustaminen GLO1 yli-ilmentyminen in SC-M1 solulinjan

SC-M1 joka ilmentää vähäisempää GLO1 käytettiin. Transfektio GLO1
cDNA tehtiin lipofektamiinireagenssia (Life Technologies, Grand Island, NY). Kun oli inkuboitu 24 tuntia, solut siirrettiin väliaineeseen, joka sisälsi G418 valintaa, ja käytettiin sitten solujen lisääntymisen, migraation ja invaasion määritykset.

perustaminen GLO1 Knockdown vuonna TSGH ja AGS solulinjoja

Kaksi ihmisen mahasyövän solulinjoissa, AGS, ja TSGH, oli työssä. Lyhyen hiusneula-RNA (shRNA) sekvenssit kohdistaminen GLO1
(TRCN0000118630 ​​ja TRCN0000118631) hankittiin National RNA Interference Core Facility (Institute of Molecular Biology, Academia Sinica, Taiwan). Erityinen tukahduttaminen GLO1 varmistettiin käyttämällä western blot analyysiä.

Soluproliferaatiomääritys

Solut (1 x 10 ^{4) kasvatettiin 6 cm: levy 37 ° C: ssa 5 % CO _{2. Kunakin ajankohtana, kasvuvauhti solujen määritettiin solujen laskenta. Tulokset on annettu taitteen muutos suhteessa kuhunkin vertailuarvo.}}

In vitro
määrityksessä maahanmuutto- ja invasiivisen aktiivisuuden

vaikutus GLO1 ehtyminen tai yli-ilmentymisen muuttoliike ja invasiivisen aktiivisuuden mahasyövän solulinjoissa arvioitiin käyttäen nopean in vitro
määrityksessä (TranswellTM tekniikka), kuten aiemmin on kuvattu [26].

RNA: n valmistaminen ja mikrosiruanalyysillä

GLO1-vaiennettu klooni TSGH (KG2) ja säätökennotyyppi klooni (C1) huuhdeltiin lyhyesti jääkylmällä PBS: llä ja hajotettiin TRIzol reagenssia (Invitrogen) ja RNA. Geeniekspressioprofiilien välillä KG2 ja C1 solut analysoitiin ihmisen U133A GeneChip- (Affymetrix, Santa Clara, CA) valmistajan protokollan [27].

Tilastollinen

GLO1 ilmaukset kukin alaryhmä clinicopatholgoical parametrit taulukossa 1 ilmaistaan ​​keskiarvona ± keskihajonta (SD) on IHC pisteet potilaiden tässä alaryhmässä. Kolmogorov-Smirnov testi on parametrisen testin verrata näytteitä viittauksella todennäköisyysjakauman. Tarvittaessa Mann-Whitney U tai Fisherin testiä käytettiin vertailuihin ryhmien välillä, kun taas Kruskal-Wallisin tai Pearsonin khiin neliö testiä käytettiin vertaamaan enemmän kuin kaksi ryhmää. Suhde saatuja tietoja kahdesta eri tutkimukset analysoitiin Spearmanin korrelaatio testi. Potilaita seurattiin asti käsikirjoituksen valmistelua tai kuoleman. Cancer-tautivapaalle lopputulos määritettiin soveltamalla Kaplan-Meierin menetelmällä kaikille potilaille, paitsi ne, jotka kuolivat komplikaatioita. Log-rank-testi käytettiin vertaamaan ennustetekijöiden merkitys yksittäisten muuttujien eloonjäämiseen. Coxin suhteellisten riskien mallia käytettiin Monimuuttuja-analyysissä tunnistamaan riippumattomia ennustajia selviytymisen. P
arvojen < 0,05 pidettiin merkittävinä.

Tulokset

GLO1 mRNA ja proteiini tasot yläreguloituja mahasyöpäpotilaista

Käyttäen cDNA microarray, me ovat tunnistaneet useita voimistunut geenit mahalaukun kudoksista, verrattuna viereiseen nontumorous kudoksiin [18]. Näistä geeneistä, keskityimme GLO1
kuin molekyylikohteessa mahasyövän. Expression of GLO1 mitattiin syövän kudoksissa, ja niitä verrataan, että täsmäsi nontumorous mahan limakalvoa, käyttäen qRT-PCR: ää (n = 89) (taulukko 2) tai IHC (n = 114) (taulukko 1). Tiedot qRT-PCR kokeet paljastivat GLO1 yli-ilmentymisen (≥1.5-kertaisesti) 51 (57,3%) mahalaukun syövän kudoksissa verrattuna noncancerous kudoksiin. Keskimääräinen GLO1 ilmentyminen kasvaimen kudoksissa oli 2,87-kertainen in noncancerous kudoksissa. Meidän tulokset vahvistivat merkittävä kasvu GLO1 ilmentymisen tuumorikudoksissa ( P
= 0,005, yhden otoksen Kolmogorov-Smirnov-testi).

Expression of GLO1 proteiinin pariksi näytteistä analysoitiin edelleen käyttäen western blotting. Kuva 1A esittää GLO1 ilmaisun kahdeksalla edustavasta potilaasta. Yhtä suuret määrät yhteensä proteiinien värjättiin Coomassie blue jälkeen SDS-PAGE käytettiin lastaus ohjaus. Kaikki syövän kudoksissa mahasyövän näytteistä (G1-G8) näytetään ilmen- tymisen lisääntymisen GLO1 ilmentyminen verrattuna täsmäsi noncancerous viereisen limakalvon (Fig. 1A).

Immunovärjäys osoittaa GLO1 proteiinin yli-ilmentymisen mahalaukun syöpäkudoksiin

edelleen vahvistaa, onko GLO1 säätelyä korreloi kliiniseen etenemiseen mahalaukun syövän, IHC suoritettiin parafiiniin kiinteän mahasyövän kudosten ja sovitettu noncancerous limakalvon 114 potilasta. Neljä paria edustajan tapauksissa (a /b, c /d, e /f ja g /h), on esitetty kuviossa 1B. IHC tiedot noncancerous limakalvon kollegansa (a, c, e, ja g) ja syöpä kudoksiin (b, d, f, ja h) verrattiin pareittain. Tummanruskea immunovärjäys oli lähinnä yleistä syöpäsoluissa taas taso värjäys olivat alhaisempia stroomasoluissa tai fibroblasteja mahasyövän kudoksiin. Vahva värjäys GLO1 on usein havaittu pitkälle mahakasvaimen solut, toisin kuin vähän tai ei lainkaan värjäytymistä normaaleissa mahan epiteelisoluissa (Fig. 1 B, ylempi paneeli). Värjäys oli voimakkaampi on kehittynyt mahasyöpä vaiheiden [vaihe III kuviossa. 1B (f, h)], verrattuna vaiheissa I [Fig. 1B (b)] ja II [Fig. 1B (d)]. Niistä 114 potilasta analysoitiin, keskimääräinen IHC pisteet kasvainkudoksissa oli 139,8 ± 62,8, mikä oli merkittävästi suurempi kuin (36,7 ± 40,4) vastaavanvärisiin viereisen limakalvon (n = 87) ( P
< 0,001 , Wilcoxonin-rank-testi). Lisäksi pariksi vertailu immunoreaktiivisuus GLO1 (n = 87) osoitti, että IHC tulokset syöpäkudoksen olivat korkeammat kuin on nontumorous vastaavien 77 (88,5%) potilaista, yhtä potilasta (3,4%), ja alemman seitsemän potilaalla (8,0%).

GLO1 ilmaisun ja kliininen korrelaatio

GLO1 ilmentyminen kasvainkudoksessa ei merkittävästi liittynyt iän, kasvaimen sijainnin tai histologinen tyyppi (taulukot 1 ja 2). Korkeammalla GLO1 näkyivät T3 /T4 ryhmiä, joissa herakalvon pinta mahalaukun seinämän valtasivat syöpä, verrattuna että T1 /T2 ryhmissä, joissa ei invaasiota näkyi ( P
= 0.015 varten qRT - PCR ja P
= 0,001 IHC, Fig. 2A, taulukot 1 ja 2). Expression of GLO1 oli merkittävästi lisääntynyt, metastasiaa imusolmukkeisiin ( P
= 0,001 qRT-PCR ja P
< 0,001 IHC, Fig. 2B, taulukot 1 ja 2) . Korkeampi ilme näkyi potilailla, joilla lymfaattinen invaasio ( P
= 0,001 ja P
= 0,016 varten qRT-PCR ja IHC vastaavasti, taulukot 1 ja 2) sekä hermoa invaasio ( P
= 0,024 varten qRT-PCR, taulukko 2). Lisääntynyt GLO1 ilmaisua ei liittynyt verisuonten invaasio tai kaukaisia ​​etäpesäkkeitä, myös vatsakalvon kylvö tai maksan etäpesäke, sekä qRT-PCR ja IHC kokeiluja. Expression of GLO1 oli merkittävästi suurempi potilailla, joilla kehittyneempien pathologic vaiheessa (III /IV) mahalaukun syövän, verrattuna aikaisemmassa patologi- vaiheissa (I /II) ( P
= 0,001 ja P
< 0,001 qRT-PCR ja IHC, vastaavasti) (Fig. 2C, taulukot 1 ja 2).

Survival tulosten

keskimääräinen kesto seuranta-ajan varten 52 eloonjääneet oli 70,4 kuukautta (vaihteluväli 28-119 kuukautta). Neljä potilasta kuoli leikkauksen jälkeisiä komplikaatioita ja kuusi muut syyt. Viisikymmentäkaksi potilasta kuoli johtuu mahalaukun syövän etenemisessä. Yleinen kumulatiivinen viiden vuoden eloonjäämisaste 114 potilaista oli 49,3%, kun gastrectomy. Määrittämään vaikutuksen GLO1 ilmaisun eloonjäämiseen lopputulokseen, potilas jaettiin kahteen ryhmään, korkeampi ja alempi ilmaisuja, mukaan kynnysarvon, joka osoittaa merkittävää eroa (log rank P
< 0,05) eloonjäämisluvut välissä 2 ryhmien. Mediaani (= 140), yläkvartiili (= 180 tai 75 ^{persentiilin), ja alakvartiili (= 90 tai 25 persentiilin) ​​IHC tulokset meidän potilaan alun perin testattiin määrittämään raja-arvot. Niistä vain alakvartiili voisi osoittaa merkitsevää eroa eloonjäämisen lopputulokseen. Kuva. 2D havainnollistaa kumulatiivinen eloonjäämiskäyrien potilaiden alemman ja korkeamman ilmaisun GLO1 ryhmään jaettuna mukaan sulku IHC pisteet 90. 5 vuoden pysyvyys alemman GLO1 ilmaisua ryhmissä oli merkittävästi suurempi kuin korkeamman ilmaisun ryhmiä ( 69,6% vs. 43,3%; log rank P
= 0,0373) in IHC kokeissa. Univariate analyysi paljastaa useita merkittäviä ennustetekijät, kuten tila imusolmuke etäpesäke, kaukainen etäpesäke, vatsakalvon kylvö, verisuonten invaasio, imusuonten invaasio, syvyys invaasio, patologinen vaiheessa maksa etäpesäke ja hermoa invaasio lisäksi GLO1 ilme. Muut merkittävät muuttujat olivat histologinen tyyppi, kasvaimen koon, ja brutto tyypin (taulukko 1). Edelleen Monimuuttuja-analyysissä riippumattoman ennustetekijöitä vaikuttavia elossaololuku mukana imusolmuke etäpesäke (suhteellinen riski = 5,954, 95% CI = +1,183-+29,977, P
= 0,031) ja kaukainen etäpesäke (suhteellinen riski = 2,464, 95% CI = 1,030-5,896, P
= 0,043).}

Yli-ilmentyminen GLO1 SC-M1 tehostaa solujen proliferaatiota, migraatiota ja invaasiota toimintaa.

vaikutusten määrittämiseksi yli-ilmentyminen GLO1
SC-M1-solut, solujen proliferaatiota, migraatiota, ja invaasio toiminta testattiin. Kahden viikon kuluttua transfektion, stabiili ekspressio GLO1 proteiinin perustettiin. Kuvio 3A esittää 2,36-kertaiseksi ja 2,29 kertaa suurempi GLO1 ilme, vastaavasti. Solujen lisääntyminen määritettiin solujen laskenta ja ilmaistaan ​​taittaa valvonnan enintään viisi päivää. GLO1
-overexpressing solut osoittivat merkitsevästi ( P
< 0,01) korkeampi lisääntymistä hinnat (1.86- tai 2.06-kertainen) kuin transfektoitu kontrollivektorilla päivänä 5 (Fig. 3B). Lisäksi GLO1
-overexpressing soluilla merkitsevästi ( P
< 0,01) korkeampi siirtymänopeuksien (5.53- tai 4.57-kertainen) ja invasiivisia kyvyt (3.7- tai 3.47-kertainen) kuin niiden ohjaus kollegansa (kuviot. 3C ja D). Kuvia solutiheys näytettiin kahden valvontaa ja kaksi yli-ilmentäviä solulinjoja (vasemmanpuoleiset paneelit kuvioissa. 3C ja D).

Down-ilmentyminen GLO1 vuonna TSGH tai AGS solujen vähentää solujen vaeltamiseen ja invaasiota toiminta

tulokset vahvistivat korkea ilmentyminen GLO1 vuonna edennyt mahasyöpä, verrattuna noncancerous mahan limakalvoa. Sen määrittämiseksi, onko GLO1 ilmentyminen liittyy invasiivisuus mahalaukun syövän solulinjat, vaikutukset GLO1 ehtyminen, joka käyttää lyhyen hiusneulan (sh) RNA plasmidit kasvainsolujen invaasio toimintaa TSGH tai AGS solut arvioitiin. ShRNA ekspressiovektoreita, jotka koodaavat antisense-GLO1-sekvenssi transfektoitiin TSGH ja AGS, jotka ilmentävät korkeita endogeenisten GLO1. GLO1 ilmentyminen oli merkittävästi tukahdutettu TSGH-KG1, -KG2 (0.32- ja 0,14-kertainen) ja AGS-KS1, -KS2 (0.26- ja 0,21-kertainen) alalinjoja, vastaavasti, verrattuna soluihin, jotka oli transfektoitu kontrollivektoreihin ( C1, C2, kuviot. 4A ja B). KG1 ja KG2 GLO1 vaje solujen eläintutkimuksissa merkitsevästi ( P
< 0,05) vähensi siirtymänopeuksien (0.16- tai 0,044-kertaisesti, vastaavasti) ja hyökkäys kyvyt (0.43- tai 0,29-kertaisesti, vastaavasti) kuin kontrolli vektori -transfected solut (kuviot. 4C ja D). Samanlaisia ​​tuloksia saatiin AGS-KS-solujen (KS1 ja KS2) (kuviot. 4E ja F). Tuloksemme viittaavat yhdessä siihen, että GLO1 positiivisesti säätelee muuttoliike ja hyökkäys kyvyt mahalaukun syöpäsoluja.

Down-ilmentyminen GLO1 aiheuttaa alentuneen liittyvien geenien ekspressiota in etäpesäkkeitä liittyviä reittejä

onko GLO1 proteiini vaikuttaa etäpesäkkeiden liittyviä geenejä, vertasimme genominlaajuisten ilmentymisen KG2 ja C1. Useita geenejä voimistunut (≥1.5-kertaisesti) C1, verrattuna KG2, valittiin. MetaCore ™ analyysi [28] osoitti, että kärkikastiin molekyyli reittejä muuttunut KG klooneista adhesion_cytokines ja tarttuvuus polkuja. Proteiinit [kuten matrix (MMP), CXCL8, ja CXCL1] mukana näitä väyliä olivat alassäädetty upon GLO1 hiljentäminen. Niistä sytokiini liittyvät reitit, korkea ekspressio VEGF, CXCL8, CXCR2, ja CXCL1 liittyy syövän etäpesäkkeitä ja etenemiseen [8], [29]. Aiemmin Daniel J. et al.
[30] on raportoitu, että yli-ilmentyminen GLO1 voisi parantaa stroomasolujen peräisin oleva tekijä-1 (SDF-1), CXCR4, ja VEGF: n ilmentymisen hypoksinen endoteelisolujen kantasolujen kulttuuri korkea glukoosi. Näin ollen, analysoimme myös VEGF: n ilmentymistä in KG stabiileja linjoja.

edelleen vahvisti ekspressiokuvioita proteiinien VEGF tai sytokiinin liittyvien reittien kautta western blot-analyysi. Tasot kohdegeenien, kuten CXCL1, CXCL8, CXCR2, ja VEGF, oli merkittävästi inhiboitu TSGH-KG stabiileja solulinjoja (KG1 ja KG2), verrattuna vektori transfektoitiin valvontaa (Fig. 5A). Lisäksi tasot NF-KB: n ja HIF1-α, tunnettu transkriptiotekijät pro-angiogeenisten kasvutekijöiden (kuten CXCL8, CXCL1, ja VEGF) [31], vähenivät ytimet TSGH-KG stabiileja solulinjoja verrattuna kontrolli-soluissa (kuvio. 5A). MMP2 ja MMP-9, avain entsyymit alentava tyypin IV kollageenia, uskotaan olevan keskeinen rooli kasvaimen invaasio ja etäpesäkkeiden [32]. Erityisesti ehtyminen GLO1 johti selvästi tukahduttamista MMP2 ja MMP-9 toimintaa (kuvio. 5B). Meidän tiedot osoittavat, että GLO1 säätelee aktivointi etäpesäkkeiden liittyvien signalointireittien mahalaukun syöpäsoluja. Näiden tulosten perusteella ehdotamme, että GLO1 välittää mahasyövässä solumigraatioon ja invaasiota ainakin osittain välittyvät aktivoitumisen CXCL1, CXCL8, ja VEGF.

IHC osoittaa -parin GLO1 kanssa CXCL1 ja CXCR2 proteiineja ja sen yli- ilmentyminen mahalaukun syöpäkudokset

Aiemmat tutkimukset ovat raportoineet, että sytokiinireseptorille vuorovaikutus ja VEGF signalointireitteihin liittyvät pahanlaatuisuuden ominaisuuksia mahasyövässä [8], [33]. Aiemmin ryhmämme osoitti merkittävää yhdistyksen CXCR2 ja CXCL1 yli-ilmentyminen (n = 116), jossa mahalaukun syövän etenemisessä [8]. Johdonmukaisesti, vuonna IHC analyysi, positiivinen merkittävää korrelaatiota ei havaittu yksinomaan välillä tulokset GLO1 ja CXCL1 tai CXCR2 syövän kudoksissa (Spearmanin korrelaatiokerroin = 0,238 ja 0,293; P
= 0,013 ja P
= 0,003, vastaavasti). Lisäksi immunovärjäys peräkkäistä leikettä paljasti merkittävää ilmentymistä GLO1, CXCL1, ja CXCR2 proteiineja kasvaimen epiteelisoluissa [Fig. 5C (b), (d), ja (f)], toisin lainkaan tai heikkoa ilmentymistä noncancerous kudoksissa [Fig. 5C (a), (c), ja (e)].

Keskustelu

Koska toiseksi yleisin syy syövän liittyvät kuolemat, mahasyöpä edelleen haastava sairaus. Tiedot Tässä tutkimuksessa osoitettiin, että säätelyä GLO1 mahasyövän kudoksissa liittyy merkittävästi taudin etenemiseen ja pitkälle edennyt tauti. Yhtäpitävästi, potilaat, joilla on alhaisempi GLO1 tasoilla oli parempi sairaus ennusteeseen. Lisäksi qRT-PCR ja IHC kokeiluja paljastaa korrelaatio lisääntyneen GLO1 ilmaisun paikallisten kasvainprogression ja imusolmuke hyökkäystä. Havaitsimme heikkenee huomattavasti etäpesäkkeitä ja invaasiota kyvyt GLO1-vajaiden solujen samanaikaista ja vähentäen samalla useiden etäpesäkkeiden liittyvien tekijöiden, kuten VEGF, CXCL1, CXCL8, MMP, ja CXCR2. Vuonna IHC tutkimuksessa positiivinen merkittävä korrelaatio GLO1 ja CXCL1 ilmentymismalleja havaittiin resektoitiin yksilöiden mahasyövän. Lisäksi kohonnut GLO1 ja samanaikainen CXCL1 yli-ilmentymisen potilailla, joilla on mahalaukun syövän merkittävästi korreloi selviytymisen. Tuloksemme antaa suoraa näyttöä osallistumisen tukeminen GLO1 mahalaukun syövän etenemisessä ja mahtia kautta vuorottelu sen loppupään muuttoliikkeen ja invaasion polkuja.

korkea ilmentymä GLO1 on yhdistetty useisiin syöpiin [16], [17] . Viimeaikaiset tutkimukset ovat osoittaneet, keskeinen rooli GLO1 useissa syöpätyypeissä poistossa methylglyoxal (MG), joka pidetään karsinostaattisten, jolloin kehitys GLO1 estäjien syöpälääkkeitä [34], [35]. Näin ollen, korkea ekspressio GLO1 on osallisena syöpäsolujen vastustuskyky indusoiman apoptoosin syöpälääkkeitä [36]. Sakamoto et al.
[36] ehdotetaan, että GLO1 ei ole ainoastaan ​​kasvain vaan myös lääkeresistenssimarkkeri. Johdonmukaisesti, The GLO1 pudotus-kloonit olivat herkkiä useita kemoterapia-aineisiin, kuten kamptotesiini, etoposidi (tuloksia ei ole esitetty). Kliinisesti, tuloksemme osoittavat, että GLO1 ilmentyy vahvasti mahasyövän ja merkittävästi liittyvät kasvaimen etenemiseen ja pitkälle edennyt tauti.

glykolyyttisissä muutoksia syöpäsolujen edustavat aineenvaihdunnan sopeutuminen hypoksinen kasvaimia toiminnan välityksellä hypoxia- indusoi transkriptiotekijä (HIF-1) [37], [38]. Lisäksi transkriptiotekijät, HIF1-α ja NF-KB, keskeisessä asemassa ovat erilaisia ​​prosesseja, kuten tulehdus, mikrobien tappaminen ja syövän etenemistä [39]. Kasvain hypoksia näyttää olevan voimakkaasti yhteydessä kasvain eteneminen, pahanlaatuinen etenemistä, ja kestävyys hoito. HIF-1α -systeemi selvästi mukana karsinogeneesi mahasyövän [39]. Lisäksi, immunohistokemiallinen ilmentyminen HIF-1α kohdegeenien (Glut1, VEGF, CA9, iNOS) liittyy mahalaukun syövän etenemistä [40]. Niistä onkogeeninen polkuja, NF-KB: n signalointi on kohonnut merkittävä osa mahasyöpä [9]. Lisäksi useita rivejä todisteita tuen välistä ylikuulumista NF-KB ja HIF-1α signalointireittien [41]. Meidän kokeissa tasot sekä HIF-1α: n ja NF-KB: n vähenivät ytimien päälle GLO1 hiljentäminen mahasyövän solulinjoissa, sekä alavirran kohdegeenien (VEGF, CXCL1, CXCL8, MMP).

meidän tutkimuksen epänormaalisti GLO1 ilmentyminen liittyi progressiivisen fenotyypit, kuten mahalaukun seinämän invaasio, imusolmuke etäpesäke, patologinen vaiheessa ja imusuonten hyökkäystä. Aiemmin kerroimme, että kohonnut CXCL1 ja CXCR2 mahasyövän liittyy syövän etenemiseen, ja että plasman CXCL1 taso voi olla hyödyllinen kiertävän biomarkkereiden mahasyövän diagnosointiin [8]. Tässä olemme saaneet suoraa kliinistä näyttöä vahvan korrelaation ilmaisua malleja GLO1 ja CXCL1 tai CXCR2. GLO1 ilmentyminen voi liittyä aktivaation sytokiinireseptorin liittyvien ja VEGF signalointireitteihin, jotka edustavat mahdollista mekanismi parantaa liikkuvuutta ja invasiivisen kyvyn. Tuloksemme vahvistavat yli-ilmentyminen GLO1 mahalaukun syöpä ja se liittyy läheisesti edenneessä vaiheessa ja huonon ennusteen. Aikaisemmat tutkimukset ryhmämme ovat osoittaneet, että SPARC [18], CLIC1 [42], SLPI [43], CXCL1, CXCL8, ja CXCR2 ovat erittäin ilmaistaan ​​ja liittyy pitkälle edennyt ja huonon ennusteen mahasyövän [8]. Nämä uudet potentiaaliset biomarkkereiden voidaan siis soveltaa parantaa spesifisyys ja herkkyys mahasyövän diagnoosin. Jatkokehitys ja vahvistus hyödyllisyyttä näiden merkkiaineiden suurissa potilasaineistoihin tulee mahdollisesti johtaa kliinisiin sovelluksiin.

tukeminen Information
Kuva S1.
spesifisyys in-house GLO1 validoitiin Western blot -analyysillä. Kaniinin polyklonaalista anti-GLO1-vasta-ainetta (oikea kuva) ja negatiivinen kontrolli preimmuuniseerumeilla (vasen kuva) käytettiin. GLO1 proteiini taso määritettiin TSGH-C1 ja -KG2 mahalaukun solulinjojen kanssa talon GLO1 vasta-aine. β-aktiini käytettiin sisäisenä kontrollina kokosoluliuotteista.
doi: 10,1371 /journal.pone.0034352.s001
(TIF)

• PLoS ONE: alueellisen jakautumisen LGR5 + solujen korreloi mahalaukun syövän etenemisessä
• PLoS ONE: Stathmin1 Toistaa onkogeeninen rooli ja on tavoite on MicroRNA-223 mahasyövän