PLoS ONE: Padidėjusi Lin28 Mažina skrandžio vėžio ląsteles oksaliplatinos paklitakselis, doksorubicino ir fluorouracilo Chemosensitivity dalyje per MicroRNA-107

Anotacija

Aukštojo Lin28 išraiška yra susijęs su blogesnėmis patologinių naviko atsaką į lokaliai išplitusiu skrandžio vėžiu pacientams, kuriems atliekama indukcinę chemoterapiją. Tačiau Lin28 charakteristikos ir jos veikimo mechanizmas atsparumą chemoterapijos vis dar neaišku. Šiame tyrime, mes nustatėme, kad Lin28 transfekcijq į skrandžio vėžio ląstelių (MKN45 ir MKN28) padidino savo atsparumą Chemoterapija narkotikų oksaliplatina (oksa), paklitakselio (PTX), doksorubicino (ADM), ir fluorouracilo (5-FU), palyginti su skrandžio vėžio ląstelių, transfekuotų su kontroline vektorių. Kai triuškinantis Lin28 išraiška pagal Lin28 sirnr (siRNA) buvo įvertintas in vitro, mes nustatėme, kad atsparumas Chemoterapija narkotikų buvo sumažintas. Be to, mes nustatėme, kad Lin28 iki-reguliuoja C-myc ir P-gp ir žemyn reguliuoja Cylin D1. Galiausiai, mes nustatėme, kad Pasaulis-107 yra tikslinė MicroRNA iš Lin28 ir kad ji dalyvauja pasipriešinimo chemoterapijos mechanizmą. Mūsų rezultatai rodo, kad Lin28 /Pasaulis-107 kelias gali būti vienas iš daugelio signalų kelius reguliuojamų Lin28 ir susijusią su skrandžio vėžio Chemoterapija atsparumo

nurodomoji dalis:. Teng R Hu Y Zhou J Seifer B chen Y, Shen J, ir kt., (2015) Padidėjusi Lin28 Mažina skrandžio vėžio ląstelių Chemosensitivity oksaliplatinai paklitakselis, doksorubicino ir fluorouracilu dalies per MicroRNA-107. PLoS ONE 10 (12): e0143716. Doi: 10,1371 /journal.pone.0143716

redaktorius: Eimis Kyprianou Kentukio universiteto medicinos koledžo, JAV

Įstojo: Gegužės 23, 2015 m Priėmė: Lapkričio 8, 2015 m Paskelbta: Gruodžio 4, 2015

Visos teisės saugomos: © 2015 Teng et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos

Duomenų Prieinamumas: Visi susiję duomenys yra per popieriaus ir jo Pagalbinė informacija failus

finansavimas:. parama teikiama Zhejiang provincijos Gamtos mokslų fondo Kinija: LQ13H160014 [http://www.zjnsf.gov.cn/b/home.aspx] .

konkuruojančių interesų. autoriai paskelbė, kad konkuruojantys interesai egzistuoja

Įvadas

Skrandžio vėžys yra dažna klinikinė virškinimo sistema piktybinis navikas su mirtingumu, kad užima trečią vietą pasaulyje [1]. Mūsų šalis yra ta sritis, kuri yra linkę į skrandžio vėžį. Pastaraisiais metais, Neo-palaikomoji chemoterapija buvo skiriamas skrandžio vėžiu sergantiems pacientams pratęsti išlikimą. Nepaisant to, 5 metų išgyvenamumas tie sergantys išplitusiu skrandžio vėžiu yra vis dar mažesnis negu 30% [2]. Atsparumas Chemoterapija yra pagrindinė priežastis, dėl skrandžio vėžio ir kitų navikų gydymo nesėkmės. Todėl atsparumą skrandžio vėžio chemoterapijos mechanizmas šiuo metu kelia didelį susirūpinimą skrandžio vėžio tyrimų.

Lin28 yra labai užkonservuoti RNR privalomas baltymas, kuris buvo įrodyta, kad dalyvauti skatinančius kamieninės ląsteles ir išlaikyti stiebo Mobilaus ryšio-kaip ląstelių vėžys. Neseniai atlikti tyrimai, pranešė, kad nukrypęs nuo normos, aktyvavimo Lin28 gerai koreliuoja su įvairių vėžio, įskaitant krūties, kiaušidžių, plaučių, gaubtinės žarnos, ir kepenų vėžio [3-6] prognozė. Mūsų Ankstesnis tyrimas parodė, kad Lin28 išraiška taip pat yra susijęs su prasta išlikimo skrandžio vėžiu sergančių pacientų [7], o kitas tyrimas parodė, kad Lin28 išraiška koreliuoja su atsparumu paklitakselio žmogaus krūties vėžio ląstelių [8]. Be to, Lin28 išraiška yra susijęs su patologinio naviko atsako lokaliai išplitusiu skrandžio vėžiu pacientams, kuriems atliekama neo-palaikomoji chemoterapija. Tačiau molekulinės mechanizmo, lemiančio šias išvadas lieka neaišku [9].

Lin28 skatina tumorigenezei iki represuoti navikas slopinančias miRNAs pavyzdžiui, leisti-7 šeimos, kuri yra susijusi su atsparumo vaistams [8]. Tačiau, kaip tikslinės Mirna iš Lin28, PPN-107 yra retai minima kaip atsparumo narkotikų veiksnys skrandžio vėžiui. MiR-107 išraiška yra mažinamos piktybinių navikų, pavyzdžiui, gaubtinės žarnos vėžio, galvos ir kaklo vėžio, kasos vėžio ir skrandžio vėžio [10-13] įvairovė. MIR-107 reglamentuoja tolesnius genus, kurie dalyvauja ląstelių diferenciacijos ir proliferacijos, medžiagų apykaitai stresą ir kraujagyslių formavimosi [10-14]. Šiame tyrime mes tyrė Lin28 /Pasaulis-107 kelią ir savo vaidmenį skrandžio atsparumą vėžiui ląstelių chemoterapija. Galime nustatė naują potencialų tikslą chemoterapijos atsparus skrandžio vėžio.

Medžiagos ir metodai

1. Ląstelių kultūros ir plazmidės transfekcija

žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijas MKN-28 ir MKN-45 buvo gauta kaip dovana profesoriaus Sung Hoon Noh (Yonsei universiteto medicinos koledžo, Seulas, Korėja). Ląstelės buvo auginamos RPMI 1640 terpė (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, JAV) papildytas 10% vaisiaus galvijų serumo ( "MP Biomedicals, Kosta Mesa, Kalifornija, JAV) drėgnoje atmosferoje, kuriame 5% CO2 37 ° C. Oksaliplatina, paklitakselio, doksorubicino ir fluorouracilu buvo įsigytas iš Sigma (St Louis, MO). Plazmidės pcDNA3.1-Lin28 buvo pernešta su Xtreme GENE HP DNR transfekcijq reagentas (Roche Applied Science, Manheimas, Vokietija) pagal gamintojo protokolą. Stabilios Lin28 išreiškiančias, iš klonai buvo papildomai atrinktų ir kultivuojamos su atitinkamu neomicino, kurių sudėtyje yra RPMI 1640 terpėje.

2. Realaus laiko kiekybine PGR

Realaus laiko Q-PGR analizė buvo atlikta su ABI PRISM 7500 sekos nustatymo sistemą (Applied Biosystems Foster City, Kalifornija, JAV). Trumpai tariant, 20-mikrol reakcijos mišinys yra 2 įxL kDNR šabloną ir 1 iL kas jausmą ir anti-prasminį pradmenis (Promega Gotaq Q-PCR® magistras Mix sistemos, Madison, WI, JAV) buvo papildytas taip: denatūruoti 95 ° C 10 min ir 40 ciklų 95 ° C temperatūroje 30 S, 60 ° C temperatūroje 30 s, ir 72 ° C temperatūroje 40 s. Realaus laiko q-PGR reakcijos buvo pakartotas tris kartus kiekvienam mėginiui, ir vidutinės vertės, buvo naudojamas apskaičiuoti iRNR lygiui. Kiekybinė analizė atlikta naudojant lyginamąją CT metodą. Į Lin28 ir Pasaulis-107 kopijų skaičiaus ir navikų audiniuose buvo standartizuoti iRNR kopijuoti numerius į namų ruošos genas gliceraldehid 3-fosfato dehidrogenazės (GAPDH) gauti vertę 2 ^{-Δ CT. Grunto sekos yra taip 1 lentelėje}

3. Ląstelių narkotikų atsparumas Analizės

ląstelių gyvybingumas buvo matuojamas naudojant MTT [3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-Diphenyltetrazolium bromidas] analizė (Amresco, Solonas, OH, JAV) pagal gamintojo protokolą. Ląstelės buvo pasėjamos 96 duobučių lėkštelėse esant 5 * 10 ^{3 ląstelių viename gerai tankis. Po gydymo, ląstelės buvo inkubuojamos su 5 mg /ml MTT 4 h. Tada, vidutinės buvo pašalintas ir buvo pridėta 150 ml sterilizuotas DMSO tirpalo, po to inkubacijos 37 ° C temperatūroje iki 4 h. Optinio tankio vertė buvo gautas tuo bangų ilgiai nm iki 570 nm ir 630 nm bangos ilgiui. Optinio tankio vertė (570 nm iki 630 nm) gali netiesiogiai atspindi ląstelių skaičių ir veiklą pagal šią formulę: išgyvenamumas = dozuojamas grupę OD570-630 /dozės grupė OD570-630. tada Mobilųjį išlikimo /vaisto koncentracija kreivė buvo sukurtas.}

4. Western blot analizė

Mobilaus ryšio Lizatai atskirti elektroforezės dėl 4-15% natrio dodecilo sulfato-poliakrilamido gradiento minigel (SDSPAGE) (Bio-Rad, Hercules, CA) ir elektroforezės būdu perkelti į nitroceliuliozės membranos (Amersham "Pharmacia" , Piskatavėjus NJ). Vakarų dėmės buvo tyrinėjo su antikūnų Lin28, GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), kaspazių ir suskaldyti kaspazių, cikloniniai D1, NF-kB (Cell signalizacijos, Beverly, MA), CDK6, C-myc (Abcam Trading ( Šanchajus) Įmonės, Šanchajus, Kinija), P-gp, ir BCL-2 (Chuanas biotechnologijos, Pekinas, Kinija). Baltymų juostos buvo aptikta glaudesnio cheminės liuminescencijos (Amersham Pharmacia, Piskatavėjus NJ).

5. Tėkmės citometrijos Analizės

ląstelių (2 * 10 ^{5 proc pat) buvo padengtas iš šešių šulinėlių plokštelės ir gydomi paklitakseliu. Po to, kai 72 h, ląstelės buvo nustatyta 70% etanolio ir nudažomi su propidiumo jodido (PI). DNR turinys buvo analizuojamas su epų Profilis II srautas citometro (Beckman Coulter, Fullerton, CA) su Multicycle programinės įrangos (Phoenix srauto sistemos, San Diego, CA). Visi eksperimentai buvo pakartoti bent du kartus. VšĮ taip pat buvo naudojamas kartu su aneksinu (BD biomokslų, San Jose, CA) siekiant nustatyti, ar ląstelės buvo gyvybinga, aprotoninis arba nekrozės.}

6. Mirna transfekcijq ir aptikimo

Ląstelės buvo padengtas iš šešių duobučių kultūros plokštės ir perkeltų su 50 nm anksto miR-107 įsigijo iš taikomosios Biosystems (Carlsbad, CA) arba kontroliuoti pasirengimo Mirna pagal gamintojo protokolą. Kiekybinis Realaus laiko polimerazės grandininės reakcijos (PGR) buvo atliktas naudojant TaqMan MicroRNA atvirkštinės transkripcijos rinkinys ir Greitas realiojo laiko PGR sistema (taikoma BIOSYSTEMS, Karlovi Varai, CA) pagal gamintojo protokolus. Sulenktas pokytis Pasaulis-107 MicroRNA lygiais buvo apskaičiuojamas ir normalizuotas į HSA-mir-423 pakrovimo kontrolę.

7. Gyvūnai

BALB /c pelių amžiaus 3-4 savaites, sveriantiems 18-22 g nupirkti iš SLAC laboratorinių gyvūnų bendrovės (SCXK-2007-004, Šanchajus, Kinija) ir apgyvendinami penkis narve konkretus patogenais neužkrėstų (VTF) aplinkoje. Gyvūnai buvo leista Aklimatizuojama į būsto įrenginių, skirtų prieš 7 dienas iki eksperimentai prasidėjo. Gyvūnų tvarkymo procedūros buvo atliktos laikantis p R. Kinijos teisės aktų dėl naudojimo ir priežiūros laboratorinių gyvūnų ir patvirtintas Eksperimentinių gyvūnų etikos komiteto Zhejiang universiteto (Zhejiang, Kinija).

8. Ksenografiniuose Analizės ir gydymas

Trumpai grupės po šešis BALB /c pelių buvo švirkščiamas po oda 1 * 10 <sup>6 MKN45 /Lin28, MKN45 /Vektorius arba MKN45 ląstelės dešinio krašto. Navikas apimtis buvo apskaičiuojamas pagal formulę: V = 1/2 *,
* b
2, kur parsisiųsti ir b
yra ilgiausia ir trumpiausia skersmenys naviko masė (milimetrais), atitinkamai. Kai augliai pasiekiama maždaug 80 mm 3, pelės buvo gydomi injekcijos ADM (50 mg /kg kūno svorio) ir OXA (5uM /kg) kas savaitę 2 savaites. Kiekybiniai pokyčiai kūno svorio, ir naviko tūrio buvo matuojamas kas tris dienas vieno individo naudojant pusiausvyrą ir Vernier apkabos. Nėra anestetikai buvo naudojamas pelės eksperimentams.</sup>

9. Statistinę analizę

Visi eksperimentai buvo atliekamas tris kartus su trijų dalių mėginių. Dispersinė analizė ir Stjudento t-testas buvo naudojamas palyginti bandymo ir kontrolinių mėginių vertybes. P-reikšmė mažesnė nei 0,05 buvo laikomas statistiškai reikšmingas. Statistica 6.1 programinė įranga buvo naudojama visiems statistinės analizės. Reikšmė buvo įvertintas mokinių t-testą.

Rezultatai

1. In vitro bandymų chemoterapija jautrumo pokyčių skrandžio vėžio ląstelių stabiliai išreiškė Lin28

Du padermių skrandžio vėžio ląstelių neigiami Lin28 išraiškos (MKN45 ir MKN28) buvo atrinkti ir kultūringas. Mes nustatė skrandžio vėžio ląsteles stabilios Lin28 išraiška nuo atsparių perkeltų klonų (MKN45 /Lin28 /C2 ir MKN28 /Lin28 /Parlamento dokumentas C3), naudojant Imunoblotingo ir Q-PCR (1 pav).

pasirinktą MKN45 /Lin28C2, MKN45 /Vector, MKN45, MKN28 /Lin28C3, MKN28 /Vector ir MKN28 ląstelės buvo išbandytas chemoterapija narkotikų jautrumo. Mes pasirinkome šiuos keturis dažniausiai naudojami klinikinių chemoterapijos vaistai, gydant skrandžio vėžiu: oksa, PTX ADM, o 5-FU. Gydymas oksa, PTX ir ADM truko 48 valandas, o 5-FU gydymas truko 72 valandų. Po Lin28 transfekciją, MKN45 ir MKN28 ląstelės turėjo sumažėjęs jautrumas OXA, PTX ADM ir 5-FU, kad labiausiai matėsi už OXA ir PTX. IC50 reikšmės buvo daugiau nei du kartus, kad kontrolinės grupės (1 pav).

Dėl MTT pagrindu, mes panaudojome tėkmės citometrijos aptikti į apoptozės skirtumus Lin28-teigiamų ir Lin28 neigiami ląstelių po chemoterapijos PTX poveikio. MKN45 /Lin28, MKN45 /Vektorius ir MKN45 ląstelių grupės Gauta 0 m ir 0,1 mkm PTX gydymas 24 valandų, o dvigubas dažymas buvo atliekamas siekiant nustatyti ląstelių apoptozę. Apoptozės norma transfekuotų Lin28 ląstelių buvo mažesnis už ne-transfekuota ląstelių (p < 0,05). Be to, Vakarų dėmės baltymų surinkti iš ląstelių gydomi 0,1 mkm PTX parodė, kad apoptozė buvo sumažintas MKN45 /Lin28 ląstelių kaip parodyta retesniais kaspazės 9 ir kaspazė 3 (2 pav) aktyvacijos.

Praeinantis transfekavimas siRNA-Lin28 turėtų slopinti Lin28 raiškos lygį MKN45 /Lin28 ir MKN28 /Lin28 ląstelių 48 valandas po perdavimo pagal eksperimentinių gairių reagentų gamintojo. Lin28 baltymo ekspresija buvo aptikta, o susijęs su narkotikais jautrumas išbandytas. Lin28 RNR išraiška skrandžio vėžio ląstelių buvo aptikta Q-PGR, o baltymo ekspresija buvo aptikta Imunoblotingo (3 pav).

"Q-PGR parodė, kad Lin28 iRNR raiška MKN45 /Lin28 /Si-Lin28 ( 48 h) ir MKN45 /Lin28 /SI-Lin28 (72 val) ląstelės buvo daug mažesnis nei MKN45 /Lin28 /SI-kontrolinių ląstelių (p < 0,01). Tai transfekcija poveikis taip pat buvo patikrintas MKN28 /Lin28 ląsteles. Imunoblotingu atskleidė, kad Lin28 SI-RNR smarkiai slopino Lin28 baltymų ekspresiją MKN45 /Lin28 ir MKN28 /Lin28 ląsteles.

MTT buvo atliktas keturių tipų ląstelių (MKN45 /Lin28 /SI-kontrolė, MKN45 /Lin28 /SI-Lin28, MKN28 /Lin28 /SI-kontrolė ir MKN28 /Lin28 /SI-Lin28 ląstelės), kurie buvo pernešta su Lin28 siRNA 48 valandas įvertinti chemoterapijos jautrumą. Mes pasirinkome naudoti chemoterapijos vaistai, kurie turėjo didžiausią ryškus poveikis pasirengimo išbandymas: oksa, PTX ir ADM. Mes pasirinkome koncentracijos gradientas 5-6 preliminariais rezultatais išankstiniais eksperimentams. Kišimasis siRNA sumažino Lin28 išraiška, ir Lin28 teigiamų ląstelių linijos turėjo padidėjęs jautrumas chemoterapiniais vaistais (3 pav).

Kitas aptikta ląstelių jautrumą skirtingų chemoterapijos vaistai po žemyn reguliavimas Lin28 , Ląstelės buvo suskirstyti į 4 grupes, MKN45 /Lin28 /SI-kontrolės, MKN45 /Lin28 /SI-Lin28, MKN28 /Lin28 /SI-kontrolės ir MKN28 /Lin28 /SI-Lin28 ir buvo išbandyta su chemoterapija narkotikų OXA ir PTX atitinkamai , Chemoterapija narkotikų koncentracija (OXA 3,2 mikrogramai /ml ir PTX 1 mkm) buvo atrinkti pagal preliminarius eksperimentų rezultatais. Iš apoptozės MKN45 /Lin28 ir MKN28 /Lin28 ląstelių skaičius buvo mažesnis nei MKN45 /Lin28 /Si-Lin28 ir MKN28 /Lin28 /SI-Lin28 ląstelių (p < 0,05). Šis rezultatas rodo, kad žemyn reguliavimas Lin28 išraiškos gali padidinti ląstelių apoptozę (3 pav).

2. Molekulinius mechanizmus, kuriais

Mes nustatėme, narkotikų atsparumu susijusių genų ekspresijos lygis Q-PCR MKN45 /Lin28 ir MKN45 /vektoriaus cells.P-gp ir C-Myc RNR koncentracija buvo Lin28 pokyčiai chemoterapijos jautrumo ženkliai padidėjo ir cikloniniai D1 RNR lygis sumažėjo, o kita BCL-2, CDK6 NF-kB TOP II neparodė reikšmingo skirtumo tarp MKN45 /Lin28 ir MKN45 /vektoriaus cells.Also tai vaistas atsparumas susijusių genų išraiškos buvo tiriamas Vakarų dėmė į MKN45 /Lin28 ir MKN45 /Vector ląstelių, kurios rodė žymius tendenciją, kad P-gp ir C-MYC baltymų išraiška padidėjo, o cikloniniai D1 sumažėjo. Tačiau BCL-2 ekspresija sumažėjo NF-kB išraiška nepasikeitė, ir išraiška cikloniniai D1 ir baltymų kinazės CDK6 buvo sumažintas (4 pav).

Po Lin28 išraiška buvo slopinamas transfekciją su Lin28 siRNA, buvo iš naujo įvertintas RNR lygis P-gp, C-myc ir cikloniniai D1. Po to, kai sumažinti RNR lygio Lin28, P-glikoproteino ir C-myc buvo reikšmingai mažina reguliuojama, o nuo ciklino D1 plazmoje reikšmingai padidėjo. Aptikimo P-gp, C-myc, ir nuo ciklino D1 išraiškos Imunoblotingo metodu parodė, kad po to, kai slopinimo Lin28 išraiškos, P-gp ir C-myc baltymų raiškos buvo reikšmingai mažina reguliuojama, o nuo ciklino D1 išraiška buvo žymiai aktyvinama ( 4 pav).

3. MIR-107 yra tikslinė MicroRNA iš Lin28

Nors bandymų Lin28 RNR ir Pasaulis-107 lygį skrandžio vėžio ląstelių linijų, mes nustatėme, tarpusavio slopina Lin28 ir miR-107 į MKN45 ir AGS ląstelių linijų. Be to, PPN-107 buvo žemyn reguliuojama MKN45 /Lin28 ir MKN28 /Lin28 ląsteles. Nokdaunas iš Lin28 išraiška pasikeitė šį slopinimą. Be tolesnių eksperimentų, Lin28 teigiamų ląstelių, MKN45 /Lin28 ir MKN28 /Lin28 buvo pernešta su išankstinio mir-107, o vėliau buvo vadinama MKN45 /Lin28 /pre-miR-107 ir MKN28 /Lin28 /Pre ir miR-107 ląstelės. Transfekuoti anksto Pasaulis-kontrolės ląstelės buvo vadinamas MKN45 /Lin28 /pre-mir-kontrolė ir MKN28 /Lin28 /pre-mir-Control. Anti-Pasaulis-107 arba kontrolės transfekcija į Lin28 neigiami elementai, MKN45 /Vector, davė MKN45 /Vector /anti-mir-107 ir MKN45 /Vector /anti-mir-kontrolinių ląstelių, atitinkamai. Keturiasdešimt aštuonias valandas po transfekciją, RNR buvo surinkta ir taikomos Q-PGR, kad būtų nustatytos Pasaulis-107 raiškos skirtumus MKN45 /Lin28, MKN28 /Lin28, MKN45 /vektorius, ir MKN28 /Vector ląsteles. Iš triuškinantis iš Lin28 išraiška pagal Lin28 siRNA poveikis taip pat buvo tiriamas. Po transfekciją su Lin28, PPN-107 išraiška buvo gerokai žemyn reguliuojama, o po triuškinantis iš Lin28 išraiškos, iš miR-107 išraiška padidėjo. Keturiasdešimt aštuonias valandas po transfekciją išankstinio miR-107, Lin28 RNR buvo žymiai sumažėjo, o 96 valandos po to, kai transfekciją, Lin28 baltymų raiška vis dar buvo mažesnis nei neturinčių perkeltų kontroline grupe. Ši išvada rodo, kad Pasaulis-107, gali reguliuoti Lin28 (5 pav) išraiška.

4. MIR-107 dalyvauja Lin28 sąlygojamą atsparumo Chemoterapija narkotikų

chemoterapija jautrumas 4 ląstelių grupių, MKN45 /Lin28 /iš anksto Pasaulis-kontrolės, MKN45 /Lin28 /iš anksto Pasaulis-107, MKN28 /Lin28 /prieš Pasaulis-kontrolė ir MKN28 /Lin28 /iš anksto Pasaulis-107, buvo išbandytas taikant MTT metodu 48 valandas po transfekciją su iš anksto miR-107. Mes pasirinkome chemoterapiniais vaistai, kurie turėjo didžiausią ryškus poveikis per iš anksto testavimo, OXA, PTX ir ADM ir pasirinktas koncentracijos gradientą 5-6 Preliminariais rezultatais išankstiniais eksperimentams. Rezultatai rodo, kad išankstinio-miR-107 įvedimas į Lin28-teigiamomis ląstelėmis gali padidinti ląstelių jautrumą chemoterapija. Apoptozė bandymai parodė, kad MKN45 /Lin28 apoptozinių ląstelių skaičius padidėjo po transfekciją su iš anksto miR-107 (p < 0,05). MTT bandymas MKN45 /Lin28 /anti-miR kontrolei ir MKN45 /Lin28 /Anti-Pasaulis-107 chemoterapija jautrumas parodė, kad slopinimas išraiška miR-107 MKN45 sumažino jautrumą PTX (5 pav).

Iki Imunoblotingo ir q-PGR, mes aptiko narkotikų pasipriešinimo susijusių genų ir baltymų ekspresijos lygį MKN45 /Lin28 ląstelių, kurios buvo transfektuotose anksto miR-107, įskaitant C-myc, P-gp ir CIKLONAS D1. Rezultatai parodė, kad praėjus 48 valandoms po transfekciją su miR-107, RNR ir baltymų ekspresijos C-myc ir P-gp sumažėjo (p < 0,01), tuo tarpu nuo ciklino D1 išraiška padidėjo (p < 0.05) (Fig 5).

5. Lin28 susijęs atsparumo Chemoterapija narkotikų in vivo

Po 2 chemoterapijos ciklų, mes nustatėme, kad ksenografiniuose navikai MKN45 /Lin28 ląstelių nesumažino apimtis ir tapo didesnis nei kitų grupių (MKN45 /Vector ir MKN45 ). Į tiek MKN45 /Lin28 ir MKN45 /Vektorius grupes, iš pelių mirė, todėl chemoterapija, kuri buvo sustabdyta. Augliai buvo pašalintų ir jų apimtys analizuojami. Mes nustatėme, kad MKN45 /Lin28 ksenografiniuose navikai buvo didesnis nei kitų navikų po ADM ir oksa chemoterapijos (p < 0,01). (Pav 6)

Diskusijos

Šiame tyrime mes ištirti iš Lin28 raiškos asociacija su Chemoterapija jautrumo skrandžio vėžio ląsteles. Mes nustatėme, kad transfekcija su Lin28 sumažina skrandžio vėžio ląstelių linijų MKN45 ir MKN28 iki keturių tipų chemoterapiniais reagentų (oksa, PTX ADM ir 5-FU) jautrumą. Naudojant siRNA trukdžių technologiją triuškinantis Lin28 išraiška gali pakeisti Chemoterapija pasipriešinimą. Mes taip pat parodė, kad Pasaulis-107 gali žemyn reguliuoti Lin28 išraiška, o taip pat tarnavo kaip viena iš potencialių tikslinių mikro RNR, kuri reglamentuoja Lin28. Padidėjusi Lin28 iki reglamentuojamo C-myc ir P-gp, o žemyn reguliuojama cikloniniai D1, tai fenomenai gali pakeisti iki Lin28 siRNA ar transfekciją išankstinio miR-107. Tai gali būti kritinių mechanizmus, pagal kuriuos Lin28 sumažėjo chemosensitivity skrandžio vėžio ląsteles. Mūsų žiniomis, tai pirmasis tyrimas, rodo Lin28 /Pasaulis-107 signalizacijos kelias gali būti įtraukti į atsparumo Chemoterapija narkotikų skrandžio vėžio.

Chemoterapija yra vienas iš pagrindinių gydymo skrandžio vėžiu sergančių pacientų, bet daugiau nei 50% pacientų bus tęsiamas iki atsparumo chemoterapijos. Galimos mechanizmai Chemoterapija atsparumo skrandžio vėžiu šiuo metu priskiriama prie transeuropinio transporto tinklo membranos vežimą ABC transporterius glutationo S transferazės, apie DNR topoizomerazės veiklą, vėžio genų p53 mutacija ir apoptozę susiję kelius. Neseniai atliktas tyrimas nustatė, kad MicroRNA vaidina svarbų vaidmenį skrandžio vėžio chemoterapijos atsparumo vaistams [15]. Į atsparumo naviko ląstelės modelį, buvo pastebėta, kad vėžys kamieninės ląstelės taip pat vaidina svarbų vaidmenį į atsparumo chemoterapija. C-myc genas yra vienas iš paviršinių žymenų vėžio kamieninių ląstelių, bet taip pat onkogeną, susijusios su neribotam proliferacija, begalinės Uwiecznienie, ir ląsteles, esančias dalijimosi [16] skatinimo. Vienas tyrimas pranešė, kad 40% pacientų, sergančių skrandžio vėžiu yra, C-myc genų raiška ir kad didesnis, C-MYC išraiška yra susijęs su blogesne prognoze [16-18]. Tyrimai taip pat pranešė, ryšį tarp C-MYC genų ir apoptozės. , C-MYC išraiška gali sukelti sumažėjo naviko ląstelių apoptozę. Ląstelių aprotoninis norma ir jautrumas sukeltų veiksnių yra priklausomos nuo baltymų koncentracijos C-MYC [19]. Be to, C-myc raiškos yra susijęs su spinduliuotės ir atsparumo chemoterapijos. Be to, C-myc gali iki reguliuojama P-glikoproteino, kuris gali sukelti effluxing chemoterapinių reagentų pradėta atsparumo chemoterapijos [20]. Mobilusis ciklas areštas gali turėti įtakos vėžinių ląstelių atsaką į tam tikrus chemoterapijos vaistai (pvz PTX), kuri vaidina svarbų vaidmenį G2 /S "etapas sumažinti narkotikų jautrumą. Ląstelės ciklo baltymų cikloniniai D turi tris potipius, D1, D2, D3 ir ir yra ląstelės ciklo pradžia veiksnys. Jo slopinimas transformuojantis augimo faktorius -β1 (TGF-β1) apsaugo ląsteles nuo patekti į mobilųjį ciklą, kad jie likti tam ramybės būklę [21]. CIKLONAS D specialiai dera su CDK4 /6 fosforilinti ir inaktyvuoja Retinoblastoma baltymų (PRB), tokiu būdu prisidedant prie G1 /S perėjimo ir DNR sintezę [21] inicijavimo. Atsižvelgiant į dabartinę studijų, mes nustatėme, Lin28 nebuvo susijusios su BCL-2, NF-kB ir TOPO II skrandžio vėžio ląsteles. Tarp Lin28 ir mikro RNR partnerystė buvo gerai žinomi, pavyzdžiui, leisti-7, PPN-200c, PPN-143 [4,22]. Lin28 raiškos žemyn reguliuoja MicroRNA, o MicroRNA taip pat gali neigiamai paveikti Lin28 išraiška. Lin28 kartu su TUT4 yra neigiamas reguliatorius, kuri turi įtakos brendimui ir homeostazę mikro RNR [4,22]. Reguliuojant pasroviui genus, MicroRNA dalyvauja ląstelių diferenciacijos ir proliferacijos, ląstelių metabolizmą, stresą ir kraujagyslių susidarymą. Cheng et al [23] nustatė, kad po slopina Pasaulis-107, buvo skatinama HeLa gimdos kaklelio vėžio ląstelių ir A549 plaučių vėžio ląstelių augimą. Marijn'as et al [24] nustatė, kad miR-107 ekspresija vaistams atsparių kiaušidžių vėžio ląstelių buvo žemyn reguliuojama. Mūsų tyrimas parodė, kad Lin28 taip pat gali apriboti PPN-107 brendimą ir įvedimas miR-107 padidinti skrandžio vėžio ląstelių Chemoterapija jautrumą OXA, PTX ir ADM. Po to, kai transfekciją anti-miR-107, šis jautrumas sumažėjo. Pasirengimo Pasaulis-107 sukėlė į Lin28 išraiška sumažėjo, rodo, jog Lin28 /Pasaulis-107 kelias gali būti įtraukti į chemosensitivity pokyčių skrandžio vėžio.

Apibendrinant, mes parodėme, kad Lin28 gali slopinti išraiška miR-107, taip iki reguliavimo, C-myc P-gp ir žemyn reguliavimo cikloniniai D1, o vėliau sukelti Chemoterapija atsparumo skrandžio vėžio ląsteles. Lin28 /miR-107 kelias gali būti patiekiami kaip vienas iš daugelio signaliniu keliu, kuris yra susietas su skrandžio vėžio chemotaksio atsparumo. Mūsų tyrimas gali suteikti naujų įžvalgų skrandžio vėžys Atsparumas cheminėms mechanizmą. Lin28 /Pasaulis-107, gali būti naujas galimą terapinį tikslai chemoterapijos atsparus skrandžio vėžio.

Pagalbinė informacija
S1 lentelę. Minimalūs duomenys visų šių veikėjų
Doi: /. Journal.pone.0143716.s001
(XLSX)
10,1371

• PLoS ONE: Endoskopinė rezekcija Palyginti su pašalintas skrandis gydyti anksti skrandžio vėžys: sisteminė apžvalga ir metaanalizė
• PLoS ONE: reikšmė Serumas Pepsinogens kaip biologinis skrandžio vėžio ir Atrophic gastritas atranka: sisteminė apžvalga ir meta-Analysis