PLoS ONE: n yli-ilmentyminen Lin28 Vähentää Kemosensitiivisyys mahasyövän Cells oksaliplatiinista, Paclitaxel, doksorubisiini, ja Fluorouracil osan kautta microRNA-107

tiivistelmä

Higher Lin28 ilmentyminen liittyy huonompi pathologic kasvainvasteita paikallisesti edennyt mahasyöpä potilailla, joille neoadjuvanttikemoterapian. Kuitenkin ominaisuudet Lin28 ja sen vaikutusmekanismi kemoterapiassa vastus on vielä epäselvä. Tässä tutkimuksessa havaitsimme, että transfektointi Lin28 mahalaukun syöpäsoluihin (MKN45 ja MKN28) kasvattivat resistenssi chemo huumeiden oksaliplatiinin (oksa), paklitakseli (PTX), doksorubisiini (ADM), ja fluorourasiilin (5-Fu) verrattuna mahalaukun syövän solut, jotka oli transfektoitu kontrollivektorilla. Kun pudotus Lin28 ilmentymisen Lin28 pieniä häiritseviä RNA (siRNA) arvioitiin in vitro, olemme huomanneet, että vastustuskyky kemoterapia-lääkkeiden väheni. Lisäksi olemme havainneet, että Lin28 up-regulation C-myc ja P-gp ja down-regulation sylinteririvin D1. Lopulta huomasimme, että miR-107 on tavoite microRNA on Lin28 ja että se osallistuu mekanismiin kemoterapian resistenssin. Tuloksemme viittaavat siihen, että Lin28 /miR-107 polku voisi olla yksi monista signalointireittien säätelevät Lin28 ja liittyy mahasyövän chemo-vastus.

Citation: Teng R, Hu Y, Zhou J, Seifer B, Chen Y, Shen J, et al. (2015) yli-ilmentäminen Lin28 Vähentää Kemosensitiivisyys mahasyövän Cells oksaliplatiinista, Paclitaxel, doksorubisiini, ja Fluorouracil osan kautta microRNA-107. PLoS ONE 10 (12): e0143716. doi: 10,1371 /journal.pone.0143716

Editor: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, Yhdysvallat |

vastaanotettu: 23 kesäkuu 2015; Hyväksytty: 08 marraskuu 2015; Julkaistu: 04 joulukuu 2015

Copyright: © 2015 Teng et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään

Data Saatavuus: kaikki asiaankuuluvat tiedot kuuluvat paperin ja sen tukeminen Information tiedostoja.

Rahoitus: tuettiin Zhejiang Provincial Natural Science Foundation of China: LQ13H160014 [http://www.zjnsf.gov.cn/b/home.aspx] .

kilpailevat edut: kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

Mahalaukun syöpä on yleinen kliininen ruoansulatuskanavan pahanlaatuinen kasvain, jossa kuolevuus, joka on kolmannella sijalla maailmassa [1]. Maamme on alue, joka on altis mahasyövän. Viime vuosina, neo-adjuvanttihoitoa on annettu mahalaukun syöpäpotilaille pidentää elinaikaa. Tästä huolimatta 5 vuoden pysyvyys niistä, joilla on edennyt mahasyöpä on edelleen pienempi kuin 30% [2]. Kemoterapia vastus on johtava syy epäonnistumiseen mahasyövän ja muissa elimissä hoitoja. Sen vuoksi mekanismi, kemoterapian resistenssin mahalaukun syöpä on tällä hetkellä suuri huolenaihe mahasyövän tutkimuksissa.

Lin28 on erittäin konservoitunut RNA-sitovaa proteiinia, joka on osoitettu osallistua indusoimaan pluripotenttien kantasolujen ja ylläpitämisessä varsi kennomainen solujen syöpä. Viimeaikaiset tutkimukset ovat raportoineet, että poikkeava aktivaatio Lin28 korreloi hyvin ennusteeseen eri syöpien, mukaan lukien rinta-, munasarja-, keuhko-, paksusuoli-, ja maksasyöpä [3-6]. Edellisessä tutkimus osoitti, että Lin28 ilmentymistä liittyy myös huono säilyminen maha- syöpäpotilailla [7], ja toinen tutkimus osoitti, että ilmentyminen Lin28 korreloi paklitakselin resistenssin ihmisen rintasyöpäsoluissa [8]. Lisäksi Lin28 ilmentyminen liittyy patologiseen tuumorivaste paikallisesti edennyt mahasyöpä potilailla, joille tehdään neo-adjuvanttihoitoa. Kuitenkin molekyylimekanismin taustalla Näiden löydösten edelleen epäselvä [9].

Lin28 edistää kasvaimen kehittymisen mukaan tukahduttaa tuumorisuppressoriproteiinia miRNA kuten let-7 perhe, joka liittyy lääkeresistenssi [8]. Kuitenkin, koska tavoite miRNA on Lin28, miR-107 on harvoin mainitaan lääkeresistenssin tekijä mahalaukun syövän. MiR-107 ilmentyminen on vähentynyt erilaisia ​​pahanlaatuisia kasvaimia, kuten paksusuolen syöpä, pään ja kaulan alueen syöpä, haimasyöpä ja mahasyöpä [10-13]. MiR-107 säätelee loppupään geenejä, jotka osallistuvat solujen erilaistumiseen ja proliferaatioon, aineenvaihdunta, stressistä ja verisuonten muodostumista [10-14]. Tässä tutkimuksessa tutkimme Lin28 /miR-107-reitin ja sen rooli mahasyövän solun resistentiksi kemoterapiaa. Olemme ehkä tunnistettu uusi potentiaalinen kohde kemoterapiaa kestäviä mahasyövässä.

Materiaalit ja menetelmät

1. Soluviljely ja plasmiditransfektiolla

Ihmisen mahalaukun syövän solulinjoissa MKN-28 ja MKN-45 saatiin lahjana professori Sung Hoon Noh (Yonsein University College of Medicine, Seoul, Korea). Soluja viljeltiin RPMI 1640-alustassa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), johon oli lisätty 10% naudan sikiön seerumia (MP Biomedicals, Costa Mesa, CA, USA) kostutetussa atmosfäärissä, joka sisälsi 5% CO2, 37 ° C. Oksaliplatiini, paklitakseli, doksorubisiini, ja fluorourasiilin hankittiin Sigmalta (St. Louis, MO). Plasmidi pcDNA3.1-Lin28 transfektoitiin Xtreme GENE HP-DNA-transfektio Reagent (Roche Applied Science, Mannheim, Saksa) mukaan valmistajan protokollaa. Vakaa Lin28-ilmentäviä klooneja edelleen valittu ja viljellään sopivalla neomysiinin sisältävää RPMI 1640-väliaine.

2. Reaaliaikainen kvantitatiivinen PCR

Reaaliaikainen q-PCR-analyysit suoritettiin ABI Prism 7500 järjestyksessä tunnistusjärjestelmä (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Lyhyesti, 20-il reaktioseosta, joka sisälsi 2 ui cDNA-templaattia ja 1 ui kutakin sense- ja anti-sense-alukkeita (Promega Gotaq q-PCR® Master Mix järjestelmä, Madison, WI, USA) monistettiin seuraavasti: denaturointi 95 ° C: ssa 10 minuuttia ja 40 sykliä 95 ° C 30 s, 60 ° C: ssa 30 s, ja 72 ° C: ssa 40 s. Reaaliaikainen q-PCR-reaktiot suoritettiin kolmena rinnakkaisena kullekin näytteelle, ja keskiarvo oli käytetään laskettaessa mRNA-tasoja. Kvantitatiivinen analyysi suoritettiin käyttäen vertailevaa CT menetelmällä. Lin28 ja miR-107 kopiomäärän tuumorikudoksissa normalisoitiin mRNA kopioida numerot housekeeping-geenin glyseraldehydi 3-fosfaattidehydrogenaasi (GAPDH), jolloin saadaan arvo 2 ^{-Δ CT. Alukesekvenssejä ovat seuraavat taulukossa 1.}

3. Cell Lääkeresistenssimerkki- määritys

Solujen elävyys mitattiin käyttäen MTT [3- (4,5-dimetyylitiatsol-2-yyli) -2,5-difenyylitetratsoliumbromidi] määritys (Amresco, Solon, OH, USA) mukaan valmistajan protokollaa. Solut siirrostettiin 96-kuoppaisille levyille tiheydellä 5 * 10 ^{3 solua kuoppaa kohti. Käsittelyn jälkeen soluja inkuboitiin 5 mg /ml MTT: ssa 4 tuntia. Sitten alusta poistettiin ja 150 ml: aan steriloitua DMSO-liuosta lisättiin, mitä seurasi inkubointi 37 ° C: ssa 4 h. OD-arvo saatiin aallonpituuksilla 570 nm ja 630 nm. OD-arvo (570 nm: stä 630 nm) voidaan epäsuorasti heijastaa solujen määrä ja aktiivisuus seuraavalla kaavalla: eloonjäämisaste = annostellaan ryhmä OD570-630 /ei annoksen ryhmässä OD570-630. Solu selviytymisen /lääkepitoisuus käyrä sitten luotu.}

4. Western Blot-analyysi

Solulysaatit eroteltiin elektroforeesilla 4-15% natriumdodekyylisulfaatti-polyakryyliamidi- gradientti minigeelissä (SDSPAGE) (Bio-Rad, Hercules, CA) ja siirrettiin elektroforeettisesti nitroselluloosamembraanille (Amersham Pharmacia , Piscataway, NJ). Western blotit tutkittiin vasta-aineita Lin28, GAPDH (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), kaspaaseiksi ja pilkottu caspases, sykliini D1, NF-kB (Cell Signaling, Beverly, MA), CDK6, C-myc (Abcam Trading ( Shanghai) Company, Shanghai, Kiina), P-gp, ja Bcl-2 (Huan Biotechnology, Peking, Kiina). Proteiinin vyöhykkeet havaittiin tehostetulla kemiluminesenssilla (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ).

5. Virtaussytometrinen määritys

Solut (2 * 10 ^{5 per kuoppa) maljattiin kuuden kuoppalevylle ja hoidettiin paklitakselilla. 72 tunnin kuluttua solut kiinnitettiin 70% etanolilla ja värjättiin propidiumjodidilla (PI). DNA pitoisuus analysoitiin kanssa Eepokset Profile II virtaussytometrillä (Beckman Coulter, Fullerton, CA) Multicycle ohjelmisto (Phoenix Flow Systems, San Diego, CA). Kaikki kokeet toistettiin vähintään kaksi kertaa. PI myös käyttää yhdessä anneksiini V (BD Biosciences, San Jose, CA), voiko solut olivat elinkelpoisia, apoptoottisia tai nekroottisen.}

6. MiRNA Transfektio ja Detection

Solut maljattiin kuusikuoppaisille viljelylevyille ja transfektoitiin 50 nM esi-miR-107 ostettiin Applied Biosystems (Carlsbad, CA) tai kontrolli-pre-miRNA mukaan valmistajan protokollaa. Kvantitatiivinen reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (PCR) suoritettiin käyttäen TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit ja Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems, Carlsbad, CA) mukaan valmistajan protokollia. Taitteen muutos miR-107 microRNA tasoa laskettiin ja normalisoidaan HSA-mir-423 latauskontrollina.

7. Eläimet

BALB /c-hiiret vuotiaiden 3-4 viikkoa painavat 18-22 g ostettiin SLAC laboratorioeläinten yritys (SCXK-2007-004, Shanghai, Kiina) ja sijoitettu viisi häkkiä kohti tietyllä patogeenittomassa (SPF) ympäristö. Eläinten annettiin sopeutua koteloon tilat 7 päivää ennen kokeiden aloittamista. Eläinten käsittely menettelyt suoritettiin mukaisesti P. R. Kiinan lainsäädäntö käytöstä ja hoidosta koe-eläinten ja hyväksymä Experimental Animal eettinen komitea Zhejiangin yliopistossa (Zhejiang, Kiina).

8. -ksenografti Määritys ja hoito

Lyhyesti, kuuden ryhmissä BALB /c-hiiriin injektoitiin subkutaanisesti 1 * 10 <sup>6 MKN45 /Lin28, MKN45 /vektori, tai MKN45 soluja oikeaan kylkeen. Kasvaimen tilavuus laskettiin käyttäen kaavaa: V = 1/2 *
* b
2, jossa
ja b
ovat pisin ja lyhin halkaisija kasvaimen massan (mm), vastaavasti. Kun kasvaimet olivat saavuttaneet noin 80 mm 3, hiiret käsiteltiin injektoimalla ADM (50 mg /kg) ja oksa (5 um /kg) kerran viikossa 2 viikkoa. Määrällisiä muutoksia kehon painoa ja tuumorin tilavuus mitattiin kolmen päivän välein yhden yksittäisen arvion avulla ja Vernier jarrusatulat. Ei anestesia käytettiin hiiren kokeissa.</sup>

9. Tilastollinen analyysi

Kaikki kokeet suoritettiin kolme kertaa kolmena kappaleena näytteitä. Varianssianalyysi ja Studentin t-testiä käytettiin vertaamaan arvot testin ja kontrollinäytteestä. P-arvo on alle 0,05 katsottiin tilastollisesti merkitsevä. Statistica- 6.1 ohjelmistoa käytettiin kaikkiin tilastolliset analyysit. Merkityksen arvioitiin opiskelijan t-testissä.

Tulokset

1. In vitro -testaus, kemoterapian herkkyyden muutokset mahasyövän soluissa, jotka ekspressoivat stabiilisti Lin28

kaksi kannat mahalaukun syöpäsolujen negatiivinen Lin28 lauseke (MKN45 ja MKN28) valittiin ja viljeltiin. Havaitsimme mahasyövän solujen vakaa Lin28 ilme resistenteistä transfektoiduista klooneista (MKN45 /Lin28 /C2 ja MKN28 /Lin28 /C3) käyttäen Western blotting ja q-PCR (Kuva 1).

Valittu MKN45 /Lin28C2, MKN45 /Vector, MKN45, MKN28 /Lin28C3, MKN28 /vector, ja MKN28 solut testattiin kemoterapian lääkeherkkyysmenetelmien. Valitsimme seuraavat neljä yleisesti käytetty kliininen kemoterapiaa hoitoon tarkoitetut lääkkeet mahasyövän: oksa, PTX, ADM, ja 5-Fu. Hoito oksa, PTX, ja ADM kesti 48 tuntia, kun taas 5-Fu hoito kesti 72 tuntia. Sen jälkeen Lin28 transfektion, MKN45 ja MKN28 soluilla oli vähentynyt herkkyys oksa, PTX, ADM, ja 5-Fu, joka näkyi voimakkaimmin oksa ja PTX. IC 50-arvot olivat enemmän kuin kaksi kertaa kontrolliryhmän (kuvio 1).

perusteella MTT-määritystä, käytimme virtaussytometrialla havaita eroja apoptoosi Lin28-positiivisia ja Lin28-negatiivisia soluja kemoterapian jälkeen PTX altistuksen. MKN45 /Lin28, MKN45 /vektori ja MKN45 solun ryhmät saivat 0 uM ja 0,1 uM PTX hoidon 24 tunnin ajan, ja kaksinkertainen värjäys suoritettiin havaitsemiseksi solun apoptoosin. Apoptoottisen määrä transfektoituja Lin28 solujen oli pienempi kuin ei-transfektoiduissa soluissa (p < 0,05). Lisäksi Western blot proteiinia kerättiin solut käsiteltiin 0,1 uM PTX osoitti, että apoptoosin pienennettiin MKN45 /Lin28 soluja, kuten on esitetty pienennyksen kaspaasi 9 ja kaspaasi 3 (kuvio 2).

Transient transfektointi siRNA-Lin28 pitäisi estää Lin28 ekspressiotasot MKN45 /Lin28 ja MKN28 /Lin28 soluista 48 tunnin kuluttua siirron mukaan kokeellisen ohjeiden reagenssin valmistajan. Lin28-proteiinin ekspressiota havaittiin, ja siihen liittyvä lääkeaineen herkkyys testattiin. Lin28 RNA ilmentymisen mahalaukun syövän soluissa havaittiin q-PCR, kun taas proteiinin ekspressio havaittiin Western-blottauksella (kuvio 3).

Q-PCR osoitti, että Lin28 mRNA: n ekspression MKN45 /Lin28 /si-Lin28 ( 48 h) ja MKN45 /Lin28 /si-Lin28 (72 h) solut oli paljon alhaisempi kuin MKN45 /Lin28 /si-kontrollisoluja (p < 0,01). Tämä transfektio vaikutus varmistettiin myös in MKN28 /Lin28 soluja. Western blotting osoitti, että Lin28 si-RNA inhiboi merkittävästi Lin28 proteiinin ilmentymistä MKN45 /Lin28 ja MKN28 /Lin28 soluja.

MTT-määritys suoritettiin neljä solutyypeissä (MKN45 /Lin28 /si-ohjaus, MKN45 /Lin28 /si-Lin28, MKN28 /Lin28 /si-ohjaus, ja MKN28 /Lin28 /si-Lin28 solut), jotka transfektoitiin Lin28 siRNA 48 tuntia arvioida kemoterapian herkkyyttä. Päätimme käyttää kemoterapiaa huumeita, joka oli selvin vaikutuksia pre-testaus: oksa, PTX ja ADM. Valitsimme väkevyysero 5-6 mukaan alustavien tulosten alustavia kokeita. Häiriöitä siRNA vähentää ilmentymistä Lin28, ja Lin28-positiivisia solulinjoja, oli lisääntynyt herkkyys kemoterapeuttisten (kuvio 3).

vieressä havaitaan solujen herkkyys eri kemoterapialääkkeillä jälkeen down-regulation of Lin28 . Solut jaettiin 4 ryhmään, MKN45 /Lin28 /si-ohjaus, MKN45 /Lin28 /si-Lin28, MKN28 /Lin28 /SI-ohjaus ja MKN28 /Lin28 /si-Lin28, ja testattiin kemoterapiaa huumeiden oksa ja PTX vastaavasti . Kemoterapia lääkepitoisuudet (oksa 3,2 ug /ml, ja PTX 1 uM) valittiin tulosten mukaan alustavien kokeiden. Määrän apoptoottisia MKN45 /Lin28 ja MKN28 /Lin28 soluja oli vähemmän kuin MKN45 /Lin28 /si-Lin28 ja MKN28 /Lin28 /si-Lin28 solujen (p < 0,05). Tämä tulos osoittaa, että alas-säätely Lin28 ilmaisun voi lisätä solujen apoptoosia (kuvio 3).

2. Molekyylitason mekanismeja, joilla Lin28 muutoksia kemoterapiaa herkkyyden

Olemme havainneet lääkeresistensseihin liittyvien geeniekspressiotasot Q-PCR MKN45 /Lin28 ja MKN45 /vektori cells.P-gp, ja C-myc-RNA-tasot olivat merkittävästi lisääntynyt ja sykliini D1 RNA taso oli laskenut, kun taas muut Bcl-2, CDK6, NF-kB, TOP II ei osoittanut merkittävää eroa MKN45 /Lin28 ja MKN45 /vektori cells.Also nämä lääkeresistenssin liittyviä geeniekspressioiden tutkittiin western blot in MKN45 /Lin28 ja MKN45 /Vector soluja, mikä osoitti Negatiivisen kehityksen P-gp ja C-myc-proteiinin ilmentyminen lisääntyi, kun taas sykliini D1 vähentynyt. Kuitenkin, Bcl-2: n ilmentymisen pienentynyt, NF-kB ilmentyminen ei muuttunut, ja ekspressio sykliini D1 ja proteiinikinaasi CDK6 väheni (kuvio 4).

Kun Lin28 ilmentyminen inhiboitui transfektoimalla Lin28 siRNA, RNA tasot P-gp, C-myc ja sykliini D1 arvioitiin uudelleen. Pienentämisen jälkeen RNA taso Lin28, P-gp ja C-myc olivat merkitsevästi alassäädetty, kun taas sykliini D1 tasoa huomattavasti. Detection of P-gp, C-myc, ja sykliini D1 ilmentyminen western-blottauksella osoitti, että sen jälkeen, kun esto Lin28 ilmentymisen, P-gp: n ja C-myc-proteiinin ekspressio oli merkittävästi alas-säädellä, kun taas ekspressio sykliini D1 oli merkittävästi voimistunut ( Kuva 4).

3. MiR-107 on tavoite microRNA on Lin28

Vaikka testaus Lin28 RNA ja miR-107 tasot mahasyövän solulinjoissa, löydettiin keskinäisen inhibition Lin28 ja miR-107 on MKN45 ja AGS solulinjat. Lisäksi miR-107 oli säädellä vähentävästi MKN45 /Lin28 ja MKN28 /Lin28 soluja. Knockdown ilmentymisen Lin28 päinvastaiseksi eston. Vuonna jatkokokeilu, Lin28-positiivisten solujen, MKN45 /Lin28 ja MKN28 /Lin28, transfektoitiin valmiiksi mir-107 ja sittemmin nimitystä MKN45 /Lin28 /pre-miR-107 ja MKN28 /Lin28 /pre- miR-107-soluja. Transfektoidut valmiiksi miR-ohjaus soluja kutsuttiin MKN45 /Lin28 /pre-miR-Control ja MKN28 /Lin28 /pre-miR-Control. Anti-miR-107 tai kont- osaksi Lin28-negatiivisia soluja, MKN45 /Vector tuotti MKN45 /Vector /anti-miR-107 ja MKN45 /Vector /anti-miR-Verrokkisoluja, vastaavasti. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen RNA otettiin talteen ja altistettiin q-PCR havaita eroja miR-107 ilmentymisen MKN45 /Lin28, MKN28 /Lin28, MKN45 /vector, ja MKN28 /vektori-soluja. Vaikutus knockdovvn Lin28 ilmentymisen Lin28 siRNA arvioitiin myös. Sen jälkeen transfektion Lin28, miR-107 ilmentyminen oli merkitsevästi alassäädetty, kun taas jälkeen knockdovvn Lin28 ilmaisun, ilmaus miR-107 lisääntynyt. Neljäkymmentäkahdeksan tuntia transfektion jälkeen pre-miR-107, Lin28 RNA-tasot olivat merkittävästi vähentynyt, ja 96 tuntia transfektion jälkeen, Lin28 proteiinin ekspressio oli kuitenkin alhaisempi kuin ei-transfektoitujen kontrolliryhmään. Tämä havainto osoittaa, että miR-107 voi säätelemään Lin28 (kuvio 5).

4. MiR-107 osallistuu Lin28 välittämää kemiallis-lääkeresistenssin

Kemoterapia herkkyyttä 4 solun ryhmien MKN45 /Lin28 /pre-miR-ohjaus, MKN45 /Lin28 /pre-miR-107, MKN28 /Lin28 /pre-miR-ohjaus ja MKN28 /Lin28 /pre-miR-107, testattiin käyttäen MTT-menetelmällä 48 tuntia transfektion jälkeen ennalta miR-107. Valitsimme kemoterapiaa huumeita, joka oli selvin vaikutuksia edeltävissä testaus, oksa, PTX ja ADM, ja valitut konsentraatiogradientti 5-6 mukaan alustavat tulokset alustavia kokeita. Tulokset viittaavat siihen, että käyttöönotto ennalta miR-107 osaksi Lin28-positiivisten solujen voi lisätä solujen herkkyyttä kemoterapiaa. Apoptoosin testaus osoitti, että määrä MKN45 /Lin28 apoptoottiset solut kasvoivat transfektion jälkeen ennalta miR-107 (p < 0,05). MTT testaus MKN45 /Lin28 /anti-miR-ohjaus ja MKN45 /Lin28 /anti-miR-107 kemoterapian herkkyys osoitti, että inhibitio ilmentymisen miR-107 MKN45 vähensi herkkyys PTX (kuvio 5).

western-blottauksella ja q-PCR, olemme havainneet lääkeresistenssin liittyvän geenin ja proteiinin ekspressiotasot MKN45 /Lin28-soluja, jotka oli transfektoitu ennen miR-107, mukaan lukien C-myc, P-gp: n ja sykliini- D1. Tulokset osoittivat, että 48 tunnin kuluttua transfektion miR-107, RNA ja proteiini ilmentymistä C-myc: n ja P-gp vähentynyt (p < 0,01), kun taas ilmentyminen sykliini D1 lisääntynyt (p < 0,05) (kuvio 5).

5. Lin28 liittyvät kemiallis-lääkeresistenssin in vivo

Kun 2 solunsalpaajajakson, huomasimme, että ksenograftikasvaimissa on MKN45 /Lin28 solut eivät vähennä äänenvoimakkuutta ja laajentuneet kuin muiden ryhmien (MKN45 /Vector ja MKN45 ). Sekä MKN45 /Lin28 ja MKN45 /vector ryhmiä, yksi hiiriä kuoli, joten kemoterapian lopetettiin. Kasvaimet leikattiin irti ja niiden määrät analysoitiin. Huomasimme, että MKN45 /Lin28 ksenograftikasvaimissa olivat suurempia kuin muissa kasvaimissa, kun ADM ja oksa kemoterapiaa (p < 0,01) (kuvio 6).

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme tutkineet yhdistys Lin28 ilmaisun kanssa kemiallis-herkkyys mahalaukun syöpäsoluja. Olemme havainneet, että transfektio Lin28 vähentää herkkyyttä mahasyövän solulinjoissa MKN45 ja MKN28 neljä eri kemoterapeuttisten reagenssit (oksa, PTX, ADM, ja 5-Fu). Käyttämällä siRNA häiriöitä tekniikkaa pudotus Lin28 ilmaisun voisi kääntää chemo-vastus. Osoitimme myös, että miR-107 voisi vaimennussäätelevät Lin28 ilme, kun on myös toiminut yhtenä mahdollisista kohde MikroRNA joka säätelee Lin28. Yli-ilmentymisen Lin28 sääteli C-myc ja P-gp, vaikka alassäädetty sykliini D1, tämä ilmiöitä voisi kääntää mukaan Lin28 siRNA tai transfektiolla pre-miR-107. Tämä saattaa olla kriittinen mekanismeja, joiden Lin28 laski kemosensi- mahalaukun syöpäsoluja. Tietääksemme tämä on ensimmäinen tutkimus, joka osoittaa Lin28 /miR-107 signalointireitin saattaa liittyä kemoterapia-lääkeresistenssin mahasyövässä.

Kemoterapia on yksi tärkeä hoidon mahasyövän potilaille, mutta enemmän yli 50%: lla potilaista etenee kemoterapian resistenssin. Mahdolliset mekanismit kemiallis-resistenssin mahasyövässä parhaillaan ajatella sisältävän transmembraaninen kuljetus ABC kuljettajat, glutationi-S-transferaasi, aktiivisuus DNA topoisomeraasi, syöpää geeni p53-mutaation ja apoptoosin liittyviä reittejä. Tuoreessa tutkimuksessa todettiin, että microRNA tärkeä rooli mahalaukun syövän kemoterapiassa lääkeresistensseihin [15]. Kasvaimen solun resistentiksi malli, havaittiin, että syövän kantasoluja on myös tärkeä rooli resistenssin kemoterapiaa. C-myc-geeni on yksi pintamerkkiaineita syövän kantasoluja, vaan myös onkogeeni liittyy toistaiseksi leviämisen, ääretön kuolemattomaksi, ja edistää solunjakautumisen [16]. Yksi tutkimus raportoi, että 40%: lla mahalaukun syöpä on C-myc-geenin yli-ilmentymisen ja että suuremmat C-myc ilmentyminen liittyy huonompi ennuste [16-18]. Tutkimukset ovat myös raportoitu korrelaatio C-myc-geenin ja apoptoosin. C-myc ilmentyminen saattaa heikentää tuumorisolujen apoptoosin. Solu apoptoottinen nopeus ja herkkyys aiheuttama tekijät ovat riippuvaisia ​​C-myc-proteiinin tasot [19]. Lisäksi C-myc yliekspressio liittyy säteilyn ja kemoterapian resistenssin. Lisäksi C-myc voi säädelty P-gp: n, joka voi indusoida effluxing kemoterapeuttisten reagenssien johti kemoterapian resistenssin [20]. Solusyklin pysähtymisen voi vaikuttaa vaste syövän solujen tiettyihin kemoterapiaa huumeiden (kuten PTX), joka on tärkeä merkitys G2 /S faasin vähentää lääkeaineen herkkyys. Solusyklin proteiini sykliini D on kolme alatyyppiä, D1, D2, ja D3, ja se on solusyklin aloittamiseen tekijä. Sen tukahduttaminen muuttamalla kasvutekijä -β1 (TGF-β1) estää soluja pääsemästä solusyklin niin, että ne pysyvät lepotilassa [21]. Sykliini D nimenomaan yhdistyy CDK4 /6 fosfory- ja inaktivoimaan retinoblastoomaproteiinia (pRb), mikä osaltaan G1 /S siirtyminen ja aloittamista DNA-synteesin [21]. Esillä olevassa tutkimuksessa olemme huomanneet, Lin28 ei ole merkitystä, jossa Bcl-2, NF-kB ja TOPO II mahalaukun syöpäsoluja. Kumppanuus Lin28 ja MikroRNA on vakiintunut, kuten let-7, miR-200c, miR-143 [4,22]. Lin28 yli-ilmentyminen down-regulation microRNA, kun taas microRNA voi myös vaikuttaa kielteisesti ilmaus Lin28. Lin28 yhdessä TUT4 muodostaa negatiivinen säätelijä, joka vaikuttaa kypsymisen ja homeostaasin MikroRNA [4,22]. Säätämällä alavirran geenien microRNA on mukana solujen erilaistumiseen ja proliferaatioon, solujen aineenvaihduntaa, stressistä ja verisuonten muodostumista. Cheng et ai [23] havaitsivat, että sen jälkeen, kun estävä miR-107 kasvu HeLa kohdunkaulan syövän solujen ja A549 keuhkosyövän soluja nostettiin. Marijn ym [24] todettiin, että ilmentyminen miR-107 lääkeresistenttiä munasarjasyöpäsoluja oli alassäädetty. Meidän tutkimuksessa todettiin, että Lin28 voi myös hillitä kypsymisen miR-107, ja käyttöönotto miR-107 mahan syöpäsolu kemiallis-herkkyyttä oksa, PTX, ja ADM. Transfektion jälkeen anti-miR-107, tämä herkkyys laski. Pre-miR-107 vähensi ilmentymisen Lin28, mikä osoittaa, että Lin28 /miR-107 reitti voi olla mukana kemosensitiivisyys muutokset mahasyövän.

Yhteenvetona osoitti, että Lin28 voi estää ilmentyminen miR-107, jolloin ylös säätelevä C-myc, P-gp ja alaspäin säätäminen sykliini D1, myöhemmin johtaa kemiallis-vastus mahalaukun syöpäsoluja. Lin28 /miR-107 reitti voidaan toimi yksi monista signalointireittien, joka liittyy mahasyövän Chemo-resistenssi. Tutkimuksemme voi tarjota uusia oivalluksia mahasyövän chemoresistance mekanismi. Lin28 /miR-107 voi olla uusi mahdollisia terapeuttisia kohteita kemoterapiaa kestäviä mahasyövässä.

tukeminen Information
S1 Taulukko. Vähäinen tiedot kaikista näistä luvuista.
Doi: 10,1371 /journal.pone.0143716.s001
(XLSX) B

• PLoS ONE: Endoskooppinen Kaarileikkaus Verrattuna gastrektomia Kohtele Early mahasyövän: järjestelmällinen katsaus ja meta-analyysi
• PLoS One: merkitys Seerumin Pepsinogeenit biomarkkerina mahasyövän ja atrofisen gastriitin Screening: järjestelmällinen katsaus ja meta-analyysi