glyoxalase I (GLO1), een methylglyoxal ontgiftingsenzym, is betrokken bij de progressie van menselijke maligniteiten. De rol van GLO1 bij maag- kankerontwikkeling of progressie is nog onduidelijk. De expressie van GLO1 werd bepaald primaire maagkanker monsters door toepassing van kwantitatieve polymerase ketenreactie, immunohistochemie (IHC), en Western blotting geanalyseerd. GLO1 expressie was hoger bij maagkanker weefsels, in vergelijking met die in aangrenzende goedaardige weefsels. Verhoogde expressie van GLO1 was significant geassocieerd met maagwand invasie, lymfeklier metastase en pathologisch stadium, suggereert een nieuwe rol van GLO1 in de maag ontwikkeling en progressie van kanker. De 5-jaarsoverleving van de lagere GLO1 uitdrukking groepen was aanzienlijk groter dan die van de hogere groepen expressie (log rank P Visum:. Cheng WL, Tsai MM, Tsai CY, Huang YH, Chen CY, Chi HC, et al. (2012) glyoxalase-I is een nieuwe Prognose Factor geassocieerd met maagkanker Progression. PLoS ONE 7 (3): e34352. doi: 10.1371 /journal.pone.0034352 Editor: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, de Verenigde Staten van Amerika Ontvangen: 8 december 2011; Aanvaard: 27 februari 2012; Gepubliceerd: 29 maart 2012 Copyright: © 2012 Cheng et al. Dit is een open-access artikel gedistribueerd onder de voorwaarden van de Creative Commons Attribution License, die onbeperkt gebruik, distributie en reproductie maakt in elk medium, op voorwaarde dat de oorspronkelijke auteur en de bron worden gecrediteerd Financiering:. Dit werk werd ondersteund door subsidies van Chang-Gung University, Taoyuan, Taiwan (NMRPD 150.311, NMRPD170441-42, CMRPG 640042-43, 670291-93 CMRPG) en de National Science Raad van de Republiek China (NSC 95-2314-B-182 -027, 97-2314-B-182-009-MY2, 99-2314-B-182-022). De financiers hadden geen rol in de studie design, het verzamelen van gegevens en analyse, besluit te publiceren, of de voorbereiding van het manuscript Competing belangen:.. De auteurs hebben verklaard dat er geen tegenstrijdige belangen bestaan Introductie Maagkanker is de vierde meest voorkomende vorm van kanker en de tweede grootste oorzaak van kanker-gerelateerde sterfte in de wereld [1]. De maligniteit is de zesde belangrijkste oorzaak van kanker-gerelateerde sterfgevallen in Taiwan [2]. Correcte screening kan de detectie van maagkanker voordat symptomen ontwikkelen in een uithardbare stadium vergemakkelijken [3]. Bepaling van de expressieprofielen van sleutelmoleculen in de verschillende routes betrokken bij maagkanker progressie kan helpen bij de diagnose, prognose en voorspelling van tumorprogressie. tumorinvasie en metastase zijn essentiële stappen het vaststellen van de agressieve fenotype van menselijke kankers , en vormen de belangrijkste oorzaken van kanker-gerelateerde dood [4]. Hoge expressie van migratie factoren, zoals cyclooxygenase 2 (COX-2) [5] Vasculaire endotheliale groeifactor (VEGF) [6], CXC chemokine ligand (CXCL) -8 [7], chemokine (CXC motief) receptor (CXCR) -2, en CXCL-1 [8], geassocieerd met maagkanker progressie. Verschillende potentiële oncogene routes (proliferatie /stamcel, NF-KB en Wnt /β-catenine) gedereguleerd in de meeste maagkanker [9]. Zo zou verdere opheldering van de precieze moleculaire gebeurtenissen die leiden tot maagkanker progressie en identificatie van waardevolle diagnostische of prognostische markers en nieuwe therapeutische significante klinische waarde. glyoxalase I (eveneens aangeduid GLO1) een essentiële component in die leiden tot het ontgiften van Methylglyoxal (MG), een van de bijproducten van glycolyse [10], [11], [12]. GLO1 expressie is verhoogd bij verschillende menselijke kankers van de colon, borst, prostaat en melanoma [13], [14], [15], [16], [17]. Recente studies hebben gemeld dat overexpressie van GLO1 geassocieerd met kanker progressie en resistentie [17]. Uit onze eerdere gegevens werd GLO1 opregulatie waargenomen in maagkanker monsters met behulp van cDNA microarray [18]. De specifieke rol van GLO1 tijdens tumorigenese maag en de klinische relevantie nog worden vastgesteld. Onze experimenten laten duidelijk zien dat GLO1 vaak overexpressie gebracht bij maagkanker en geassocieerd met kanker metastase. Opmerkelijk expressie van GLO1 significant hoger bij gevorderde stadia van maagkanker. Bovendien, veranderingen van de expressie van GLO1 bij maagkanker cellijnen beïnvloedt cel migratie en invasie capaciteiten. Ethics Verklaring De studie protocol werd goedgekeurd door de Medische Ethics and Human Clinical Trial Comité van de Chang Gung Memorial Hospital (IRB NO. 95-0472B). Schriftelijke toestemming werd verkregen van alle patiënten Onderwerpen De 114 patiënten (64 mannen en 50 vrouwen, mediane leeftijd, 66 jaar; range 28-86 jaar). Gediagnosticeerd met maagkanker bij de Chang Gung Memorial Hospital 2000-2005 werden geïncludeerd in deze studie. Alle patiënten kregen chirurgie voor primaire maagkanker zonder voorafgaande chemotherapie of radiotherapie. Elke patiënt werd onderworpen aan maagresectie (35 patiënten ondergingen een totale gastrectomie en 79 gedeeltelijke gastrectomie). resectiepreparaten werden onderzocht pathologisch met behulp van de criteria van de Japanse Algemene regels voor Gastric Cancer Study [19] en de gemengde commissie Amerikaanse on Cancer (AJCC) (pTNM) classificatiesysteem [20]. Clinicopathologische parameters opgenomen patiënt leeftijd en geslacht, tumor locatie en grootte, bruto (Borrmann's) het type tumor, muur invasie, resectie marge, histologische type, de lymfeklier metastase, vasculaire invasie, lymfatische invasie, en perineurale invasie. Na ontslag, hadden alle patiënten periodiek follow-up bezoeken aan de polikliniek van Chang Gung Memorial Hospital tot de dood of het begin van de voorbereiding van dit artikel. qRT-PCR werd uitgevoerd zoals beschreven in een vorig rapport [21]. De volgende primers werden gebruikt: humaan GLO1 Productie van anti-GLO1 antilichaam Het cDNA codeert full-length GLO1 Hele cellysaten, nucleaire extracten, en voorwaardelijke media werden bereid uit menselijk weefsel of stabiele GLO1 knockdown cellijnen. Western blotting werd uitgevoerd met monoklonale antilichamen tegen humane HIF-1α (Abcam, San Francisco, CA), p65 (Epitomic, Burlingame, CA), of P50 (Millipore, Billerica, MA) of polyklonale antilichamen tegen humaan GLO1 (intern, verdunning, 1:500), CXCL1 (PeproTech Inc., Rocky Hill, NJ), CXCL8 (R &.. D Systems Inc., Minneapolis, MN), VEGF (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, Californië) Immunohistochemie (IHC) formaline gefixeerde en in paraffine ingebedde weefsels werden onderzocht met behulp van de IHC polyklonaal antilichaam tegen humaan GLO1 geproduceerd in-house (verdunning, 1:3000) en de avidine-biotine complex (ABC ) methode, zoals eerder [23] beschreven [24]. Vergelijkingen werden uitgevoerd tussen de intensiteit van de kleuring van carcinoomcellen en goedaardige oppervlakkige epitheel, die op hetzelfde glaasje geplaatst. Voor semi-kwantitatieve analyse van GLO-1 immunoreactiviteit, een Histoscore (H) -scoring werd gebruikt [25]. Kort samengevat, de negatieve groep bestond uit kankercellen zonder waarneembare (-) of slechts sporenhoeveelheden kleuring GLO-1 (1). De positieve groep bestond uit kankercellen met een matige (2) of een hoog niveau (3) van de GLO-1 immunoreactiviteit. H scorende berekend en gemiddeld door twee onafhankelijke pathologen, blind voor de aanvankelijke score voor elke patiënt. De resultaten werden beoordeeld door het percentage positieve cellen (P) van de intensiteit (I) vermenigvuldigen, volgens de formule: H = P x I. Bijvoorbeeld, een sectie waarin 10% van het weefsel had een kleuring score van 1, 60% een score van 2 en 30% een score van 3, H = (10 x 1) + (60 x 2) + (30 x 3) = 220. Oprichting van GLO1 overexpressie in SC-M1 cellijn De SC-M1 cellijn die lager GLO1 werd gebruikt. De transfectie van GLO1 Twee menselijke maagkanker cellijnen, AGS en TSGH, werden gebruikt. De korte hairpin RNA (shRNA) sequenties targeting GLO1 Cellen (1 x 10 4) werden gekweekt op een 6 cm plaat bij 37 ° C onder 5 % CO 2. Op elk tijdstip, de groei van de cellen werd bepaald door celtelling. De resultaten worden gegeven als de fold change onderling controlewaarde. Het effect van GLO1 depletie of overexpressie on de migratie en invasieve activiteit van maagkanker cellijnen werd gemeten met een snelle RNA bereiding en microarray analyse De GLO1 zwijgen kloon TSGH (KG2) en controle celkloon (C1) werden kort gespoeld met ijskoude PBS en gelyseerd in TRIzol reagens (Invitrogen) voor RNA-extractie. Genexpressieprofielen tussen KG2 en C1 cellen werden geanalyseerd met het menselijke U133A GeneChip (Affymetrix, Santa Clara, CA) volgens het protocol van de fabrikant [27]. De GLO1 uitingen van elke subgroep van clinicopatholgoical parameters in tabel 1 zijn uitgedrukt als gemiddelde ± standaardafwijking (SD) van de IHC score van de patiënten in deze subgroep. De Kolmogorov-Smirnov test is een niet-parametrische test om monsters te vergelijken met een referentie-kansverdeling. In voorkomend geval, de Mann-Whitney U of Fisher's exact test werd toegepast voor vergelijkingen tussen de twee groepen, terwijl de Kruskal-Wallis of Pearson chi-square test werd gebruikt om meer dan twee groepen te vergelijken. Het verband tussen gegevens van de twee onderzoeken werd geanalyseerd met de Spearman correlatietoets. Patiënten werden gevolgd tot het moment manuscript preparaat of dood. Kankerspecifieke overleving resultaat werd vastgesteld volgens de Kaplan-Meier-methode voor alle patiënten, behalve degenen die van chirurgische complicaties stierf. De log-rank test werd gebruikt om de prognostische betekenis van de individuele variabelen op de overleving te vergelijken. De Cox proportionele hazards model werd gebruikt in multivariate analyse om de onafhankelijke voorspellers van overleven te identificeren. P Resultaten GLO1 mRNA en eiwit niveaus zijn opgereguleerd bij maagkanker patiënten Met behulp van cDNA microarray, we hebben verschillende opgereguleerde genen geïdentificeerd uit gastrische weefsels, in vergelijking met aangrenzende nontumorous weefsels [18]. Onder deze genen, hebben we ons gericht op de GLO1 Expressie van eiwitten in GLO1 gepaarde monsters werd verder geanalyseerd met behulp van western blotting. Figuur 1A presenteert GLO1 meningsuiting in acht representatieve patiënten. Gelijke hoeveelheden totaal eiwit gekleurd met Coomassie blauw na SDS-PAGE werd gebruikt als ladingcontrole. Alle kanker weefsels van maagkanker monsters (G1 tot G8) weergegeven opgereguleerd GLO1 expressie, in vergelijking met matchende noncancerous aangrenzende slijmvliezen (afb. 1A). Om verder te bepalen of opregulatie GLO1 gecorreleerd met klinische progressie van maagkanker, werd uitgevoerd op IHC gefixeerd paraffine maagkanker weefsels en afgestemd goedaardige mucosa van 114 patiënten. Vier paren representatieve gevallen (a /b, c /d, e /f en g /h) getoond in Figuur 1B. IHC gegevens goedaardige mucosa tegenhangers (a, c, e en g) en kankerweefsel (b, d, f en h) vergeleken in paren. Donkerbruine immunokleuring was het meest gangbaar in kankercellen terwijl niveaus van kleuring lager in stromale cellen of fibroblasten van maagkanker weefsels waren. Sterke kleuring voor GLO1 werd vaak waargenomen bij vergevorderde gastrische tumorcellen, in tegenstelling tot zwakke of geen kleuring in normale maagepitheelcellen (fig. 1B, bovenste paneel). Kleuring was intenser bij gevorderde maagkanker stadium [stap III in Fig. 1B (f, h)], vergeleken met stadium I [Fig. 1B (b)] en II [Fig. 1B (d)]. Onder de 114 patiënten geanalyseerd, de gemiddelde IHC score in tumorweefsels was 139,8 ± 62,8, die aanzienlijk groter is dan die (36,7 ± 40,4) in de overeenkomstige aangrenzende slijmvlies was (n = 87) ( P Restaurant < 0,001 , rangtekentoets). Bovendien gepaarde vergelijking van immunoreactiviteit voor GLO1 (n = 87) liet zien dat de IHC scores van kankerweefsel waren hoger dan die van de nontumorous tegenhangers in 77 (88,5%) patiënten, gelijk bij drie patiënten (3,4%) en lager in zeven patiënten (8,0%). GLO1 expressie en klinische correlaties GLO1 expressie in tumorweefsel was niet significant geassocieerd met de leeftijd, tumor locatie of weefseltype (tabellen 1 en 2). Hogere niveaus van GLO1 waren duidelijk in de T3 /T4 groepen waar de serosale oppervlak van de maagwand werd binnengevallen door kanker, in vergelijking met die in T1 /T2 groepen waarin geen invasie was duidelijk ( P Survival uitkomsten de gemiddelde duur van de follow-up periode. 52 overlevenden was 70,4 maanden (range, 28-119 maanden). Vier patiënten overleden aan postoperatieve complicaties en zes andere oorzaken. Tweeënvijftig patiënten stierven vanwege maagkanker progressie. De totale cumulatieve vijf jaar overlevingskans van de 114 patiënten was 49,3% na gastrectomie. Om de invloed van GLO1 uitdrukking op de overleving uitkomst te bepalen, werd de patiënt in twee groepen verdeeld, hogere en lagere uitdrukkingen, volgens de cutoff waarde, die een significant verschil zou demonstreren (log rank P Restaurant < 0,05) in overlevingskansen tussen de 2 groepen. De mediaan (= 140), bovenste kwartiel (= 180 of 75 e percentiel), en lagere kwartiel (= 90 of 25 e percentiel) van IHC scores van onze patiënten werden aanvankelijk getest om de cutoff waarden te bepalen. Onder hen, kan alleen de onderste kwartiel een significant verschil in overleving resultaat tonen. Fig. 2D illustreert de cumulatieve overlevingskrommen van patiënten in de lagere en hogere expressie GLO1 groepen verdeeld volgens een cutoff IHC score van 90. De 5-jaars overleving van de onderste GLO1 expressie groepen was significant hoger dan die van de hogere groepen expressie ( 69,6% versus 43,3%; log rank P over-expressie van GLO1 in SC-M1 verbetert celproliferatie, migratie en invasie activiteiten. Om het effect van overexpressie van GLO1 Onze resultaten bevestigden hoge expressie van GLO1 in gevorderde maagkanker, in vergelijking met goedaardige maagslijmvlies. Bepalen of GLO1 expressie geassocieerd met invasiviteit van maagkanker cellijnen, werden de effecten van GLO1 depletie gebruik korte haarspeld (sh) RNA plasmiden op tumorcel invasie activiteiten van TSGH of AGS cellen onderzocht. ShRNA expressievectoren die coderen voor de antisense sequentie GLO1 getransfecteerd in TSGH en AGS cellijnen die hoge niveaus van endogeen GLO1. GLO1 expressie was significant onderdrukt in TSGH-KG1, -KG2 (0.32- en 0,14-voudig) en AGS-KS1, -KS2 (0.26- en 0,21-voudig) sublijnen, in vergelijking met die in cellen getransfecteerd met de besturingsvectoren ( C1, C2; fig. 4A en B). KG1 en KG2 GLO1-uitgeputte cellen significant vertoonden ( P Restaurant < 0,05) verlaagde migratie tarieven (0.16- of 0,044-voudig, respectievelijk) en de invasie vaardigheden (0.43- of 0.29-voudig, respectievelijk) dan controle vector getransfecteerde cellen (Fig. 4C en D). Vergelijkbare resultaten werden verkregen met AGS-KS-cellen (KS1 en KS2) (fig. 4E en F). Onze resultaten suggereren dat collectief GLO1 positief regelt de migratie en invasie mogelijkheden van maagkanker cellen. Om te garanderen dat de GLO1 eiwit beïnvloedt-metastase gerelateerde genen, vergeleken we het genoom-brede expressie van KG2 en C1. Meerdere genen gereguleerd (≥1.5-voudig) in C1, tegenover KG2, werden geselecteerd. MetaCore ™ analyse [28] is gebleken dat de top-ranking moleculaire wegen veranderd in KG klonen waren adhesion_cytokines en adhesie paden. Eiwitten [zoals matrix metalloproteïnase (MMP), CXCL8 en CXCL1] die betrokken zijn bij die trajecten werden down-gereguleerd op GLO1 silencing. Onder de cytokine gerelateerde routes, hoge expressie van VEGF, CXCL8, CXCR2 en CXCL1 geassocieerd met kanker metastase en progressie [8], [29]. Eerder Daniel J. et al. We verder gevalideerd expressiepatronen van eiwitten in VEGF of cytokine gerelateerde routes via Western blotanalyse. De niveaus van doelgenen, waaronder CXCL1, CXCL8, CXCR2 en VEGF werden significant geremd in TSGH-KG stabiele cellijnen (KG1 en KG2), vergeleken met vector getransfecteerde controles (Fig. 5A). Bovendien voert de van NF-KB en HIF1-α, bekende transcriptiefactoren van pro-angiogene groeifactoren (zoals CXCL8, CXCL1, en VEGF) [31], werden gereduceerd in de kernen van TSGH-KG stabiele cellijnen , vergeleken met controlecellen (Fig. 5A). MMP2 en MMP9, de belangrijkste enzymen voor het afbreken van type IV collageen wordt verondersteld een kritieke rol speelt in tumorinvasie en metastase [32]. Met name, uitputting van GLO1 geleid tot aanzienlijke onderdrukking van MMP2 en MMP9 activiteiten (Fig. 5B). Onze gegevens geven aan dat GLO1 regelt de activering van metastase-geassocieerde signaaltransductiewegen bij maagkanker cellen. Op basis van deze bevindingen, stellen wij voor dat GLO1 bemiddelt maagkanker celmigratie en invasie ten minste gedeeltelijk gemedieerd via activering van CXCL1, CXCL8 en VEGF. Eerdere studies hebben gemeld dat cytokine receptor interactie en VEGF signaalroutes geassocieerd met kanker eigenschappen bij maagkanker [8], [33]. Voorheen onze groep toonde een significante associatie van CXCR2 en CXCL1 over-expressie (n = 116) met maagkanker progressie [8]. Consequent, in IHC-analyse, een positieve significante correlatie werd uitsluitend gevonden tussen de scores van GLO1 en CXCL1 of CXCR2 bij kanker weefsels (Spearman's correlatiecoëfficiënt = 0,238 en 0,293; P Als de tweede meest voorkomende oorzaak van kanker-gerelateerde dood, blijft maagkanker een uitdagende ziekte. Gegevens uit deze studie toonde dat opregulatie van GLO1 bij maagkanker weefsels significant geassocieerd met tumorprogressie en gevorderde stadia van de ziekte. Concordantly, patiënten met een lagere GLO1 niveaus had betere prognose van de ziekte. Bovendien qRT-PCR en IHC-experimenten beschreven een correlatie van verhoogde expressie GLO1 lokale tumorprogressie en lymfeklieren invasie. We zagen een duidelijke afname in de metastase en invasie mogelijkheden van GLO1-deficiënte cellen, gelijktijdig met verminderde niveaus van meerdere-metastase-geassocieerde factoren, zoals VEGF, CXCL1, CXCL8, MMP's, en CXCR2. In het IHC studie, een positieve significante correlatie tussen GLO1 en CXCL1 expressiepatronen werd waargenomen in resectiepreparaten van maagkanker. Bovendien verhoogde GLO1 en gelijktijdig CXCL1 over-expressie bij patiënten met maagkanker significant gecorreleerd met overleving. Onze resultaten bieden directe bewijs van de betrokkenheid van GLO1 bij maagkanker progressie en de macht door middel van afwisseling van de stroomafwaartse migratie en invasiewegen. High uitdrukking van GLO1 is gekoppeld aan verschillende vormen van kanker [16], [17] . Recente studies hebben een belangrijke rol GLO1 in verschillende kankersoorten bij het verwijderen van methylglyoxal (MG), dat wordt beschouwd carcinostatisch voorgesteld, zodat de ontwikkeling van GLO1 inhibitoren als antitumormiddelen [34], [35]. Aldus wordt een hoge expressie van GLO1 betrokken bij kanker cel resistentie tegen apoptose geïnduceerd door anti-tumormiddelen [36]. Sakamoto et al. glycolytische veranderingen in kankercellen vormen een metabolische aanpassing aan hypoxische tumoren via de werking van hypoxie- geïnduceerde transcriptiefactor (HIF-1) [37], [38]. Bovendien, de transcriptiefactoren, HIF1-α en NF-KB, een cruciale rol spelen in diverse processen, zoals ontsteking, microbiële doding en progressie van kanker [39]. Tumorhypoxia lijkt sterk geassocieerd met tumor vermeerdering, kwaadaardige progressie en resistentie tegen therapie. HIF-1α pathway is duidelijk betrokken bij carcinogenese maagkanker [39]. Bovendien wordt immunohistochemische expressie van HIF-1α doelgenen (GLUT1, VEGF, CA9, iNOS) geassocieerd met maag- tumorprogressie [40]. Onder de oncogene routes, is NF-kB- signalering verhoogd in een aanzienlijk deel van maagkanker [9]. Bovendien is een aantal lijnen van het bewijs steun overspraak tussen de NF-KB en HIF-1α signaalwegen [41]. In onze experimenten niveaus van zowel HIF-1α en NF-kB werden verlaagd kernen bij GLO1 silencing bij maagkanker cellijnen, samen met downstream doelgenen (VEGF, CXCL1, CXCL8, MMP). In onze studie, abnormaal verhoogde GLO1 expressie werd geassocieerd met progressieve fenotypes, zoals maagwand invasie, lymfeklieren metastase, pathologisch stadium, en lymfatische invasie. Eerder hebben we gemeld dat verhoogde CXCL1 en CXCR2 bij maagkanker geassocieerd met tumorprogressie en dat het plasma niveau CXCL1 nuttig circulerend biomarker voor maagkanker diagnose kan worden [8]. Hier hebben we direct klinisch bewijs van een sterke correlatie tussen de expressie patronen van GLO1 en CXCL1 of CXCR2 verkregen. GLO1 expressie kan worden geassocieerd met activatie van cytokine receptor geassocieerde en VEGF signaalwegen, die een potentieel mechanisme voor een betere beweeglijkheid en invasief vermogen. Onze resultaten bevestigen overexpressie van GLO1 in maagcarcinoom en de sterke associatie met gevorderde stadia en slechte prognose. Eerdere studies door onze groep hebben aangetoond dat SPARC [18], CLIC1 [42], SLPI [43], CXCL1, CXCL8 en CXCR2 zijn sterk tot expressie gebracht en in verband met een vergevorderd stadium en een slechte prognose van maagkanker [8]. Deze nieuwe potentiële biomarkers kunnen derhalve worden toegepast om de specificiteit en gevoeligheid van maagkanker diagnose verbeteren. Verdere ontwikkeling en de bevestiging van het nut van deze markers in grotere patiënt cohorten zal mogelijk leiden tot klinische toepassingen.
= 0,0373) in het IHC-experimenten. Overexpressie van GLO1 bij maagkanker cellijnen verhoogt celproliferatie, migratie en invasiviteit. Omgekeerd, down-regulatie van GLO1 met shRNA geleid tot een duidelijke vermindering van de migratie en invasie vaardigheden. Onze gegevens suggereren sterk dat hoge expressie van GLO1 bij maagkanker verhoogt de metastase vermogen van tumorcellen In vitro Kopen en In vivo
, en ondersteuning van de werkzaamheid als een potentiële marker voor de opsporing en prognose van maagkanker
Materialen en methoden
clinicopathologische studies
Real-time kwantitatieve reverse transcriptie polymerase chain reaction (qRT-PCR )
qRT-PCR (voorwaartse primer, 5'-TGAGGATAAAAATGACATCCCTA- AAGA-3 'en reverse primer, 5'-TGTGTCAGCTCAAGTGTAGCTTTC-3'), humaan 18S rRNA qRT-PCR (voorwaartse primer, 5'-CGAGCCGCCTGGATACC-3 'en reverse primer, 5'-CCTCAGTT CCGAAAACCAACAA-3').
werd gekloond in pGEX-4T1. Lysaten van E.
coli BL21-stam werden gezuiverd met glutathion-agarose korrels (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Oplosbare eiwitten werden gezuiverd met behulp van chromatografie met glutathion-agarose korrels, volgens instructies van de fabrikant, geëmulgeerd met adjuvans, en gebruikt om konijnen te immuniseren. Polyklonale antilichamen werden geproduceerd en affiniteit-gezuiverd, zoals eerder [22] beschreven. De specificiteit van in-house GLO1 werd gevalideerd met behulp van western blot analyse (figuur S1).
Immunoblotanalyse
cDNA werd uitgevoerd met Lipofectamine reagens (Life Technologies, Grand Island, NY). Na incubatie gedurende 24 uur werden de cellen overgebracht naar medium dat G418 voor selectie en werden vervolgens gebruikt in proliferatie, migratie en invasie assays.
Vaststelling van GLO1 knockdown in TSGH en AGS cellijnen
(TRCN0000118630 en TRCN0000118631) werden gekocht van de Nationale RNA interferentie Core Facility (Instituut voor Moleculaire Biologie, Academia Sinica, Taiwan). De specifieke onderdrukking van GLO1 werd bevestigd met behulp van Western blot analyse.
celproliferatie assay
In vitro assay
migratie en invasieve activiteit
in vitro assay (Transwell techniek), zoals eerder beschreven [26].
Statistische analyse
waarden. ≪ 0,05 werden beschouwd als significant
als doelwit voor maagkanker. Expressie van GLO1 werd gemeten in kankerweefsels, en vergeleken met die in gelijke nontumorous maagslijmvlies behulp qRT-PCR (n = 89) (tabel 2) of IHC (n = 114) (tabel 1). Gegevens uit qRT-PCR experimenten toonden GLO1 overexpressie (≥1.5-voudig) in 51 (57,3%) van maagkanker weefsels, in vergelijking met goedaardige weefsels. De gemiddelde GLO1 expressie in tumor weefsel was 2,87 maal dat in goedaardige weefsels. Onze resultaten bevestigen een significante toename GLO1 expressie in tumorweefsels ( P
= 0,005, één sample Kolmogorov-Smirnov-test).
Immunokleuring demonstreert GLO1 eiwit over-expressie in de maag kankerweefsel
= 0,015 voor qRT - PCR en P = 0,001
IHC, figuur 2A, tabellen 1 en 2).. Expressie van GLO1 was significant verhoogd, met metastase naar de lymfeklieren ( P
= 0,001 voor qRT-PCR en P
< 0,001 IHC; fig. 2B, Tabellen 1 en 2) . Hogere expressie was duidelijk bij patiënten met lymfatische invasie ( P
= 0,001 en P
= 0,016 voor qRT-PCR en IHC respectievelijk Tabellen 1 en 2) en perineurale invasie ( P
= 0,024 voor qRT-PCR, tabel 2). GLO1 verhoogde expressie werd niet geassocieerd met vasculaire invasie of metastase op afstand, zoals peritoneale zaaien of levermetastasen, zowel qRT-PCR en IHC-experimenten. Expressie van GLO1 was significant hoger bij patiënten met gevorderde pathologische stadium (III /IV) maagkanker, vergeleken met die in de eerdere pathologische stadia (I /II) ( P
= 0,001 en P Restaurant < 0,001 voor qRT-PCR en IHC, respectievelijk) (Fig 2C;. tabellen 1 en 2)
= 0,0373) in het IHC-experimenten. Univariate analyse beschreef een aantal significante prognostische factoren, zoals statusinformatie van lymfeknoop metastasen, metastasen op afstand, peritoneale zaaien, vasculaire invasie, lymfatische invasie, invasiediepte, pathologisch stadium, levermetastasen en perineurale invasie, naast expressie GLO1. Andere belangrijke parameters waren weefseltype, tumorgrootte en grove type (tabel 1). Verder is in multivariate analyse, de onafhankelijke prognostische factoren die de overleving patiënt opgenomen lymfeklier metastase (relatief risico = 5,954, 95% CI = 1,183-29,977, P
= 0,031) en verre metastase (relatief risico = 2,464, 95% CI = 1,030-5,896, P
= 0,043).
in SC-M1 cellen, celproliferatie, migratie en invasie activiteiten werden getest bepalen. Na twee weken van transfectie werd stabiele expressie van GLO1 eiwit vastgesteld. Figuur 3A toont 2,36 maal en 2,29 maal hoger GLO1 expressie resp. Celproliferatie werd vastgesteld door tellen van de cellen en aangeduid als een plooi van de regelaar met tot vijf dagen. GLO1
tot overexpressie cellen significant vertoonden ( P Restaurant < 0,01) hogere proliferatie tarieven (1.86- of 2,06-maal) dan die getransfecteerd met controle vector op dag 5 (Fig 3B.). Bovendien, GLO1
tot overexpressie cellen significant weergegeven ( P Restaurant < 0,01) hogere migratie tarieven (5.53- of 4.57-voudig) en invasieve capaciteiten (3,7- of 3,47-maal) dan hun control tegenhangers (Fig. 3C en D). Afbeeldingen celdichtheid werden twee controle en twee overexpressie cellijnen (linker panelen in fig. 3C en D).
stads expressie van GLO1 in TSGH of AGS cellen vermindert celmigratie en invasie activiteiten
stads expressie van GLO1 resulteert in verminderde expressie van genen die betrokken zijn bij metastase-geassocieerd paden
[30] gemeld dat overexpressie van GLO1 stromale cellen afgeleide factor-1 (SDF-1), CXCR4, en VEGF-expressie zou kunnen vergroten in hypoxische endotheliale progenitorcellen kweek in hoog glucosegehalte. Derhalve analyseerden wij ook de expressie van VEGF in KG stabiele lijnen.
IHC toont co-expressie van GLO1 met CXCL1 en CXCR2 eiwitten en de over- expressie in kankerweefsel gastrische
= 0,013 en P
= 0,003, respectievelijk). Bovendien immunokleuring opeenvolgende secties toonde significante expressie van GLO1, CXCL1 en CXCR2 eiwitten in tumorcellen epitheelcellen [Fig. 5C (b), (d) en (f)], in tegenstelling tot geen of lage expressie in goedaardige weefsels [Fig. 5C (a), (c) en (e)].
Discussie
[36] voorgesteld GLO1 is niet alleen een tumor, maar ook een geneesmiddelresistentie marker. Consequent, de GLO1 knockdown-klonen gevoelig voor verschillende chemotherapeutische middelen zoals camptothecine waren, etoposide (gegevens niet getoond). Klinisch onze resultaten aan dat GLO1 hoog tot expressie in maagkanker en significant geassocieerd met tumorprogressie en gevorderde stadia van de ziekte.
Ondersteunende informatie
Figuur S1. Ondernemingen De specificiteit van in-house GLO1 werd gevalideerd door western blot analyse. Konijn polyklonaal anti-GLO1 antilichaam (rechter afbeelding) en negatieve controle pre-immuunsera (linker afbeelding) gebruikt. De GLO1 eiwitgehalte werd bepaald in TSGH-C1 en -KG2 maag cellijnen met de in-house GLO1 antilichaam. β-actine werd gebruikt als een interne controle voor de totale cellysaten
doi:. 10.1371 /journal.pone.0034352.s001
(TIF)
Wetenschappers lossen mysterieus geval van autobrouwerijsyndroom op
Antibioticum X-206 effectief tegen SARS-CoV-2 in vitro
Darmbacteriën gekoppeld aan metabole veranderingen en autisme in nieuwe studie
Mensen met IBS-symptomen die waarschijnlijk een laag vitamine D-gehalte hebben,
Onderzoek kijkt naar aerobiomen,
Apoptose is een belangrijke mediator van pathogenese bij dierlijk coronavirusinfectie
Een veganistisch dieet kan darmmicroben stimuleren die helpen bij het afvallen
Door over te schakelen op een veganistisch dieet kunnen mensen elke week bijna een pond afvallen en hun risico op diabetes aanzienlijk verminderen, volgens een studie die onlangs werd gepresenteerd op
Nieuwe studie toont verbeterde overleving voor patiënten met gevorderde colorectale BRAF-mutante kanker
De resultaten van een nieuwe klinische proef die vandaag in de New England Journal of Medicine laten zien dat het gebruik van een combinatie van drie geneesmiddelen die gericht zijn op een specifiek
Orale seks kan bacteriële vaginose veroorzaken
Een nieuwe studie gepubliceerd in het tijdschrift PLOS Biologie heeft aangetoond dat diverse microbiële populaties vaginale kolonisatie van pathogenen kunnen vergemakkelijken, wat op zijn beurt de k