PLoS ONE: Die Überexpression von Lin28 Senkt die Chemosensitivity von Magenkrebszellen zu Oxaliplatin, Paclitaxel, Doxorubicin und Fluorouracil in Teil über microRNA-107

Abstrakt

Höhere Lin28 Ausdruck wird bei lokal fortgeschrittenem Magenkrebs Patienten, die eine neoadjuvante Chemotherapie mit schlechter pathologischen Tumorreaktionen assoziiert. Allerdings ist die Eigenschaften von Lin28 und seines Wirkungsmechanismus in Chemotherapie-Resistenz noch unklar. In dieser Studie haben wir dass die Transfektion von Lin28 in Magenkrebszellen (MKN45 und MKN28) steigerten ihren Widerstand gegen die Chemo-Drogen Oxaliplatin (OXA), Paclitaxel (PTX), Doxorubicin (ADM) und Fluorouracil (5-FU) gefunden verglichen mit Magenkrebszellen mit einem Kontrollvektor transfiziert. Wenn Lin28 Expression durch Knockdown Lin28 small interfering RNA (siRNA) in vitro bewertet wurde, fanden wir, dass der Widerstand gegen Chemo-Medikamente reduziert wurde. Des Weiteren fanden wir, dass Lin28 up-reguliert C-myc und P-gp und herunterreguliert Cylin D1. Schließlich fanden wir, dass miR-107 ein Ziel-mikroRNA von Lin28 ist und dass es in den Mechanismus des Chemotherapieresistenz beteiligt ist. Unsere Ergebnisse legen nahe, dass die Lin28 /miR-107-Weg eine von vielen Signalwege reguliert durch Lin28 und mit Magenkrebs Chemo-Resistenz assoziiert sein könnte

Citation:. Teng R, Hu Y, Zhou J, Seifer B, Chen Y, Shen J, et al. (2015) Die Überexpression von Lin28 Senkt die Chemosensitivity von Magenkrebszellen zu Oxaliplatin, Paclitaxel, Doxorubicin und Fluorouracil in Teil über microRNA-107. PLoS ONE 10 (12): e0143716. doi: 10.1371 /journal.pone.0143716

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, UNITED STATES

Empfangen: 23. Juni 2015; Akzeptiert: 8. November 2015; Veröffentlicht: 4. Dezember 2015

Copyright: © 2015 Teng et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorgesehen sind der ursprüngliche Autor und Quelle genannt

Datenverfügbarkeit: Alle relevanten Daten sind innerhalb des Papiers und seiner Hintergrundinformationen Dateien

Finanzierung:. Unterstützung von Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China zur Verfügung gestellt wurde: LQ13H160014 [http://www.zjnsf.gov.cn/b/home.aspx] .

konkurrierende Interessen:. Die Autoren, dass keine Interessenkonflikte bestehen erklärt haben

Einführung

Magenkrebs ist eine häufige mit einer Mortalitätsrate klinischen Verdauungssystem bösartiger Tumor, der dritte Ränge in der Welt [1]. Unser Land ist ein Gebiet, das zu Magenkrebs anfällig ist. In den letzten Jahren neo-adjuvante Chemotherapie wurde Magenkrebspatienten verabreicht Überleben zu verlängern. Dennoch ist die 5-Jahres-Überlebensrate von Patienten mit fortgeschrittenem Magenkrebs immer noch niedriger als 30% [2]. Chemotherapie-Resistenz ist die häufigste Ursache für das Scheitern von Magenkrebs und andere Tumortherapien. Daher ist der Mechanismus der Resistenz Chemotherapie von Magenkrebs derzeit ein großes Problem bei Magenkrebs-Studien.

Lin28 ist eine hoch konservierte RNA-bindendes Protein, das bei der Induktion von pluripotenten Stammzellen und bei der Aufrechterhaltung der Schaft teilzunehmen gezeigt wurde Zell-ähnlichen Zellen in Krebs. Jüngste Studien haben berichtet, dass abweichende Aktivierung von Lin28 korreliert gut mit der Prognose von verschiedenen Krebsarten, darunter Brust-, Eierstock-, Lungen-, Darm- und Leberkrebs [3-6]. Unsere frühere Studie zeigte, dass die Expression Lin28 auch mit schlechten Überleben bei Patienten mit Magenkrebs [7], und eine andere Studie zeigte, dass die Expression von Lin28 korreliert mit Paclitaxel Widerstand in menschlichen Brustkrebszellen [8] verbunden ist. Darüber hinaus ist Lin28 Ausdruck mit pathologischen Ansprechen des Tumors bei lokal fortgeschrittenem Magenkrebspatienten unter neo-adjuvanten Chemotherapie in Verbindung gebracht. Allerdings ist der molekulare Mechanismus dieser Befunde ist unklar [9] zugrunde liegen.

Lin28 fördert tumorigenesis durch miRNAs Tumorsuppressor wie die let-7-Familie drücken, die mit Medikamentenresistenz assoziiert ist [8]. Doch als Ziel-miRNA von Lin28, miR-107 wird selten als drug resistance Faktor bei Magenkrebs genannt. MiR-107-Expression wird in einer Vielzahl von malignen Erkrankungen, wie Darmkrebs, Kopf- und Halskrebs, Bauchspeicheldrüsenkrebs und Magenkrebs verringert [10-13]. MiR-107 reguliert nachgeschaltete Gene, die bei der Zelldifferenzierung und Proliferation beteiligt sind, den Stoffwechsel, Stressreaktionen und die Bildung von Blutgefäßen [10-14]. In dieser Studie untersuchten wir die Lin28 /miR-107-Weg und seine Rolle in der Magenkrebszellen Resistenz gegen Chemotherapie. Wir haben ein neues potenzielles Ziel für chemotherapieresistenten Magenkrebs identifiziert.

Materialien und Methoden

1. Zellkultur und Plasmidtransfektion

Die menschlichen Magenkrebszelllinien MKN-28 und MKN-45 wurden als Geschenk von Professor Sung Hoon Noh (Yonsei University College of Medicine, Seoul, Korea) erhalten. Die Zellen wurden in RPMI 1640-Medium (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), ergänzt mit 10% fötalem Rinderserum (MP Biomedicals, Costa Mesa, CA, USA) in einer befeuchteten Atmosphäre mit 5% CO 2 bei 37 ° C. Oxaliplatin, Paclitaxel, Doxorubicin und Fluorouracil wurden von Sigma (St. Louis, MO) erworben. Das Plasmid pcDNA3.1-Lin28 wurde mit Xtreme GENE HP DNA Transfektionsreagenz (Roche Applied Science, Mannheim, Deutschland) transfiziert gemäß dem Protokoll des Herstellers. Stabile Lin28-exprimierenden Klone wurden weiter ausgewählt und kultiviert mit dem entsprechenden Neomycin-enthaltenden RPMI-1640-Medium.

2. Real-time quantitative PCR

Echtzeit-q-PCR-Analysen wurden mit dem ABI Prism 7500 Sequenz-Detektionssystem (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) durchgeführt. Kurz gesagt, eine 20-ul-Reaktionsgemisch, enthaltend 2 &mgr; l cDNA-Matrize und 1 &mgr; l jeweils von Sense- und Antisense-Primern (Promega Gotaq q-PCR® Master Mix-System, Madison, WI, USA) wurde wie folgt amplifiziert: Denaturierung bei 95 ° C für 10 min und 40 Zyklen von 95 ° C für 30 s, 60 ° C für 30 s und 72 ° C für 40 s. Echtzeit-q-PCR-Reaktionen wurden in dreifacher Ausfertigung für jede Probe durchgeführt und der Mittelwert wurde verwendet mRNA-Spiegel zu berechnen. Die quantitative Analyse wurde unter Verwendung des Vergleichs CT-Verfahren durchgeführt. Die Lin28 und miR-107 Kopienzahlen in Tumorgeweben wurden normalisiert auf die mRNA-Zahlen des Housekeeping-Gens Glycerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) kopieren Sie den Wert 2 ^{-Δ CT zu erhalten. Die Primer-Sequenzen sind wie folgt in Tabelle 1}

3. Zell Drug-Resistenz-Test

Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde ein MTT gemessen mit [3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5-Diphenyltetrazoliumbromid] Assay (Amresco, Solon, OH, USA) nach dem Protokoll des Herstellers. Die Zellen wurden in 96-Well-Platten in einer Dichte von 5 · 10 ^{3 Zellen pro Well ausgesät. Nach der Behandlung wurden die Zellen mit 5 mg /ml MTT für 4 h inkubiert. Dann wurde das Medium entfernt und 150 ml sterilisiertem DMSO-Lösung wurde zugegeben, gefolgt von Inkubation bei 37 ° C für 4 h. Der OD-Wert wurde bei den Wellenlängen 570 nm und 630 nm erhalten. Der OD-Wert (570 nm bis 630 nm) können indirekt die Zellzahl und Aktivität reflektieren nach der folgenden Formel: Überlebensrate = dosierten Gruppe OD570-630 /keine Dosisgruppe OD570-630. Ein Überleben der Zelle /Wirkstoffkonzentration Kurve wurde dann erzeugt.}

4. Western Blot-Analyse

Zelllysate durch Elektrophorese auf einem 4-15% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Minigel Gradienten getrennt wurden (SDS-PAGE) (Bio-Rad, Hercules, CA) und elektrophoretisch auf eine Nitrocellulosemembran (Amersham Pharmacia transferiert , Piscataway, NJ). Western-Blots wurden mit Antikörpern gegen Lin28, GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), Caspasen und gespaltene Caspasen sondiert, Cyclin D1, NF-kB (Cell Signaling, Beverly, MA), CDK6, C-myc (Abcam Trading ( Shanghai) Company, Shanghai, China), P-gp und Bcl-2 (Huan Biotechnologie, Beijing, China). Die Proteinbanden wurden durch verstärkte Chemilumineszenz (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ) detektiert.

5. Durchflusszytometrie-Assay

Die Zellen (2 * 10 ^{5 pro Vertiefung) wurden mit Paclitaxel in einem Sechs-Well-Platte und behandelt plattiert. Nach 72 h wurden die Zellen in 70% Ethanol fixiert und mit Propidiumiodid (PI) gefärbt. Der DNA-Gehalt wurde mit einem EPICS Profile II Durchflusszytometer (Beckman Coulter, Fullerton, CA) mit Multicycle Software (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA) analysiert. Alle Experimente wurden mindestens zweimal wiederholt. PI wurde auch in Verbindung mit Annexin V (BD Biosciences, San Jose, CA) verwendet, um zu bestimmen, wenn die Zellen lebensfähig waren, apoptotischen oder nekrotischen.}

6. MiRNA-Transfektion und Erkennung

Die Zellen wurden in Sechs-Well-Kulturplatten und transfiziert mit 50 nM pre-miR-107, bezogen von Applied Biosystems (Carlsbad, CA) oder steuern pre-miRNA gemäß dem Protokoll des Herstellers. Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde mit der TaqMan MicroRNA Reverse Transkription-Kit durchgeführt und die Fast Real-Time PCR-System (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) nach Protokollen des Herstellers. Die Falte Änderung der miR-107 microRNA Ebenen wurde berechnet und normiert auf eine hsa-mir-423 Ladekontrolle.

7. Tiere

Balb /c-Mäuse im Alter von 3-4 Wochen mit einem Gewicht von 18-22 g von SLAC Versuchstier Unternehmen erworben wurden (SCXK-2007-004, Shanghai, China) und beherbergt fünf pro Käfig in einem spezifischen Pathogen-frei (SPF) Umwelt. Die Tiere wurden für 7 Tage auf die Gehäuseeinrichtungen akklimatisieren, bevor die Versuche begannen. Tierbehandlungsprozeduren wurden in Übereinstimmung mit dem P. R. China Rechtsvorschriften über die Verwendung und Pflege von Labortieren und genehmigt durch das Versuchstier Ethikkommission der Universität Zhejiang (Zhejiang, China) durchgeführt.

8. Xenograft-Test und Behandlung

Kurz gesagt, Gruppen von sechs Balb /c-Mäuse wurden subkutan injiziert mit 1 * 10 <sup>6 MKN45 /Lin28, MKN45 /Vektor, oder MKN45 Zellen in der rechten Flanke. Das Tumorvolumen wurde nach folgender Formel berechnet: V = 1/2 * ein
* b
2, wobei ein
und b
sind die längsten und dem kürzesten Durchmesser der Tumormasse (in Millimetern), respectively. Wenn die Tumore etwa 80 mm 3 erreichten, wurden die Mäuse mit Injektion von ADM (50 mg /kg) und OXA (5um /kg) pro Woche für 2 Wochen behandelt. Quantitative Veränderungen des Körpergewichts und das Tumorvolumen wurden alle drei Tage von einer einzigen Person mit einer Waage und Messschieber gemessen. Keine Betäubungsmittel wurden in den Mausexperimenten.</sup>

9 verwendet. Die statistische Analyse

Alle Versuche wurden dreimal mit dreifachen Proben durchgeführt. Analyse der Varianz und t-Test nach Student verwendet, um die Werte der Test- und Kontrollproben zu vergleichen. Ein P-Wert von weniger als 0,05 wurde als statistisch signifikant. Statistica 6.1 Software wurde für alle statistischen Analysen verwendet. Die Signifikanz wurde durch den Student-t-Test ausgewertet.

Ergebnisse

• PLoS ONE: Die endoskopische Resektion mit Gastrectomy Im Vergleich zur Behandlung von Magenfrühkarzinomen: eine systematische Überprüfung und Meta-Analysis
• PLoS ONE: Bedeutung von Serum Pepsinogene als Biomarker für Magenkrebs und atrophische Gastritis Screening: eine systematische Überprüfung und Meta-Analysis