PLoS ONE: Glyoxalase-I romano prognozė veiksnys, susijęs su skrandžio vėžiu Progression

Anotacija

Glyoxalase aš (GLO1) A metilglioksalio detoksikacijos fermentų, yra susijęs su žmogaus piktybinių navikų progresavimo. Iš GLO1 vaidmuo skrandžio vėžio išsivystymo ar progresuoja šiuo metu neaišku. Iš GLO1 išraiška buvo nustatytas pirminis navikas egzempliorių naudojant kiekybinį polimerazės grandininę reakciją, imunohistocheminis (IHC) ir imunoblotingu analizes. GLO1 išraiška buvo didesnis skrandžio vėžio audiniuose, palyginti su gretimų noncancerous audiniuose. Padidėjęs išraiška GLO1 buvo reikšmingai susijęs su skrandžio sienelės invazijos, limfmazgių metastazių, ir patologinės etape, o tai rodo romaną vaidmenį GLO1 skrandžio vėžio išsivystymo ir progresavimo. 5 metų išgyvenamumas apatinių GLO1 raiškos grupių buvo statistiškai reikšmingai didesnis nei didesnių saviraiškos grupių (log rank P
= 0.0373) į IHC eksperimentams. Per išraiška GLO1 skrandžio vėžio ląstelių linijų padidina ląstelių proliferaciją, migraciją ir invazinis. Priešingai, žemyn reguliavimas GLO1 su shRNR lėmė žymų migracijos ir invazija sugebėjimus. Mūsų duomenys aiškiai rodo, kad aukštos raiškos GLO1 skrandžio vėžiu padidina metastazes gebėjimas naviko ląstelės in vitro, parsisiųsti ir vivo
ir remti jų veiksmingumą, kaip galimą persekiotoją aptikti ir prognozės skrandžio vėžio

nurodomoji dalis:. Cheng skalbimų, Tsai mm, Tsai CY Huang YH Chen, CY, Či HC et al. (2012) Glyoxalase-I romano prognozė veiksnys, susijęs su skrandžio vėžiu progresavimą. PLoS vieną iš 7 (3): e34352. Doi: 10,1371 /journal.pone.0034352

redaktorius: DunFa Peng, Vanderbilt universiteto medicinos centras, Jungtinės Amerikos Valstijos

Įstojo: Gruodžio 8, 2011 m Priimta 27 vasario 2012 m Paskelbta: Kovo 29, 2012

Visos teisės saugomos: © 2012 Cheng et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Finansavimas:. Šis darbas parėmė dotacijų iš Chang-Gung universitetas, Taoyuan, Taivanas (NMRPD 150311, NMRPD170441-42, CMRPG 640.042-43, CMRPG 670.291-93) ir nacionalinio mokslo tarybos Kinijos Respublika (NSC 95-2314-B-182 -027, 97-2314-B-182-009-MY2, 99-2314-B-182-022). Į finansuotojai neturėjo vaidmenį studijų dizainas, duomenų rinkimo ir analizės, sprendimų skelbti, ar ruošiant rankraštį

konkuruojančių interesų.. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra ketvirtoji dažniausia vėžio forma ir antras didžiausias priežastis, dėl vėžio susijusio mirtingumo pasaulyje [1]. Piktybinių navikų yra šeštoji pagrindinė priežastis, dėl vėžio mirčių Taivane [2]. Tinkamas patikrinimo gali palengvinti skrandžio vėžio aptikimą prieš simptomų vystymąsi ne išgydomos etape [3]. Nustatymas ekspresijos profilius pagrindinių molekulių keliomis trasomis susijusių skrandžio vėžio progresavimą gali padėti diagnostikos, prognozės ir prognozavimas naviko progresavimo.

Naviko invazija ir metastazės yra gyvybiškai svarbūs žingsniai nustatant agresyvų fenotipą žmogaus vėžio ir yra pagrindinis priežastis vėžio susijusių mirties [4]. Aukštos išraiška migracija susijusių faktorių, tokių kaip ciklooksigenazės 2 (COX-2) [5], kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus (VEGF) [6], CXC chemokinas ligandas (CXCL) -8 [7], chemokino (CXC motyvas) receptorius (CXCR) -2, ir CXCL-1 [8], yra susiję su skrandžio vėžio progresavimo. Keli potencialūs onkogeninėmis keliai (neplatinimas /kamieninių ląstelių NF-κB ir WNT /β-kateninai) yra nereguliuojama ir skrandžio vėžio dauguma [9]. Taigi, toliau išaiškinimas tikslius molekulinius vedančia skrandžio vėžio progresavimo ir identifikavimo vertingų diagnostikos ar prognostinių žymenų ir naujų terapinių strategijų būtų labai klinikinės vertės.

Glyoxalase aš (taip pat vadinama GLO1) yra esminė į kelius pirmaujančių į metilglioksalio (Mg), vienos iš šoninių produktų glikolizės [10] [11], detoksikacija, [12]. GLO1 išraiška yra išaugo keliose žmogaus vėžio ir gaubtinės žarnos, krūties, prostatos, ir melanomos [13], [14], [15], [16], [17]. Naujausi tyrimai, pranešė, kad per išraiška GLO1 yra susijęs su vėžio progresavimo ir atsparumas vaistams [17]. Iš mūsų ankstesnių duomenų, GLO1 ląstelę buvo pastebėtas skrandžio vėžio egzempliorių naudojant kDNR mikrogardeliq [18]. Tačiau dar turi būti sudaryti konkrečią metu skrandžio Tumorigenesis vaidmuo GLO1 ir jos klinikinė reikšmė.

Mūsų eksperimentai aiškiai rodo, kad GLO1 dažnai per išreikštas skrandžio vėžio ir susijęs su vėžio metastazių. Pažymėtina, išraiška GLO1 yra žymiai didesnis stadijose skrandžio vėžio. Be to, pakeitimai iš GLO1 išraiška skrandžio vėžio ląstelių linijų paveikia ląstelių migracijos ir invazija sugebėjimus.

Medžiagos ir metodai

Etika pareiškimas

Tyrimo protokolas buvo patvirtintas medicinos etikos ir žmogaus klinikinių tyrimų komitetas Chang Gung Memorial Hospital (IRB NR. 95-0472B). Parašė informuotas sutikimas buvo gautas iš visų pacientų

Dalykai

114 pacientai (64 vyrai ir 50 moterys; vidutinis amžius, 66 metai, diapazonas 28-86 metų). Diagnozuota skrandžio vėžio ne Chang Gung memorialinė ligoninė nuo 2000 iki 2005 buvo įtraukti į šį tyrimą. Visi pacientai gavo chirurgija pirminis navikas be išankstinio chemoterapija arba radioterapija. Kiekvienas pacientas buvo atliktas skrandžio rezekcija (35 pacientai patyrė visišką pašalintas skrandis ir 79 dalinis pašalintas skrandis).

klinikos tyrimai

rezekcijos egzemplioriai buvo ištirtas patologiškai naudojantis Japonijos bendrąsias taisykles dėl skrandžio vėžiu ir tyrimo kriterijus [19] ir Amerikos Jungtinis komitetas vėžio (AJCC) (pTNM) klasifikavimo sistema [20]. Klinikos parametrai įtraukti į paciento amžių ir lytį, auglio vietą ir dydį, bruto (BORRMANN s) naviko tipą, sienos invazija, rezekcijos riba histologinis tipas, limfmazgių metastazių, kraujagyslių invazija, limfos invazija ir perineurinis invaziją. Po išleidimo, visi pacientai turėjo periodiškai tolesnius vizitus į ambulatorinio skyriaus Chang Gung Memorial Hospital iki mirties arba rengiant šį straipsnį.

Realaus laiko kiekybine atvirkštinės transkripcijos polimerazės grandininė reakcija (KRL-PGR pradžioje )

KRL-PGR buvo atliekama kaip aprašyta ankstesnėje ataskaitoje [21]. buvo naudojami šie gruntai: žmogaus GLO1
KRL-PGR (pirmyn gruntas, 5'-TGAGGATAAAAATGACATCCCTA- AAGA-3 ", ir atvirkštiniai gruntas, 5'-TGTGTCAGCTCAAGTGTAGCTTTC-3"), žmogaus 18S rRNR KRL-PGR (į priekį gruntas, 5'-CGAGCCGCCTGGATACC-3 ", ir atvirkštiniai gruntas, 5'-CCTCAGTT CCGAAAACCAACAA-3").

gamybos anti-GLO1 antikūnų

kDNR kodavimo pilnametražis GLO1
buvo klonuotas į pGEX-4T1. Fragmentai iš E. coli
BL21 padermės buvo išvalytas su glutationo agarozės karoliukai (Sigma-Aldrich, St Louis, MO). Tirpūs baltymai buvo gryninamas naudojant chromatografiją su glutationo-agarozės karoliukų, pagal gamintojo instrukcijas, emulsintų su adjuvantu, ir naudojamas imunizuoti triušių. Polikloniniai antikūnai buvo pagaminti ir giminingumo-išgrynintas, kaip aprašyta anksčiau [22]. Iš in-house GLO1 specifiškumas buvo patvirtintas naudojant Vakarų dėmė analizė (S1 paveiksle).

Imunoblotingas

Sveikos ląstelių fragmentai, branduolinių ekstraktai, ir lygtinių žiniasklaidos buvo parengta iš žmogaus audinių arba stabilios GLO1 Klojinius išardomi ląstelių linijos. Imunoblotingu buvo atliekama naudojant monokloninius antikūnus prieš žmogaus HIF-1α (Abcam, San Francisco, CA), 65 psl (Epitomic, Burlingame, CA), arba P50 (Millipore, BILLERICA, MA) ar polikloniniais antikūnų prieš žmogaus GLO1 (in-house, praskiedimo, 1:500), CXCL1 (PeproTech Inc, Rocky Hill, NJ), CXCL8 (&.. D Systems Inc, Mineapolis, MN) VEGF (Santa Krusas biotechnologijos, Santa Krusas, Kalifornija)

imunohistocheminis (IHC)

formalinu fiksuotų ir parafino įterptųjų audiniai buvo išnagrinėti su IHC naudoti polikloninis antikūnas prieš žmogaus GLO1 pagamintas in-house (skiedimo, 1:3000) ir avidino-biotino kompleksas (ABC ) metodą, kaip aprašyta anksčiau [23], [24]. Buvo lyginama atliekamas tarp dažymo karcinomos ląstelių ir gerybinės paviršinių epitelio, kurie buvo pateikti į tos pačios skaidrės intensyvumo. Pusiau kiekybinės analizės GLO-1 reaktyvumas, buvo naudojama Histoscore (H) -scoring sistema [25]. Trumpai, neigiamas grupę sudarė vėžinių ląstelių su neaptinkama (-) arba tik pėdsakai dažymo už GLO-1 (+1). Teigiamas grupę sudarė vėžinių ląstelių kartu su vidutinio stiprumo (2) arba aukšto lygio (+3) GLO-1 reaktyvumas. H rezultatyviausias buvo apskaičiuojamas ir vidutiniškai du nepriklausomi patologai, apakinti į pradinį rezultatą kiekvienam pacientui. Rezultatai buvo įmušė dauginant teigiamų ląstelių (P) pagal intensyvumo (I), procentinis santykis, pagal formulę: H = P × I. Pavyzdžiui, su sekcija, kurioje 10% audinio turėjo dažymo rezultatą lygus +1, 60% per metus +2 rezultatą, ir 30% per rezultatas +3, H = (10 × 1) + (60 × 2) + (30 × 3) = 220.

steigimas GLO1 per saviraiškos SC-M1 ląstelių linijos

buvo naudojamas SC-M1 ląstelių linija išreikšti žemesnio lygio GLO1. Iš GLO1 transfekcija
kDNR buvo atliktas su Lipofectamine reagentas (Life Technologies, Grand Island, NY). Po inkubacijos 24 h, ląstelės buvo perkelti į terpę, turinčią G418 už atranką, o po to buvo naudojami dauginimosi, migracijos ir invazija tyrimai.

steigimas GLO1 triuškinantis į TSGH ir AGS ląstelių linijų

dvi žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas, AGS, ir TSGH, dirbo. Trumpojo segtukas RNR (shRNR) sekas orientacija GLO1
(TRCN0000118630 ​​ir TRCN0000118631) buvo įsigytas iš nacionalinės RNR trukdžių Core fondo (instituto Molekulinės biologijos, "Academia Sinica, Taivanas). Konkretus represijos GLO1 buvo patvirtinta naudojant Vakarų dėmė analizė.

ląstelių proliferacija tyrimas

Ląstelės (1 × 10 ^{4) buvo auginami ant 6 cm plokštelės 37 ° C temperatūroje 5 % CO _{2. Kiekviename laiko taške, augimas iš ląstelių buvo nustatomas pagal ląstelių skaičių. Rezultatai pateikti kaip kartų kaita, palyginti su kiekvienos kontrolės vertę.}}

in vitro
analizė migracijos ir invazinę veiklos

iš GLO1 išeikvojimo ar per raiškos poveikis migracijos ir skrandžio vėžio ląstelių linijų invazinės veikla buvo vertinama naudojant greito in vitro
analizė (Transwell technika), kaip aprašyta anksčiau [26].

RNR paruošimas ir Mikrogardelė analizė

GLO1-nutildė klonas TSGH (KG2) ir kontrolinės ląstelių klonas (C1) buvo trumpai skalaujami ledinio PBS ir lizuoti į TRIzol reagento (Invitrogen) RNR ekstrakcijos. Genų ekspresijos profilius tarp KG2 ir C1 ląstelių buvo analizuojami su žmogaus U133A GeneChip (Affymetrix, Santa Clara, Kalifornija) Pasak gamintojo protokole [27].

Statistinė analizė

GLO1 išraiškos kiekvienas iš clinicopatholgoical parametrų pogrupis 1 lentelėje yra pateikti kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis (SD) į IHC rezultatas pacientų šio pogrupio. Kolmogorovo-Smirnovo testas yra neparametrinis testas palyginti mėginius nuoroda tikimybių pasiskirstymo. Jei reikia, Mann-Whitney U arba tiksli Fišerio testas buvo taikomas palyginimų tarp dviejų grupių, o Kruskal Wallis ar Pearson chi-kvadrato testas buvo naudojamas palyginti daugiau nei dvi grupes. Tarp duomenų, gautų iš dviejų skirtingų egzaminų santykiai buvo analizuojamos Spearman koreliacijos testą. Pacientai buvo stebimi iki rankraščio rengimo ar mirties metu. Vėžys konkrečių išlikimo rezultatas buvo nustatoma taikant Kaplan-Meier metodą visiems pacientams, išskyrus tuos, kurie mirė nuo chirurginių komplikacijų. Žurnalo-rank testas dirbo palyginti prognostinę reikšmę atskirų kintamųjų išlikimui. Cox proporciniai pavojai modelis dirbo Dispersinės analizės nustatyti nepriklausomi faktoriai išlikimui. P
vertės. ≪ 0,05 buvo laikomas svarbiu

Rezultatai

GLO1 iRNR ir baltymų kiekis yra aktyvinama skrandžio vėžiu sergantiems pacientams

Naudojant kDNR mikrogardeliq, mes nustatė keletą aktyvinama genus iš skrandžio audinių, palyginti su gretimų nontumorous audiniuose [18]. Tarp šių genų, mes sutelktas į GLO1
kaip molekulinės tikslo skrandžio vėžio. Išraiška GLO1 buvo matuojamas vėžiu audinių, ir palyginti su, kad suderintos nontumorous skrandžio gleivinės, naudojant KRL-PGR (n = 89), (2 lentelė) arba IHC (n = 114) (1 lentelė). Duomenys iš KRL-PGR eksperimentų parodė GLO1 raiška (≥1.5 kartus) 51 (57,3%) skrandžio vėžio audiniuose, palyginti su noncancerous audiniuose. Vidutinė GLO1 išraiška navikų audiniuose buvo 2,87 karto, kad noncancerous audiniuose. Mūsų rezultatai patvirtino labai padidėjo GLO1 išraiška navikų audiniuose ( P
= 0,005, vienas mėginys Kolmogorovo-Smirnovo testas).

toliau buvo analizuojami išraiška GLO1 baltymų suporuotas egzempliorių naudojant Vakarų sugeriamojo. 1A pav pristato GLO1 išraišką aštuonių reprezentacinių pacientams. Lygios sumos bendrųjų baltymų dažytų su Coomassie mėlyna po SDS-PAGE buvo naudojamas kaip krovimo valdymu. Visų vėžio audiniai iš skrandžio vėžio mėginių (G1 į G8) rodomas aktyvinama GLO1 išraiška, palyginti su suderinta noncancerous gretimame gleivinės (1A pav.).

imunodažymu rodo GLO1 baltymų per saviraiškos skrandžio vėžinių audinių

Jei dar nustatyti, ar GLO1 ląstelę koreliuoja su klinikiniais ligos progresavimo skrandžio vėžio, IHC buvo atliktas parafino fiksuoto skrandžio vėžio audiniuose ir suderinti noncancerous gleivinę 114 pacientų. Keturias poras reprezentatyvių atvejais (A /B, C /D, E /F ir G /h) Ar yra parodyta 1B pav. IHC duomenys noncancerous gleivinės priešiniai (a, c, e, g) ir vėžinių audinių (B, D, F, ir h) buvo palyginti poromis. Tamsiai rudos imunodažymu daugiausia buvo paplitusi vėžio ląsteles o lygiai dažant buvo mažesnis stromos ląstelių arba fibroblastų skrandžio vėžio audiniuose. Stiprus dažymo už GLO1 buvo dažnai pastebėta išplitusiu skrandžio naviko ląstelių, priešingai nei silpna arba jokios dažymo normaliomis skrandžio epitelio ląstelių (pav. 1B, viršutinė skydo). Dažymo buvo intensyvesnė ties išplitusiu skrandžio vėžiu etapais [III etapas pav. 1B (F, H)], palyginti su etapais aš [pav. 1B (b)] ir II [pav. 1B (d)]. Tarp 114 pacientų, tirtų, vidutinis IHC rezultatas naviko audiniuose buvo 139,8 ± 62,8, kuris buvo žymiai didesnis, nei (36,7 ± 40,4) ir atitikimo gretimame gleivinės (n = 87) ( P
< 0,001 , Vilkoksono prisijungę rank testas). Be to, suporuotas palyginimą reaktyvumas už GLO1 (n = 87) atskleidė, kad IHC balų vėžinių audinių buvo didesnis, nei iš nontumorous kolegomis 77 (88,5%) pacientų, lygi trijų pacientų (3,4%) ir mažesnis septynių pacientų (8,0%).

GLO1 išraiška ir klinikiniai koreliacijos

GLO1 išraiška vėžinių audinių nebuvo reikšmingai susijęs su amžiumi, naviko vietą ar histologinis tipas (1 ir 2 lentelės). Didesni GLO1 buvo akivaizdus T3 /T4 grupes, kuriose serosal paviršius skrandžio sienos buvo įsiveržė vėžiu, palyginti su T1 /T2 grupėse, kur ne invazija buvo akivaizdu ( P pervežimas = 0,015 už KRL - PGR ir P
= 0,001 IHC; pav 2A; 1 ir 2 lentelės).. Išraiška GLO1 buvo žymiai padidėjęs, su metastazėmis į limfmazgius ( P
= 0,001 KRL-PGR ir P
< 0,001 IHC,. Pav 2B; 1 ir 2 lentelėse) , Aukštojo išraiška buvo akivaizdu, pacientams, sergantiems limfinės invazijos ( P
= 0,001 ir P
= 0,016 už KRL-PGR ir IHC dalimis; 1 ir 2 lentelės) ir perineurinis invazijos ( P
= 0,024 už KRL-PGR, 2 lentelė). Padidėjęs GLO1 išraiška nebuvo susijęs su kraujagyslių invazija ar tolimoje metastazių, įskaitant pilvaplėvės sėti ar kepenų metastazėmis, abiem KRL-PGR ir IHC eksperimentams. Išraiška GLO1 buvo reikšmingai didesnis pacientams, kurių daugiau pažangių patologinių etapais (III /IV), skrandžio vėžiu, palyginti su ankstesniuose patologinių etapais (I /II) ( P
= 0,001 ir P
< 0,001 KRL-PGR ir IHC, atitinkamai) (pav 2C;. 1 ir 2 lentelėse)

išgyvenimo rezultatai

reiškia trukmė tolesnių laikotarpį. 52 išlikusieji buvo 70.4 mėnesiai (diapazonas, 28-119 mėnesių). Keturi pacientai mirė nuo pooperacinių komplikacijų ir šešių kitų priežasčių. Penkiasdešimt du pacientai mirė dėl skrandžio vėžio progresavimą. Bendras sukauptas penkerių metų išgyvenamumas 114 pacientų buvo 49,3% po pašalintas skrandis. Norėdami nustatyti GLO1 raiškos išgyvenimo rezultatus įtaką, pacientas buvo padalintas į dvi grupes, aukštesnio ir žemesnio posakių, atsižvelgiant į ribinei vertei, kuri būtų įrodyti didelį skirtumą (log rank P
< 0,05) išgyvenimo tarp 2 grupių. Mediana (= 140), viršutinių kvartilis (= 180 arba 75 ^{-asis procentilis), ir mažesnis kvartilis (= 90 arba 25 -asis procentilis) iš IHC dešimtys mūsų pacientui iš pradžių buvo bandoma nustatyti Ribinės vertės. Tarp jų, tik apatinė kvartilis gali parodyti didelį skirtumą išgyvenimo rezultatus. Pav. 2D iliustruoja kaupiamąjį išgyvenimo kreives pacientų apatinių ir aukštojo raiškos GLO1 grupes, skirstomi pagal ribinei IHC balas 90. 5 metų išgyvenamumas apatinio GLO1 raiškos grupių buvo statistiškai reikšmingai didesnis nei aukštesniųjų raiškos grupes ( 69,6%, palyginti su 43,3%; log rank P
= 0.0373) į IHC eksperimentams. Vienmatės analizė atskleidė keletą svarbių prognostinių veiksnių, įskaitant statuso limfmazgių metastazių, tolimos metastazės, pilvaplėvės sėja, kraujagyslių invazija, limfinės invazijos, gylis invazijos, patologinės etape, metastazių kepenyse ir perineurinis invazijos skaičių, be to, GLO1 išraiška. Kiti svarbūs parametrai buvo histologinis tipas, naviko dydį, ir bendra tipą (1 lentelė). Be to, į Dispersinės analizės duomenimis, nepriklausomi prognostiniai faktoriai įtakojantys pacientų išgyvenimą įtraukti limfmazgių metastazės (santykinė rizika = 5,954, 95% PI = 1,183-29,977 P
= 0,031) ir tolimos metastazės (santykinė rizika = 2,464, 95% PI = 1,030-5,896 p
= 0,043).}

per išraiška GLO1 į SC-M1 pagerina ląstelių dauginimosi, migracijos ir invazija veiklą.

Jei nustato per išraiška GLO1
SC-M1 ląstelių, ląstelių proliferaciją, migraciją, ir invazija veikla, buvo tiriami poveikį. Po dviejų savaičių transfekciją, įkurta stabili išraiška GLO1 baltymų. 3A paveikslas rodo 2,36 karto ir 2.29 karto didesnę GLO1 išraišką, atitinkamai. Ląstelių proliferacija buvo nustatomas pagal ląstelių skaičių ir, nurodomą kaip už iki penkių dienų kontrolės kartus. GLO1
-overexpressing ląsteles žymiai eksponavo ( P
< 0,01) didesnis platinimo tarifai (1.86- arba 2,06 kartų) negu perkeltų su valdymo vektorių apie 5 diena (3b pav.). Be to, GLO1
-overexpressing ląsteles rodomas žymiai ( P
< 0,01) didesnis migracijos normos (5.53- arba 4,57 karto) ir invazinės gebėjimai (3.7- arba 3,47 karto) nei jų kontrolės kolegomis (Figos. 3c ir D). Vaizdai iš ląstelių tankio buvo rodomas dviejų kontrolės ir dviejų per ekspresija ląstelių linijas (kairėje komisijas paveiksluose. 3c ir D).

Down išraiška GLO1 į TSGH ar AGS ląstelių sumažėja ląstelių migracijos ir invazija veiklą

Mūsų rezultatai patvirtina aukštą raišką GLO1 į išplitusiu skrandžio vėžiu, palyginti su noncancerous skrandžio gleivinę. Norėdami nustatyti, ar GLO1 išraiška yra susijęs su invazijos skrandžio vėžio ląstelių linijas, buvo įvertintas GLO1 išeikvojimo poveikį naudojant trumpą segtukas (SH) RNR plazmidės naviko ląstelių invazija veiklos TSGH ar AGS ląsteles. ShRNR ekspresijos vektoriai koduojandias Priešprasminis GLO1 seka buvo pernešta į TSGH ir AGS ląstelių linijas aukšto lygio endogeninio GLO1. GLO1 išraiška buvo žymiai represuoti į TSGH-kg1, -KG2 (0.32- ir 0,14 karto) ir AGS-KS1, -KS2 (0.26- ir 0,21 karto) sublines, lyginant su tuo ląstelėse transfektuotose kontrolės vektorių ( C1, C2;. Fig 4A ir B). KG1 ir KG2 GLO1-išeikvoti ląstelės žymiai eksponuojami ( P
< 0,05) sumažino migracijos normos (0.16- arba 0,044 kartus, atitinkamai) ir invazija gebėjimai (0.43- arba 0,29 karto, atitinkamai) negu kontrolinės vektoriaus -transfected ląstelės (Figos. 4C ir D). Panašūs rezultatai buvo gauti su AGS-KS ląstelių (KS1 ir KS2) (Figos. 4e ir F). Mūsų rezultatai rodo, kad kartu GLO1 teigiamai reguliuoja migracijos ir invazija gebėjimus skrandžio vėžio ląsteles.

Down išraiška GLO1 sąlygoja sumažėjusį genų, dalyvaujančių metastazės susijęs kelius

Jei nustatyti, ar GLO1 baltymas veikia metastazės susijusių genų, mes palyginti genomo išraišką KG2 ir C1. Keli genai aktyvinama (≥1.5 kartų) C1, palyginti su KG2, buvo pasirinktas. MetaCore ™ analizė [28] parodė, kad aukščiausio rango molekulinės keliai pakeista kg klonų buvo adhesion_cytokines ir sukibimą keliai. Baltymai [pavyzdžiui, matricos metaloproteinazės (MMP), CXCL8 ir CXCL1], dalyvaujančių šiose kelius buvo žemyn reguliuojama nuo GLO1 nuslopinami. Tarp citokinų susiję kelius, aukštos raiškos VEGF, CXCL8, CXCR2 ir CXCL1 yra susiję su vėžio metastazių ir progresavimo [8], [29]. Anksčiau Daniel J. , et al.,
[30] pranešė, kad per išraiška GLO1 galėtų sustiprinti STROMA gautas faktorius 1 (SDF-1), CXCR4 ir VEGF išraišką hipoksinio endotelio kamieninėms ląstelėms kultūros aukštos gliukozės. Todėl mes taip pat analizavo VEGF išraišką kg stabilių linijas.

Mes taip pat nusprendė patvirtinti išraiška modelius baltymų VEGF ar citokinų susijusių kelius per Vakarų dėmė analizė. Iš tikslinių genų lygmenimis, įskaitant CXCL1, CXCL8, CXCR2 ir VEGF, buvo žymiai slopinamas TSGH-KG stabili ląstelių linijas (kg1 ir KG2), palyginti su užkrato perkeltų kontrolės (pav. 5A). Be to, NF-κB ir HIF1-alfa, žinomų transkripcijos veiksnių PRO-angiogeninių augimo veiksniai (pvz CXCL8, CXCL1 ir VEGF) lygiai [31], buvo sumažintas atsižvelgiant į TSGH-KG stabili ląstelių linijų branduolių , lyginant su kontrolinės ląstelių (pav. 5A). MMP2 ir MMP9, svarbiausi fermentai už pažeminimą IV tipo kolageno, yra manoma, kad vaidinti svarbų vaidmenį navikų invazijos ir metastazių [32]. Pažymėtina, išeikvojimas GLO1 lėmė ženkliai slopinimo MMP2 ir MMP9 veiklą (5b pav.). Mūsų duomenys rodo, kad GLO1 reguliuoja metastazavimo-susijęs signaliniu keliu, skrandžio vėžio ląstelių aktyvaciją. Remdamasi šiomis išvadomis, mes siūlome, kad GLO1 tarpininkauja skrandžio vėžio ląstelių migraciją ir invazija bent iš dalies mediēta aktyvavimo CXCL1, CXCL8 ir VEGF.

IHC rodo coexpression iš GLO1 su CXCL1 ir CXCR2 baltymų ir jos per- išraiška skrandžio vėžinių audinių

Ankstesni tyrimai, pranešė, kad citokinų receptorių sąveika ir VEGF signaliniai keliai yra susiję su piktybinių navikų funkcijų skrandžio vėžio [8], [33]. Anksčiau, mūsų grupė parodė didelę asociaciją CXCR2 ir CXCL1 per išraiška (N = 116) su skrandžio vėžio progresavimo [8]. Nuosekliai, pagal IHC analizės, teigiama koreliacija buvo nustatyta tik tarp GLO1 ir CXCL1 ar CXCR2 balai vėžio audiniuose (Spearman koreliacijos koeficientas = 0,238 ir 0,293 P
= 0,013 ir p
= 0,003, atitinkamai). Be to, imunodažymu iš eilės skyriuose atskleidė didelę raišką GLO1, CXCL1 ir CXCR2 baltymų naviko epitelio ląstelių [Pav. 5C (b), (d), ir (f)], priešingai ne arba mažos raiškos noncancerous audinių [pav. 5C (a), (c), ir (e)].

Aptarimas

Kaip antra dažniausia priežastis, dėl vėžio susijusių mirties, skrandžio vėžys išlieka sudėtinga liga. Duomenys iš šio tyrimo paaiškėjo, kad ląstelę GLO1 skrandžio vėžio audiniuose yra reikšmingai susijęs su naviko progresavimo ir pažangių ligos stadijose. Nuosekliai atitikti, pacientai, sergantys apatinių GLO1 lygių turėjo geresnę ligos prognozę. Be to, KRL-PGR ir IHC eksperimentai atskleidė didesnio GLO1 raiškos sąsajas su vietos naviko progresavimo ir limfmazgių invazijos. Mes nustatėme reikšmingą sumažėjimą metastazės ir invazija gebėjimų GLO1 trūkumas ląstelėse, lydinčių su sumažintomis lygių kelių metastazės susijusių veiksnių, įskaitant VEGF, CXCL1, CXCL8, MMP ir CXCR2. Į IHC tyrimo, teigiama koreliacija tarp GLO1 ir CXCL1 išraiškos būdus pastebėta rezekcijos egzempliorių skrandžio vėžio. Be to, padidėjusi GLO1 ir kartu CXCL1 per išraiškos pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu, buvo reikšmingai koreliavo su išlikimo. Mūsų rezultatai pateikti tiesioginių įrodymų remiant GLO1 dalyvavimo skrandžio vėžio progresavimo ir galia per kaitos ir jos paskesnių migracijos ir invazija kelius.

Aukštos raiškos GLO1 buvo susijęs su keliomis vėžio [16], [17] , Naujausi tyrimai rodo labai svarbų vaidmenį GLO1 keliomis vėžio tipų į metilglioksalio pašalinimo (MG), kuri yra laikoma carcinostatic, todėl į GLO1 inhibitorių vystymąsi, kaip priešvėžiniai agentai [34], [35]. Taigi, aukštos raiškos GLO1 dalyvauja pasipriešinimo vėžio ląstelių apoptozės sukeltos priešvėžiniai agentai [36]. Sakamoto, ir kt.
[36] siūloma, kad GLO1 yra ne tik navikas, bet ir atsparumas narkotikų žymeklis. Nuosekliai, kad GLO1 triuškinantis-klonai buvo jautrūs kelių chemoterapiniais preparatais, pavyzdžiui, kamptotecino, etopozido (duomenys neparodyti). Kliniškai, mūsų rezultatai rodo, kad GLO1 yra labai išreikštas skrandžio vėžio ir reikšmingai susijęs su naviko progresavimo ir pažangių ligos stadijose.

glikolizinių pakitimai vėžinių ląstelių sudaro medžiagų apykaitos prisitaikyti prie hipoksinės navikų per iš hypoxia- veiksmų sukeltas transkripcijos faktorius (HIF-1) [37], [38]. Be to, transkripcijos veiksniai, HIF1-alfa ir NF-κB, žaisti lemiamus vaidmenis įvairiuose procesuose, pavyzdžiui, uždegimo, mikrobų žudymas ir vėžio progresavimą [39]. pasirodo naviko hipoksija būti stipriai susijęs su naviko dauginti, piktybinės ligos progresavimo ir pasipriešinimas terapija. HIF-1α kelias yra aiškiai dalyvauja kancerogenezėje skrandžio vėžio [39]. Be to, imunohistocheminis išraiška HIF-1α tikslinių genų (Glut1, VEGF, CA9, iAOS) yra susijęs su skrandžio naviko progresavimo [40]. Tarp onkogeniniam kelius NF-κB signalizacijos yra padidėjusi tam didelę skrandžio vėžio [9]. Be to, keletas eilučių įrodymų paramos kryžminių tarp NF-κB ir HIF-1α signalizacijos būdus [41]. Mūsų eksperimentų, lygiai tiek HIF-1α ir NF-κB buvo sumažintos branduolyje nuo GLO1 nuslopinami skrandžio vėžio ląstelių linijas, kartu su tolesniais tikslinių genų (VEGF, CXCL1, CXCL8, MMP).

Mūsų tyrimas, neįprastai padidėjusi GLO1 išraiška buvo susijęs su pažangiomis fenotipų, pavyzdžiui, skrandžio sienelės invazijos, limfmazgių metastazių, patologinės etape, ir limfinės invazijos. Anksčiau, mes pranešė, kad padidėjusi CXCL1 ir CXCR2 skrandžio vėžio yra susijęs su naviko progresavimo, ir, kad plazmos CXCL1 lygis gali būti naudinga cirkuliuojančių biologinis skrandžio vėžio diagnostikos [8]. Čia mes turime gauti tiesioginės klinikinės įrodymų stipri koreliacija tarp ekspresijos modelių GLO1 ir CXCL1 ar CXCR2. GLO1 išraiška gali būti susijęs su aktyvinimo citokinų receptorių susijusias ir VEGF signalizacijos būdus, ty galimą mechanizmą glaudesnio motorikai ir invazinės galimybes. Mūsų rezultatai patvirtina per išraiška GLO1 skrandžio karcinoma ir savo tvirtą kartu su stadijose ir blogos prognozės. Ankstesni tyrimai pagal mūsų grupės parodė, kad "SPARC [18], CLIC1 [42], SLPI [43], CXCL1, CXCL8 ir CXCR2 yra labai išreikštas, ir susijusi su stadijose ir blogos prognozės skrandžio vėžio [8]. Todėl šie nauji potencialūs biomarkeriai gali būti taikomas, siekiant pagerinti specifiškumą ir jautrumą skrandžio vėžio diagnozę. Tolesnė plėtra ir patvirtinimas dėl šių žymenų didesniuose Pacientų grupės įrankis gali sukelti klinikinėje praktikoje.

Parama Informacija
pav S1.
naudojant in-house GLO1 specifiškumą buvo patvirtintas Vakarų dėmė analizė. buvo naudojami Triušis polikloninis kovos su GLO1 antikūnų (dešinėje vaizdas) ir neigiamos kontrolės anksto imuniniai serumai (kairėje paveikslėlis). GLO1 baltymų lygis buvo nustatomas TSGH-C1 ir -KG2 skrandžio ląstelių linijų su in-house GLO1 antikūnų. β-aktino buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės visų ląstelių fragmentai
Doi:. 10,1371 /journal.pone.0034352.s001
(TIF)

• PLoS ONE: geografinį pasiskirstymą LGR5 + ląstelių koreliuoja su skrandžio vėžio progresavimo
• PLoS ONE: Stathmin1 Groja onkogeniniam vaidmuo ir yra MicroRNA-223 Tikslinė skrandžio vėžio