PLoS ONE: Atomic Einblick in die Altered O6-Methylguanine-DNA-Methyltransferase-Protein Architektur in Magenkrebs

Abstrakt

O ^{6-methylguanine-DNA-Methyltransferase (MGMT) ist einer der wichtigsten DNA-Reparatur-Protein, das die alkalyting Mittel-induzierte DNA-Schäden entgegenwirkt durch O ersetzt 6-methylguanine ( mutagene Läsion) zu unterdrücken zu Guanin zurück, schließlich die Mismatch Fehler und Doppelstrang-Vernetzungen. Exonische Veränderungen in Form von Nukleotid-Polymorphismus kann zu einer veränderten Proteinstruktur, die wiederum mit dem Verlust der Funktion führen kann. In der vorliegenden Studie konzentrierten wir uns auf die Bevölkerung für hohe Exposition gegenüber Alkylierungsmitteln gefürchtet wegen ihrer typischen und speziellen Ernährungsgewohnheiten. Zu diesem Zweck gepoolt Magenkrebs-Patienten aus der Bevölkerung für die Mutations-Screening eines bestimmten fehleranfälligen Region von MGMT-Gens ausgewählt wurden. Wir fanden heraus, dass fast 40% der untersuchten Tumorproben Missense-Mutation beherbergte am Codon 151 resultierende in Serine zu Isoleucin Variation. Diese Veränderung führte über die strukturelle Unordnung zu bringen, anschließend in eine nachfolgende Haupt stöchiometrische Varianz in Erkennungsdomäne, Substratbindung und Selektivität Schleife des aktiven Zentrums des MGMT-Protein, wie unter virtuellen Mikroskop Moleküldynamik-Simulation (MDS) beobachtet. Das Atom Einblick in MGMT-Protein durch rechnerische Ansatz zeigte eine signifikante Veränderung des intra molekularem Wasserstoff Bindungsmuster, was zu der beobachteten strukturellen Anomalien führen. Um die Mutations Auswirkungen auf die regulatorischen Stecker von MGMT untersuchen, die das Protein in einer DNA-Bindungsposition hält, wurde ein MDS basierte Analyse durchgeführt auf, alle bekannten physikalisch interagieren Aminosäuren im Wesentlichen in Gruppen zusammengefasst auf der Grundlage ihrer Position und Funktion. Die Ergebnisse, die durch physikalische funktionelle clustering von Protein zeigten, dass die identifizierte Mutation in der Nähe des aktiven Zentrums von MGMT-Protein bewirkt, dass die lokale und globale Destabilisierung eines Proteins entweder durch die stabilisierenden Salzbrücken in Cluster C3, C4 beseitigen und C5 oder von lokal auf C3-C4-Cluster das "Protein stabilisierende hing" gemappt destabilisieren, vor dem aktiven Zentrum}

Citation. Chikan NA, Bukhari S, Shabir N, Amin A, Shafi S, Qadri RA, et al. (2015) Atomic Einblick in die Altered O ^{6-Methylguanine-DNA-Methyltransferase-Protein Architektur in Magenkrebs. PLoS ONE 10 (5): e0127741. doi: 10.1371 /journal.pone.0127741}

Academic Herausgeber: Reiner Albert Veitia, Institut Jacques Monod, FRANKREICH

Empfangen: 16. Dezember 2014; Akzeptiert: 19. April 2015; Veröffentlicht: 26. Mai 2015

Copyright: © 2015 Chikan et al. Dies ist ein offener Zugang Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons Attribution verteilt, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorgesehen sind der ursprüngliche Autor und Quelle genannt

Datenverfügbarkeit: Alle relevanten Daten sind innerhalb des Papiers und seiner Hintergrundinformationen Dateien

Finanzierung:. die Forschung von VIT Universität wissenschaftlicher Mitarbeiter Gewährung und die Finanzierung Agentur hatte keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung zu veröffentlichen, oder die Zubereitung finanziert wurde des Manuskripts

konkurrierende Interessen:. die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Obwohl rückläufig ist, die Krankheit von Magenkrebs, nach GOLOBOCON 2012 ist. immer noch die dritthäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle weltweit [1, 2]. In der Pathogenese dieser Erkrankung, verschiedene genetische und molekulare Veränderungen stattfinden, um die maligne Transformation der Magenschleimhaut führen [3]. Diese Transformation ist ein mehrstufiger Prozess, der die Abnormalitäten in wichtigen zellulären Funktionen, wie DNA-Reparatur, Adhäsion, Signaltransduktion, Zelldifferenzierung und andere [4,5] bringt. Karzinogene wie N-Nitrosodimethylamin, Methyl Nitrosourea (NMU), N-Methyl-N'-nitro-N-Nitroguanidin usw. alkylierenden zur Bildung führen von O ^{6-Methylguanine, ein DNA-Addukt, dessen Anwesenheit führt zur Induktion von Mutationen ( G: C-A: T-Übergang) und die Ergebnisse in der Entwicklung von Krebs [6-10]. MGMT Was ist der verantwortliche Enzym für die Reparatur O 6-methylguanine Addukte [11-13]. MGMT ist ein selbstmörderischer Enzym, das somit bei Codon 145 im Protein eine Methylgruppe aus dem O 6-Position in Guanin und überträgt sie an ihren eigenen Cystinrests entfernt, sich zu inaktivieren, während Guanin Reparatur [14]. Unter der Einwirkung von NMU wurden MGMT-defekten Mäusen beobachtet Krebs zu entwickeln [15], während sie als transgene Mäuse zusätzliche Kopien des fremden MGMT Gen trägt weniger zur Krankheit anfällig waren [16] .Die, genetischen Polymorphismus dieses Enzym hat bewiesen ein potentieller Risikofaktor für Krebs sein [17-22]. Diese Studie konzentriert sich somit auf Mutations-Profilierung von fehleranfälligen Region von Exon 5 von MGMT, die für das aktive Zentrum des Proteins kodiert, nämlich aktive Stelle verantwortlich von Domänen umgeben für auf DNA halten [13]. Die repräsentative Population von Patienten mit Magenkrebs, die für diese Studie ausgewählt wurde, stellt eine einzigartige Kohorte im Wesentlichen hoch zu Nahrungs Alkylierungsmitteln ausgesetzt sind [6, 23-28].}

Die Verwendung von Insilico
Techniken, um die Wirkung des Polymorphismus auf die Proteinstruktur und Dynamik wurde in der Praxis und eine Fülle von Arbeit zu verstehen, hat sich in dieser Hinsicht [29-32] geschehen. Die computergestützte Vorhersageverfahren unter Verwendung von evolutionären und Struktur basierte Vorhersage gibt einen Einblick in die schädigende Fähigkeit des Polymorphismus [33]. Die Molekulardynamik kann die Konformationsänderungen verwendet werden, zu beobachten, der Polymorphismus in dem Protein verursachen kann. Diese Konformationsänderungen in der dreidimensionalen Struktur des Proteins kann die physiologischen Affinitäten beeinflussen und verschiedene biochemische Weg-Wechselwirkungen. Um die Wirkung der Mutation an evolutionären sowie atomarer Ebene untersuchen, unter Verwendung von Insilico Prognosen verschiedenen Servern sowie MDS des Wildtyp (wt) und Mutant (Mu) MGMT-Protein wurde durchgeführt. Für MDS Protein Trajektorien und Atom-Interaktionsanalyse, GROMACS eingebauten Tools verwendet wurden. Hauptkomponentenanalyse (PCA) wurde durchgeführt, die Flexibilität der beiden Strukturen zu schätzen. Freie Energielandschaften (FEL) von nativen und Mu MGMT wurden untersucht auch die Auswirkungen der Mutation zu verstehen.

Ergebnisse und Diskussion

Die Exon 5-Segment von MGMT-Gen wurde erfolgreich von allen Proben verstärkt . Amplicons nach Sequenzierung eines Transmutation im Codon 151AGC zeigte, die Sequenzen von denen zu GenBank Lagerzugangsnummern KM000795 und KM000796 vorgelegt. Die in silico-Tools, die mögliche schädliche Wirkung der Mutation zu untersuchen wurden sorgfältig ausgewählt, um jeden Faktor in betrachtet wird und doppelt durch ein anderes Werkzeug überprüft, die unterschiedliche Algorithmus verwendet. Die Einzelheiten der Server, die in unserer Studie verwendet werden, sind in Tabelle S1 beschrieben, in denen Algorithmus arbeitet und Kriterien für die Vorhersage gegeben wird. Ausgewählte Server prognostiziert die Mutation schädlich. Die MDS-Simulation Trajektorien für 30ns laufen für wt und mutierte Protein analysiert wurden ausgiebig gromacs eingebauten Werkzeugen. S1 Abb zeigt ein nsSNP bei Codon 151, die zu einer Missense-Mutation von Ser zu Ile führt, ansonsten in seiner Wildtypform hilft bei der Protein-DNA-Wechselwirkungen [34-36]. Wie in Abbildung 1 gezeigt, wtMGMT (PDBID: 1T39). SER 151, außer mit Thymin normalen elektrostatische Wechselwirkung macht auch mit ihm über Amidstickstoff zwei Wasserstoffbrücken gebildet

2 zeigt die Schnappschüsse von sowohl wt und Mu Strukturen in unterschiedlichen Zeitintervallen, die Festlegung des Synopse der Wirkung der Mutation auf die Strukturdynamik von MGMT. Von Schnappschüssen, wird die Mu andere Struktur als aufschlussreich Konformation erweitert, auch Schrauben gebildet Konformation an der Aminosäure Nummer 87 bis 90, eine Idee zu geben, dass die Mutation nicht die strukturelle Kompaktheit des Proteins begünstigen, die inturn seiner kompromittiert und aberrierte Konformation führt mit einem erheblichen strukturellen Verschiebung, die bei der Entstehung von nicht mehr existierenden Proteinfunktion schwenkbar ist [37]. Nach der visuellen Analyse wurde g_rms Werkzeug verwendet, um die RMSD zur Proteinatome zu berechnen, die Ausgangsstruktur als Referenz verwendet. Die mutierte Struktur zeigte abrupte Erhöhung in RMSD bei etwa 17 ns. Auf die Anomalie auf der Strukturebene zu beobachten, fanden wir, dass die spiralförmige und Schleife Inhalt des mutierten Struktur variiert (3A). Die RMSD vom Durchschnitt im Laufe der Zeit als RMSF bezeichnet wird, g_rmsf verwendet wurde, die atomare Standardabweichung und auf Beobachtung zu berechnen, zeigte die Mu-Struktur eine höhere Flexibilität. Die RMSF beider Strukturen zeigten eine geringfügige Änderung am Rest 151, wird aber erheblich in einem Protein Loop-Bereich von 27 bis 53 (3B) variiert, die die resultierende eines inter langen Bereich tertiäre Wechselwirkung Variation sein könnte. In r_rmsf Werkzeug wurde die Option-OQ verwendet, um den RMSF Wert in B-Faktor-Werte und implizite sie auf der mittleren Struktur (blau, die die stabilste und rot meisten schwankend) zu konvertieren. Der Vergleichs B Faktor Vorsprung (S2A) Bild auf wt und Mu MGMT zeigt in erster Linie Schwankungen Schwankungen innerhalb der mittleren Struktur, uns einen Einblick in die Veränderung der Schwankungsmuster zwischen den beiden Strukturen zu geben. Die Färbung Muster ist standardmäßig zwischen blau bis rot. Eine signifikante Änderung in Fluktuation in Mu Struktur beobachtet, außer dem der durchschnittliche Sekundärstruktur-Layout (S2B) Abb erheblich unterschied was wiederum bedeutet, dass die Mu an der DNA-Reparatur nachteilig sein kann.

Um die Form des Proteins bei jeder Analyse gegebenen Zeitpunkt g_ gyrate Werkzeug verwendet wurde, welche der Gyrationsradius von einer Gruppe von Atomen entlang der x-, y- und z-Achse, als eine Funktion der Zeit berechnet. Unsere Ergebnisse zeigen die größere Abweichung in Trägheitsradien in Mu Struktur, bestanden nach 17 ns ausgeführt (S3) Abb. Während, wie es ist bekannt, dass die MGMT-Struktur nicht zu den großen Umfang variiert, wenn MGMT-gebundenen DNA-Struktur, was auf eine stabile gebundene Struktur über enge Verbindung von Erkennungsresten (Ala126, Ala127, Ala129, Gly131 und Gly132) im Vergleich zu, und Ser93, Thr95, Gln115, Asn123 und Ser151, in Wechselwirkung mit dem Phosphatrückgrat der DNA [36] da jedoch die radi Trägheits aufgezeichnet wurde aufgrund der Mutation erhöht werden, und daher vermutlich die umgeworfen erweiterten Proteinstruktur vermutlich ungeschickt verschiebt die Arginine finger (intrahelicale positioniert Arg128) von seiner Position, die zur Förderung der Umklappen Nukleotid in die MGMT aktiven Stelle verantwortlich ist, so dass die Sorgfalt für die Entfernung erforderlich beeinträchtigen könnten O ^{6-methylguanine Addukt aus DNA}

Weitere als wir wissen, dass jede Aminosäure ihre eigene Hydrophobizität-Wert hat, den ursprünglichen Rückstand Wildtyp und Mutante neu eingeführten Rest in dieser Eigenschaft unterscheiden. Zur Beurteilung dieser verwendeten wir g_sas Werkzeug, das im Laufe der Zeit hydrophob, hydrophil und insgesamt SASA des Proteins berechnet. Die mutierte Struktur hat eine größere SASA, die in der Mutante Struktur (S4) Bild mit unseren früheren Befund erhöhter Rg korreliert. die Wirkung des Mu auf der MGMT-Struktur mit DNA-PDB ID dockt prüfen: 1T39 [38], haben wir Discovery-Studio zu färben und die Hydrophobizität berechnen nach Kyte-Dolittle Skala (S5) Abb. Die wt Hydrophobizität und fünf Rückstand laufenden Mittelwert Hydrophobizität waren -0,8 und 0,94 jeweils, während die entsprechenden Werte für Mu Rückstand bei 4,5 und 2 erheblich höher waren, was zeigt, dass Mu Rest hydrophober als die wt-Rest ist. Die indizierte Abweichung in den Werten von mutanten Protein Hydrophobizität relativ zu dem wt-Protein könnte die tief stiochiochemistry Wasserstoffbindungsbildung zwischen dem Enzym und DNA beeinflussen, wie aus Fig S5 ersichtlich ist. Anschließend wird die ungünstige Enzym-DNA Andocken an Nichtansprechen des Enzyms in Bezug auf seine kooperative Funktionalität führen kann.

, um das Verständnis der Mutation auf die Proteindynamik zu fördern, teilten wir wichtige Aminosäuren, die in physikalische Wechselwirkung beteiligten Säuren mit DNA und Mg ^{+ -Ionen in Cluster (Bild 4) in Abhängigkeit von ihrer Position und Beiträge in der DNA-Docking, Basen-Flipping und DNA-Reparatur [36]. Cluster1 enthielt fünf Aminosäuren in DNA docking viz beteiligt sind. SER93, PHE94, THR95, ASN123 und LYS125. Cluster 2 enthielt einzelne Aminosäure ARG 135 auch in der DNA-Docking beteiligt. Cluster 3 enthielt drei Aminosäuren TYR114, GLN115 und SER151 wo TYR 114 in Basen-Flipping für die DNA-Reparatur erforderlich beteiligt ist und die anderen beiden haben Rollen in der DNA-Docking. Cluster 4, neben enthält Cluster 3 Aminosäuren, enthalten CYS145, die eine aktive Stelle von MGMT, verantwortlich für die DNA-Reparatur. Cluster 5 bestehen drei Aminosäuren (Cys24, HIS29 und HIS85) alle mit Mg interagieren + Ion. g_rama Werkzeug verwendet wurde, um phi /psi dihedral Kombinationen von ausgewählten Cluster erzeugen und wurde verwendet, um die Winkel als Funktion der Zeit zu berechnen. Ihre Konturdiagramm wurde mit Minima erzeugt ihre jeweiligen Mobilität (S6) Bild zu verstehen. Alle ausgewählten Cluster wurden durch die Mutation von SER151 zu ILE151 betroffen. Um zu verstehen, wurden die Auswirkungen, insbesondere auf Cluster 3 und 4 sind die Psi /phi Verteilungen in Bezug auf die markierte Energieminima aufgetragen (Fig 5). Der Unterschied in der Spitzenregion der Energie Minima in den entsprechenden Gewichts und Mu-Cluster beobachtet werden, unverwechselbaren Eindruck von möglichen Imparitäts- in der DNA-Reparatur zu geben.}

Für ein tieferes Verständnis der strukturellen Veränderung bis jetzt beobachtet, sahen wir uns in intra Wasserstoffbindungsbildung der Werkzeug ausgewählten Cluster g_hband, haben die Ergebnisse, die in Figur 6 die Cluster für diese Analyse zeigen die Abnahme der durchschnittlichen Anzahl von Wasserstoffbrückenbindungen pro Rahmen in mutant Struktur erwarten Cluster 1. die Erhöhung ausgewählt All gezeigt in der Anzahl der durchschnittlichen Wasserstoffbindungen pro Rahmen in Cluster 1 slender im Vergleich zu den Variationen wir beobachten. Die gesamte Rückgang der durchschnittlichen Wasserstoffbrückenbildung pro Rahmen ist in Zusammenarbeit Beziehung mit erhöhter RMSF und Rg in mutierten Struktur. Das Ergebnis dieser Analyse erzeugt wird, um die Anomalie schlüssig sich bringt mit Änderung beobachtet, bis jetzt im inner Wasserstoff-Bindung Muster.

die Wirkung dieser Mutation auf die globale korrelierte Bewegungen in Atom Simulationen, PCA, eine mathematische Technik zu verstehen, dass ist effizient in der allgemeinen Falt- und nicht faltbar Merkmale des Proteins Charakterisierung verwendet wurde. Die Technik identifiziert dominanten Bewegungen in dem Protein durch Extraktion Hauptmoden in der Bewegung im Molekül beteiligt beteiligt. Die Hauptbestandteile von Protein Bewegung wurden als die Eigenvektoren (Ev) der Masse gewichtete Kovarianz-Matrix der Proteinatome berechnet. Die Berechnung dieser Werte wurde nach Standardprotokoll wesentliche Dynamik (ED) Verfahren unter Verwendung von [39] innerhalb der GROMACS Software-Paket. Zwei der ersten acht Evs, die zu mehr als 85% Bewegung des Gesamtsystems Konto für die Analyse ausgewählt wurden, ist der Vorsprung über die Zeit und RMSF Fluktuation von denen in Fig 7. Sowohl die Evs wurden in einer einzigen Bahn kombiniert; die Kombination erzeugt einen gemeinsamen Satz von Principal Component (PC) Eigenvektoren wt und Mu MGMT, direkter Vergleich möglich zwischen verschiedenen Systemen zu machen. Die Trajektorien wurden unter Verwendung von g-Kovar und g-anaeig von gromacs Utilities erhalten. In Fig 8 (A) die Vorsprünge, PC 1 vs. PC 2 der beiden Strukturen projiziert werden (schwarz wt /red Mu), der Cluster aus wt erhaltene Struktur ist stabil, wobei als Projektion ersten beiden PC von mutanten a deckt großes Gebiet. Um die PC Projektionen analysieren, deren freie Energie Oberflächen wurden aufgetragen (Fig 8B), die zeigte, dass die Stabilität von wt über die Lauf uniform über die Zeit im Vergleich zu Mu basierend auf den Energieminima Becken von beiden gebildet. Die Strukturen mit minimalem Energie wurden aus der freien Energie Land-schaft zu verschiedenen Zeitpunkten abgerufen werden. Die Strukturen auf der rechten Seite jedes Vorsprungs in Fig 8 (C) von PC sind vom Beginn der Simulation auf der linken Seite ein vom nahen Ende der Simulation. Diese Analyse war entscheidend in das kompromittierte freie Energielandschaft von Mu Struktur Aufklären, eine Beobachtung, die mit unseren früheren Ergebnissen neben bestätigenden, hat eine drastische Konformationsänderung in Mu Struktur schlüssig impliziert.

Fazit

Ungereimtheiten der DNA-Reparatur und Krebs Ätiologie sind Synonyme in einer Weise, dass es das Auftreten der Mutation ist, die als Basis von Krebs weithin angenommen wurde. Eine Mutation in einer DNA-Reparaturprotein, das seine Funktion (S7) Abb beeinträchtigen könnten kann pretumorigenic Umgebung zu schaffen und in der Krebsprogression in jeder Phase unterstützen kann. MGMT eine der wichtigen DNA-Reparaturprotein ist eine wesentliche Rolle genomische Stabilität bei der Aufrechterhaltung der durch Entfernen von O ^{6Methyleguanine-Addukte. Somit wird eine signifikante genetische Polymorphismus in diesem Protein eine Wirkung auf die Entwicklung von Krebs und ihr Fortschreiten. Da keiner der Studien bis heute Mutationsanalyse von MGMT mit MDS berichtet hat, hat sie aufgefordert, in erster Linie uns in die Möglichkeit zu prüfen, MGMT in einer klassifizierten Bevölkerung mutiert, wo Verzehr von Lebensmitteln, höhere N-Nitrosoverbindungen enthalten, ist üblich und Magen Krebs ist weit verbreitet.}

die Verwendung von Molekulardynamik auf die Wirkung von neuen Mutation zu untersuchen Codon ^{151 hat uns sowohl einen Einblick in die Architektur der Strukturen auf atomarer Ebene über einem Lauf von 30 ns Zeit gegeben . Die Auswirkung der Mutation wurde nicht nur auf die Umgebung beschränkt, sondern auch an verschiedenen Stellen des Proteins auf die Gesamtstruktur einschließlich der Sekundärelemente beaufschlagt. Die strukturellen Übergänge in Sekundärelemente beobachtet, fördert den Zusammenbruch der strukturellen Architektur von Mu MGMT-Protein. Der FEL durch quasiharmonische Analyse erhalten (PCA) auch zu dem Schluss, dass die Mutation deutlich die Stabilität des MGMT im Laufe der Zeit beeinflusst, ein Faktor, der die normale stöchiometrisch der DNA-Reparatur durch MGMT behindern.}

Die erforschten Mutation in Exon 5 erscheint mit Fahrer Mutation assoziiert zu sein, die DNA /Protein-Wechselwirkung, ein wichtiger Faktor zu beeinflussen scheint, die DNA-Docking, Basen-Flipping und letztlich Reparaturmechanismus beeinflussen könnten, die, wenn beeinträchtigt, auch in genomweiten Anstieg der O führen könnte ^{6 Methyl-Guanin-Addukte zu erhöhter genomischer Instabilität führt.}

Materialien und Methoden

Ethical Aussage

die Protokolle /Experimente, die die Verwendung von menschlichen Proben beteiligt sind, wurden ordnungsgemäß geprüft und genehmigt von der Universität Komitee für menschliche Ethik (UHEC), VIT University, Vellore (UHEC-VIT /2011).

Patienten und Gewebesammlung

insgesamt 30 Patienten mit Magenkarzinom diagnostiziert zugelassen Sheri-Kaschmir-Institut der Medizinischen Wissenschaften (abschöpft) wurden Srinagar für die Studie berücksichtigt. Patienten Operation als primäre Behandlung in verschiedenen Stadien der Erkrankung unterzogen, wurden für die Studie rekrutiert mit deren Zustimmung. Die Eigenschaften der untersuchten Patienten sind in S2 Tabelle aufgeführt.

Tumorproben 5mm ^{3 von chirurgisch reseziert Proben innerhalb der Tumormasse ausgeschnitten wurden, mit Ausnahme der Marge. Angrenzend nichtneoplastische Proben von ähnlicher Dimension wurden aus dem Resektionsrand genommen, etwa 10 mm von der makroskopischen Tumorrand und anschließend als gutartig durch Routine Histopathologie bei abschöpft bestätigt. Insgesamt 30 Tumors und 30 normalen Gewebeproben wurden gesammelt und bei -80 ° C bis zur Analyse gelagert.}

DNA Extraktion und Polymerase Chain Reaction

DNA wurde aus 2 mm extrahiert ^{3 Gewebeproben DNA-Extraktion Kit (Hallo Pura Mammalian Genomic DNA Isolation Kit-HiMedia). Konzentration und Qualität der DNA wurde durch Routine spectrophotometeric Analyse gemessen. Amplifikation der Exon 5 Regionen des MGMT Exon wurde in gradient minicycler (Eppendorf) in einem 25 ul-Reaktionsmischung, enthaltend 1 &mgr; l (400 ng /ul), genomische DNA, DNA-Polymerase {1X ​​PCR-Puffer (200 mM Tris HCl, 200 mM KCl durchgeführt wird, 50 mM (NH 4) 2 SO 4), die mit 25 mM MgCl2, Fermentas}, Nuclease freies Wasser und 1 ul vorne (5 'GCCCGTGCAGGTACGGTCTT-3') und umgekehrt (5 'AGCTCCCGCTCCCTTGAGCC-3'), die jeweils als Primer. Die Glühtemperatur wurde bei 65,5 ° C optimiert. Um Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Produktanalyse für die Mutation, PCR-Produkt-Sequenzierung wurde durchgeführt.}

SNP Schadensvorhersage.

Der Schaden Vorhersage des polymorphisim wurde unter Verwendung von SIFT [40] erleichtern , PolyPhen-2 [41], PhD-SNP [42], MutPred [43], SNAP [44], SNPs & Go [45] und Pop-Musik [46].

Molekulardynamik-Simulation

MDS Studien wurden von Gromacs 4.5.3 Paket durchgeführt [47]. Für wt MGMT, die PDB Struktur 1QNT [48] wurde als Ausgangsstruktur für MDS eingesetzt. Accelrys Discovery-Studio [49] wurde verwendet, um die einzelne Punktmutation auf dem Wildtyp-Struktur zu machen. Sowohl wt und Mu MGMT wurden mit GROMOS96 43a1 Kraftfeld aufgebracht und dann platziert in einem Modell eines voräquilibriert Wasserbad und Gegenionen wurden hinzugefügt, um eine neutrale Box mit dem "Genion" Werkzeug zu erreichen, die zusammen mit gromacs Paket kommt. Lösungsmittel-Moleküle wurden in die Ausgangsposition mit einer Kraft von 5000 constrain Schritte 100 kcal /mol zurückgehalten, bevor sie für 5000 Iteration Energieminimierung unterzogen wird. Für die Temperatur im Inneren der Box Regulierung Berendsen Temperatur Kopplungsverfahren [50] verwendet wurde. Die elektrostatische Wechselwirkungen wurden mit dem Particle Mesh-Ewald-Methode berechnet [51]. Ionisierende Zustand der Rückstände, Druck und andere Parameter wurden im Standardbereich festgelegt. Nicht gebundene Paarliste aktualisiert wurde, nachdem alle 10 Schritte und Konformationen alle 2 Picosekunden (ps) gespeichert wurden. Position Stütze Simulation für 500 ps wurde implementiert, um Lösungsmittelmolekülen erlauben, um den Hohlraumbereich der Struktur ein. Schließlich System wurde für 30 Nanosekunden (ns) auf MDS unterzogen. Mittlere quadratische Abweichung (RMSD), Root Mean Square Fluktuations (RMSF), Lösungsmittel zugängliche Oberfläche (SASA), Trägheitsradius (Rg) und PCA wurden mit eingebauten gromacs Werkzeugen. g_hbond wurde verwendet, um die Anzahl der unterschiedlichen Wasserstoffbindungen durch spezifische Reste zu anderen Aminosäuren in dem Protein während Simulationen (NH-Bindung) gebildet zu berechnen. g_sham wurde ausgiebig zu erhalten freie Energielandschaft verwendet. Diagramme wurden Gnade GUI-Toolkit 5.1.22 Version aufgetragen Verwendung während als freie Energielandschaften wurden unter Verwendung von gnuplot 4.6.0 Version aufgetragen. Alle Visualisierungen wurden mit Pymol, Ligplus, VMD durchgeführt [52] und Diagramme wurden aufgetragen mit Anmut Program [53] und GNUPlot. Trajektorien wurden mit dem eingebauten Werkzeug in der Verteilung GROMACS analysiert.

Grundinformationen
S1 Abb. a) Ein repräsentatives Chromatogramm von MGMT Exon 5 des einzigen Basenpaar G >zeigt;. T an Position 151, wie durch einen Pfeil in der neoplastischen Chromatogramm angegeben
b) Ausrichtung von Exon 5-Sequenz, die von neoplastischen und nicht-neoplastischen amplifiziert Gewebe (angrenzend normal) mit der von Wildtyp (Referenz-Sequenz von NCBI erworben) wurde übersetzt und die SNP abgebildet wurde von Serine in Isoleucin gezeigt zu ändern
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S2 Abb. (A) Durchschnittliche Tertiärstrukturen farbig nach Bfactor Werte (b) Durchschnittliche Sekundärstrukturdarstellung beider Strukturen
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S3 Abb. (A) Trägheitsradien von wt und Mu MGMT separat dargestellt.

(b) Rg aller Atome des wt und Mu MGMT gegen die Zeit bei 300K.
Wt von Black und Mu von Green represted wird.
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S4 Abb. Lösungsmittel zugängliche Oberfläche von wt (schwarz) und Mu (grün) MGMT im Laufe der Zeit bei 300 K
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S5 Abb. Farbvariation (Oberfläche von Protein nach Kyte-Doolittle-Skala) bei mutierte Region und die grafische Darstellung der Veränderung in Kyte-Doolittle-Skala in einzelnen Aminosäure und fünf mittlere Lauf Hydrophobizität sowohl wt und Mu MGMT
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S6 Abb. Zeitabhängige Ramachandran Konturplot aller ausgewählten Cluster über die Zeit, wobei jede Linie zeigt den Übergang von 1.
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S7 Abb. Bildliche Darstellung von GC: AT Übergang durch eine Störung der MGMT
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S1 Tabelle. Polymorphismus Prediction mit verschiedenen Servern
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S2 Tabelle. Merkmale der Studienteilnehmer
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Acknowledgments

Die Autoren danken Dr. Daniele Granata für seine anerkennen Art Eingänge auf freie Energie Landschaften.

• PLoS ONE: Risiko von Magenkrebs durch Wasserquelle: Der Nachweis der Golestan Fall-Kontroll-Study
• PLoS ONE: Reverse Korrelation zwischen MicroRNA-145 und FSCN1 Affecting Magenkrebs Migration und Invasion