PLoS ONE: Rabex-5 ist nach oben reguliert und spielt eine onkogene Rolle in Magenkrebs Entwicklung durch die Aktivierung des VEGF-Signal Pathway

Abstrakt

Rabex-5, ein Guanin-Nukleotid-Austauschfaktor (GEF) für RAB-5 wird in Tumorigenese und in der Entwicklung bestimmter Krebserkrankungen des Menschen beteiligt ist. Hier berichten wir, dass Rabex-5 Tumorwachstum und die Metastasierungsfähigkeit von Magenkrebszellen sowohl In-vitro-
und in vivo
fördert. Die Expression von Rabex-5 ist signifikant höher als bei Magenkrebsgewebe und ist mit der Größe des Tumors und Lymphknotenmetastasen assoziiert. Zusätzlich gezielte Silencing Rabex-5 reduziert Magenkrebszellproliferation und Koloniebildung in vitro
über die Induktion einer G0 /G1-Phase Stillstand, und Magenkrebszelle Apoptose stimuliert. Preissturz von Rabex-5 hemmte auch die Wundheilung, die Migration und die invasive Fähigkeiten von Magenkrebszellen. Die Ergebnisse von in vivo
Tierversuche waren auch im Einklang mit diesen In-vitro-
Befunde. Silencing von Rabex-5 führte zu einer verminderten Expression von VEGF. Diese Ergebnisse zeigen, dass Rabex-5 ist upregulated und spielt eine onkogene Rolle bei Magenkrebs Entwicklung durch den VEGF-Signalweg die Aktivierung

Citation:. Wang S, Lu A, Chen X, Wei L, Ding J (2014) Rabex-5 ist nach oben reguliert und spielt eine onkogene Rolle in Magenkrebs Entwicklung durch den VEGF Signalweg aktivieren. PLoS ONE 9 (11): e113891. doi: 10.1371 /journal.pone.0113891

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Empfangen: 3. September 2014; Akzeptiert: 31. Oktober 2014; Veröffentlicht: 26. November 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Datenverfügbarkeit. Die Autoren bestätigen, dass alle Daten, die Ergebnisse sind in vollem Umfang zur Verfügung, ohne Einschränkung zu Grunde liegen. Alle relevanten Daten sind in der Papier und seine Hintergrundinformationen Dateien

Finanzierung:. Diese Autoren haben keine Unterstützung oder Finanzierung zu berichten

Konkurrierende Interessen:. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen.

Einführung

Trotz eines Rückgangs in der globalen Vorkommen in bestimmten Regionen der Welt, bleibt Magenkrebs die vierthöchste Inzidenz und die zweite in der Sterblichkeit unter allen Krebserkrankungen weltweit [1]. Studien zeigen, dass Umweltfaktoren, wie zum Beispiel Helicobacter pylori
Infektion, Rauchen und Ernährung, kann eine wichtige Rolle bei Magenkrebs Entwicklung spielen [2]. Magenkrebs im Frühstadium ist üblicherweise asymptomatisch oder assoziiert mit unspezifischen Symptomen wie Verdauungsstörungen, und durch die Zeit, die Symptome auftreten, ist es oft ein fortgeschrittenes Stadium erreicht hat. Trotz der gemeinsamen Nutzung von multimodalen Therapie (Chemotherapie, Bestrahlung und Operation), die 5-Jahres-Überleben von Patienten nach wie vor niedrig, bei 20-40% [3]. Obwohl die Forschung in Magenkrebs hat große Fortschritte gemacht, so bleiben die molekularen Mechanismen, die die Entwicklung von Magenkrebs zugrunde liegenden unvollständig verstanden.

Exocytosis und Endozytose sind Schlüsselprozesse von Zellen verwendet, die normale physiologische Funktion zu halten und Vesikeltransport ein Kern Teil dieses Prozesses. Kleine GTPasen spielen eine Schaltfunktion in intrazellulären Molekülen und eine sehr wichtige Rolle bei der Endozytose und Vesikeltransport, einschließlich der Regulation des Zellwachstums, Signaltransduktion, Differenzierung und Aktin-Zytoskelett Gebäude und viele Aspekte der anderen zellulären Prozessen [4]. In der Ras-Superfamilie, gibt es mehr als 50 Typen von GTPasen, einschließlich Rab, die dem größten Unterfamilie gehört [5]. Studien haben gezeigt, dass die Mehrheit der Proteine ​​Rab Transport regulate Targeting, Phagozytose und Vesikel Andocken an spezifischen Membranen, während eine kleine Anzahl von Rab-Proteine ​​regulieren Vesikel Knospung [6], [7]. Die kleine GTPase RAB-5, die in der Plasmamembran und frühen Endosomen verteilt ist, ist ein Hauptregulator der frühen endocytic Handels [8]. Wie andere kleine GTPasen, RAB-5 wird durch einen Austausch des gebundenen GDP mit GTP aktiviert, katalysiert durch eine Familie von Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren [9]. Rabex-5 wurde als ein Inter von Rabaptin-5 identifiziert und besitzt GEF Aktivität gegenüber RAB-5 und den zugehörigen GTPasen. Ebenso sowohl Rabex-5 und Rabaptin-5 sind notwendig für die RAB-5-driven endosome Fusion In-vitro-
[10].

Jüngste Studien haben gezeigt, dass Rabex-5-Expression signifikant höher in verschiedenen Krebsarten, einschließlich Brustkrebs [11], Prostatakrebs [12] und Darmkrebs [13]. Abnormal Rabex-5 Expression in Tumoren legt nahe, dass Rabex-5 in der Krebs Pathogenese und Progression signifikant ist, und kann Tumor biologische Verhalten beeinflussen. Allerdings haben die Rolle und Wirkungsmechanismus von Rabex-5 bei Magenkrebs Karzinogenese und Progression noch nicht bestimmt worden. In dieser Studie untersuchten wir die Expression von ersten Rabex-5 in Magenkrebsgewebe quantitative reverse Transkription-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) und Immunhistochemie verwendet. Anschließend untersuchten wir die Auswirkungen von Rabex-5 auf Tumor biologische Funktion In-vitro-
und in vivo
. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Rabex-5 überexprimiert und spielt eine onkogene Rolle bei Magenkrebs.

Materialien und Methoden

Ethik Statement

Alle Tierversuche in dieser Studie beschrieben wurden genehmigt von der Institutional Animal Care und Use Committee (IACUC) bei Taishan Medizinischen Universität und alle Tiere wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien IACUC gehalten. Die Erhebung und Verwendung von menschlichen Proben durch das Institutional Review Board von Taishan Medizinischen Universität und der angeschlossenen Taian Central Hospital Medical Center genehmigt wurden, folgendes mitgeteilt schriftliche Zustimmung von allen Patienten.

Patienten und Gewebeproben

insgesamt 110 Arten von Tumoren des Magens und der angrenzenden, nicht-Tumorgewebe (mindestens 5 cm vom Tumorrand) wurden von Patienten erhalten, die diese enthalten 2013 unterzog sich 27 Frauen kurativen Chirurgie bei Taian Central Hospital zwischen Januar 2010 und Dezember und 83 Männer, mit einem mittleren Alter von 59,3 Jahren (Bereich: 32-80 Jahre). Keiner der Patienten hatte eine Strahlentherapie oder eine Chemotherapie vor der Operation erhalten. Clinicopathological Daten wurden gesammelt und pathologischen Tumorstaging wurde nach dem American Joint Committee on Cancer (AJCC) Magenkrebs TNM bestimmt. Histologische Typisierung wurde von mindestens zwei Sachverständigen Pathologen durchgeführt, unabhängig arbeiten in einer doppelblinden Mode. Die Studie wurde von der Institutional Review Boards von Taishan Medizinischen Universität und der angeschlossenen Taian Central Hospital Medical Center genehmigt. Eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von jedem Patienten vor der Aufnahme in die Studie erhalten.

Die Zelllinien und Kulturbedingungen

Menschliche Zelle Magenkrebs Linien und die verewigte Magen, Schleimhaut epithelialen Zelllinie GES-1 wurden von den Shanghai Institutes for Biological Sciences, chinesische Akademie der Wissenschaften erworben. Zelllinien wurden in RPMI-1640-Medium mit 10% Kälberserum, Penicillin (100 IU /ml) und Streptomycin (100 IU /ml) in einer 5% CO _{2 -Atmosphäre bei 37 ° C routinemßig gehalten.}

Total RNA Isolation und qRT-PCR

Gesamt-RNA wurde aus Gewebeproben oder Zelllinien unter Verwendung von Trizol-Reagenz (Invitrogen, USA) extrahiert, nach den Anweisungen des Herstellers. Reverse Transkription wurde unter Verwendung von 1 ug Gesamt-RNA in Übereinstimmung mit den Anweisungen des Herstellers durchgeführt (Promega, Madison, WI, USA). PCR wurde unter Verwendung von SYBR Green Reagenz (Applied Biosystems, CA, USA) und die folgenden PCR-Primer durchgeführt; Rabex-5
(vorwärts) 5'-TTGGACAGATGGAATTGCAA-3 'und (rückwärts) 5'-GTTGCAGTGGTGGAGGAAGT-3'; VEGF
(vorwärts) 5'-CTGTACCTCCACCATGCCAAGT-3 'und (rückwärts) 5'-CTTCGCTGGTAGACATCCATGA-3' und GAPDH
(vorwärts) 5'-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3 'und (rückwärts) 5'-GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3 '. PCR-Reaktionen wurden für 2 min mit einer anfänglichen Denaturierung bei 95 ° C durchgeführt, gefolgt von 30 Zyklen von 94 ° C für 30 s, 55 ° C für 30 s und 72 ° C für 30 s, mit einer abschließenden Extension bei 72 ° C für 10 min. GAPDH
wurde als interne Kontrolle verwendet, und alle Reaktionen wurden dreifach durchgeführt. Die relativen Expressionsverhältnisse von Rabex-5
in jedes gekoppelte Tumor zu Nicht-Tumorgewebeprobe wurden die 2 berechnet ^{-ΔΔCt Methode.}

Immunhistochemie

Paraffin -embedded Gewebeschnitten von Patienten oder Nacktmäuse wurden für 1 h bei 60 ° C wärmebehandelt, in Xylol entparaffiniert, rehydriert in einer Ethanol-Reihe (100-50%) und in 0,01 mol /l Citratpuffer (pH 6,0 behandelt, ) für Antigen-Retrieval. Endogene Peroxidase-Aktivität wurde nach der Inkubation gehemmt mit Methanol 0,3% H _{2 O 2 für 30 min enthält. über Nacht bei 4 ° C; (Ab46154, Abcam, USA 1:150) Schnitte wurden dann mit Antikörpern Erfassungs Rabex-5 (01.50, Santa Cruz Biotechnology, USA) oder VEGF inkubiert. Das folgende experimentelle Verfahren wurde mit dem sekundären Antikörper inkubiert. Gewebeschnitte wurden mit Mayers Hämatoxylin gegengefärbt. Die Objektträger wurden unabhängig voneinander von zwei Pathologen ausgewertet, geblendet zu allen Patientendaten. Die Färbungsintensität für Rabex-5 wurde als 0 (keine Färbung) erzielt, 1 (mild-Färbung), 2 (mäßige Färbung) oder 3 (intensive Färbung). Färbungsbereich wurde als 0 (0%) erzielt, 1 (1-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) oder 4 (76-100%), auf der Basis des Prozentsatzes von positiv gefärbten Zellen. Die endgültige Färbung Score, berechnet als die Summe der Intensität und Ausdehnung Partituren, wurde in drei Gruppen wie folgt aufgeteilt: 0-2, negativer Ausdruck; 3-4, schwache Expression; und 5-6, starken Ausdruck.}

Gezielte Silencing Rabex-5

Die Rabex-5 lentiviralen Interferenz-Vektor wurde von Shanghai Genepharma Co., Ltd. Die Reihenfolge der Rabex-5 gekauft Interferenz Targeting Oligo war 5'-GGATGCAAACTCGTGGGAA-3 ', während die nicht-homologen 5'-Steuersequenz TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 wurde ". SGC-7901 und NCI-N87-Zellen wurden in 6-well-Platten (5 x 10 ^{4 Zellen /Vertiefung), gezüchtet auf 40% Konfluenz und mit titrierten viralen Überstand bei einer Multiplizität der Infektion (MOI) von 10 überzogen.}

Western-Blot-Analyse

Ganze Zellproteine ​​wurden aus Zellen mit RIPA-Puffer mit Protease Inhibitor Cocktail (Pierce, Rockford, IL, USA) extrahiert. Protein wurde unter Verwendung eines BCA Protein Assay Kit (Pierce) quantifiziert. Zellextrakte (100 &mgr; g) wurden durch 10% Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese aufgetrennt und auf Polyvinylidenfluorid-Membranen übertragen. Membranen wurden über Nacht mit 5% fettfreier Milch in Tris-gepufferter Salzlösung (TBS) gewaschen und mit primären Antikörpern bei 4 ° C blockiert. Die primären Antikörper verwendet wurden, waren Kaninchen-Anti-Rabex-5 (1:200; Santa Cruz Biotechnology), Kaninchen-Anti-GAPDH (1:5000; Ab9485, Abcam) und Maus-anti-VEGF (1:300; Ab46154, Abcam). Membranen wurden dann dreimal in TBS-Tween-Lösung für 15 min und mit sekundären Antikörpern inkubiert. Die Signale wurden unter Verwendung eines verstärkten Chemilumineszenz-Detektionssystem (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, USA) gemäß dem Protokoll des Herstellers nachgewiesen.

Zellproliferationsassays

Die Zellproliferation wurde unter Verwendung eines Zellzählung Kit -8 (CCK-8; Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan). SGC-7901 oder NCI-N87-Zellen wurden in 96-well Platten ausgesät (1,5 × 10 ^{3 Zellen /Vertiefung) und für verschiedene Zeitpunkte inkubiert (24, 48, 72, 96 und 120 h). Wachstumsmedium wurde dann mit 200 ul RPMI-1640-Medium, das 10% FBS und 20 &mgr; l von CCK-8 entfernt und ersetzt und die Platten wurden bei 37 ° C für 3 h inkubiert. Die Extinktion wurde bei 450 nm gemessen, um eine Safire2 Mikrotiterplatten-Lesegerät verwenden. RPMI-1640-Medium, das 10% FBS und CCK-8 wurde als Kontrolle verwendet.}

Koloniebildungstest

Zellen wurden in 6-Well-Platten (1 × 10 ^{3 Zellen /Vertiefung) und Kulturmedium wurde alle 3-4 Tage ersetzt. Nach 14 Tagen Kultur wurden die Zellkolonien für 10 min mit 4% Paraformaldehyd fixiert, mit 0,1% Kristallviolett für 20 min gefärbt und photographiert. Kolonien mit mehr als 50 Zellen wurden in jedem Strich gezählt.}

Analyse des Zellzyklus und Apoptose

SGC-7901 /KD, NCI-N87 /KD-Zellen und Kontrollzellen wurden gesammelt und Zellzyklus und wurde Apoptose durch Durchflusscytometrie untersucht. Für die Zellzyklusanalyse wurden die Zellen mit 75% Ethanol fixiert und bei 4 ° C über Nacht gelagert. Am folgenden Tag wurden die fixierten Zellen mit PBS gewaschen, mit RNase A behandelt (50 ug /ml) und Propidiumiodid (PI) (50 ug /ml) für 30 min im Dunkeln gefärbt. Die gefärbten Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie (FACSCalibur, Becton-Dickinson) analysiert.

Bei Apoptose-Analyse, ein Annexin V-APC Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen, USA) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. PI und Annexin V-APC Doppelfärbung wurde durchgeführt, und die Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie (FACSCalibur, Becton-Dickinson) analysiert, die Cell Quest Software (Becton-Dickinson) verwendet. Annexin V-APC-positive und PI-negativen Zellen wurden als Apoptose definiert. Alle Experimente wurden in dreifacher Ausfertigung und die Mittelwerte dieser Gruppen wurden berechnet durchgeführt.

Transwell Migration und Invasion Assay

Für Migrationsassays, 1 x 10 ^{5 Zellen in serum suspendiert freiem RPMI-1640-Medium resuspendiert und auf Kammern, die nicht mit Matrigel (Corning Costar, NY, USA) beschichtet. Für den Invasionsassay wurde die obere Kammer mit Matrigel (BD Bioscience, CA, USA) gemäß den Herstellerprotokollen vorbeschichtet und 1 × 10 5 Zellen in serumfreiem RPMI-1640-Medium wurden zu der Kammer zugegeben. Für beide Assays Medium, enthaltend 10% FBS in die untere Kammer als chemoattractant zugegeben. Nach 24 h Kultur mit 0,5% Kristallviolett-Lösung Kammern für 10 min für 15 min, und eingetaucht in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) wurden gefärbt. Zellen in der unteren Kammer wurden anschließend unter einem umgekehrten Mikroskop gezählt. Die Werte sind als mittlere Zellzahlen in fünf zufälligen Blickfelder ausgedrückt (200 ×).}

Wundheilungs Assay

Die Zellen wurden ausgesät in 6-Well-Platten und kultiviert, bis sie Konfluenz erreichten. Die Wunden wurden auf der Monoschicht von Zellen zerkratzt unter Verwendung von 20-ul Pipettenspitzen. Die Platten wurden einmal mit frischem Medium gewaschen, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen folgenden Kultur von Zellen für 0 oder 48 h (Medium ohne Kälberserum), und fotografiert.

Xenograftmodell

Vier-Wochen- alte männliche Balb /c-Nacktmäuse wurden vom Institut für Zoologie der chinesischen Akademie der Wissenschaften in Shanghai gekauft. Die Tiere wurden in Käfigen mit Holz Chip Bettungen in einem temperierten Raum (68-72 ° F) mit einem 12-h Hell-Dunkel-Zyklus und 45-55% relativer Luftfeuchtigkeit untergebracht und hatten freien Zugang zu Nahrung und Trinkwasser zugelassen. Kurz gesagt, SGC-7901 /KD oder SGC-7901 /NC-Zellen wurden in PBS (pH 7,4) für die Injektion in eine Maus, in einem Gesamtvolumen von 100 ul mit Trypsin behandelt und erneut suspendiert. Die Zellsuspension (1 × 10 ^{6 Zellen) wurde in die rechte Flanke der Mäuse injiziert. Die Tumorgröße wurde gemessen extern alle 3 Tage mit einer Schieblehre, und das Tumorvolumen wurde unter Verwendung der Gleichung geschätzt: Länge (mm) × Breite 2 (mm) × 0,52. Ein Leiden von Mäusen während dieser experimentellen Untersuchungen wurden Mäuse euthanasiert durch CO _{2 Inhalation am 28. Tag nach intraperitonealer Injektion, und Tumoren wurden gewogen nach der Sektion beobachtet zu verbessern. Die Proben wurden in flüssigem Stickstoff für qRT-PCR oder fixiert in 4% Formalin gelagert in Paraffin eingebetteten Schnitten zu erhalten. Alle Verfahren wurden nach den Animal Care und Verwenden Richtlinien der Taishan Medical University Animal Care Committee genehmigt durchgeführt.}}

Die statistische Analyse

Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) dargestellt. Statistische Unterschiede zwischen den beiden Gruppen wurden durch den Student-geprüft t
-test. Die Korrelationen zwischen Rabex-5-Expression in Magenkrebsgewebe und klinischen Parametern wurden durch Chi-Quadrat oder Fisher-Tests analysiert. P
< 0,05 wurde als signifikant angesehen, und P
< 0,01 war hoch signifikant betrachtet

Ergebnisse |

Rabex-5-Expression hochreguliert in. Magenkrebs Gewebe

der Ausdruck Rabex-5
wurde bei Magenkrebs untersucht und benachbarten nicht-Tumorgewebe durch qRT-PCR. Wir beobachteten signifikant höhere Expression von Rabex-5
mRNA in Magenkrebsgewebe im Vergleich zu entsprechenden nicht-Tumorgewebe ( P
. ≪ 0,01, 1A). Diese Ergebnisse wurden auf Proteinebene durch immunhistochemische Färbung (Fig. 1B, C, D, E) bestätigt. Rabex-5-Expression wurde vorwiegend im Zytoplasma der Krebszellen lokalisiert. Rabex-5 wurde in 61,8% (68/110) der Patienten mit Magenkrebs nach oben reguliert. Wir untersuchten als nächstes die Beziehung zwischen Rabex-5-Expression und klinisch-pathologische Merkmale von Magenkrebs. Hochregulation von Rabex-5 wurde mit der Größe des Tumors assoziiert ( P
= 0,035) und Lymphknotenmetastasen ( P
= 0,006), aber nicht mit anderen klinisch-pathologischen Faktoren wie Geschlecht, Alter oder Tumorlokalisation (Tabelle 1).

das Herunterregulieren von Rabex-5 hemmt Magenkrebs-Zellproliferation und Koloniebildung

Wir neben der Expression von Rabex-5 im Magen-Zelllinien und die nicht-Krebszelllinie untersucht GES-1, durch Western-Blot-Analyse. Rabex-5 wurde in allen getesteten Zelllinien exprimiert und war besonders hoch in SGC-7901 und NCI-N87-Zellen (Abb. 2A). Um die Funktionen von Rabex-5 in Magenkrebszelllinien untersuchen, führten wir gezielt Zuschlag von Rabex-5 in der High-exprimierenden Zelllinien, SGC-7901 und NCI-N87. Rabex-5-Expression wurde signifikant verringert im SGC-7901 /KD und NCI-N87 /KD-Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen (Abb. 2B). Zuerst untersuchten wir die Wirkung des Verlustes von Rabex-5 auf das Wachstum von Magenkrebszellen. Nach 5 Tagen Kultur wurde die Wachstumsrate der SGC-7901 /KD und NCI-N87 /KD-Zellen signifikant langsamer als die Kontrollgruppen (Fig. 2C). Wir bestätigten auch diese Beobachtungen in der Koloniebildung Assays. Colony Zahlen wurden in SGC-7901 /KD-Zellen und NCI-N87 /KD-Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen (Abb. 2D) signifikant reduziert, und wir festgestellt, dass Koloniegröße war auch kleiner in der experimentellen Gruppen verglichen mit den Kontrollen. Diese Daten legen nahe, dass die Herunterregulierung von Rabex-5 Magenkrebszellproliferation unterdrückt.

Das Herunterregulieren von Rabex-5 Apoptose von Magenkrebszellen fördert und induziert G0 /G1 Zellzyklusarrest

Die beobachteten Effekte von Rabex-5 Zuschlag auf das Zellwachstum kann zu Veränderungen in der Zellzyklus-Progression und Apoptose zurückzuführen sein. Wir untersuchten daher die Auswirkungen von Rabex-5-Silencing auf Zellzyklus und Apoptose In-vitro-
, unter Verwendung der Durchflusszytometrie. Durchflusszytometrische Analyse ergab, dass der Anteil an Zellen in der G0 /G1-Phase in SGC-7901 /KD oder NCI-N87 /KD-Zellen war höher als in SGC-7901 /NC oder NCI-N87 /NC Kontrollgruppen, während der Anteil der Zellen in der G2 /M Phase wurde signifikant verringert im Vergleich mit den Kontrollen (Abb. 3A, B). Wir beobachteten auch signifikante Wirkungen auf die Apoptose in den unterschiedlich behandelten Gruppen (Fig. 3C, D), wobei die Herunterregulierung der Expression Rabex-5 zu einer Erhöhung der Magenkrebszellen Apoptose führt.

Herunterregulieren der Rabex-5 inhibiert die Migration , Invasion und wundheilende Fähigkeit von Magenkrebszellen

Um den Einfluss von Rabex-5 auf die Migration und Invasion zu untersuchen, führten wir neben Transwell-Migration und Invasion Assays. Das Herunterregulieren von Rabex-5 unterdrückt die Zellmigration (SGC-7901 /KD-Gruppe, 121,3 ± 6,1 Zellen /Spielfeld; SGC-7901 /NC-Gruppe, 261,0 ± 10,5 Zellen /Spielfeld; NCI-N87 /KD-Gruppe, 108,7 ± 6,1 Zellen /Feld; NCI-N87 /NC-Gruppe, 241,7 ± 10,6 Zellen /Spielfeld; P
. < 0,05) (4A, C). SGC-7901 /NC-Gruppe, 108,7 ± 6,0 Zellen /Spielfeld;; NCI-N87 /KD-Gruppe, 60,7 ± 6,0 Zellen /Feld Ähnliche Ergebnisse wurden in Transwell Invasionsassays (SGC-7901 /KD-Gruppe, 76,3 ± 6,1 Zellen /Feld beobachtet; NCI-N87 /NC-Gruppe, 119,0 ± 8,5 Zellen /Spielfeld; P
< 0,05) (4B, D)

die Wirkung von Rabex-5 auf die Motilität zu untersuchen.. und Wundheilung, wir auch Wundheilungstests durchgeführt. Wir beobachteten, dass der Abstand zwischen den Wundrändern des SGC-7901 /KD und NCI-N87 /KD-Zellen deutlich länger war als die der SGC-7901 /NC oder NCI-N87 /NC-Zellen (Fig. 4E). In Übereinstimmung mit diesen Beobachtungen wurden Ebenen von VEGF bei downregulated sowohl die mRNA und Protein-Ebene in SGC-7901 /KD-Zellen (Abb. 4F, G).

Silencing von Rabex-5 Magenkrebswachstum hemmt in vivo

Basierend auf den in-vitro-
Erkenntnisse oben beschrieben, untersuchten wir als nächstes den Effekt von Rabex-5-Silencing auf das Tumorwachstum in vivo und Videos Injektion subkutan in die rechte Flanke Regionen von Nacktmäusen SGC7901 /KD oder SGC7901 /NC-Zellen. Die Tumorgröße wurde alle 3 Tage mit einer Schieb überwacht. Das Tumorvolumen wurde in Mäusen 2 Wochen nach der Injektion des SGC-7901 /KD-Zellen im Vergleich zu Kontrollzellen (; 0,05; Fig. 5A P
<) deutlich reduziert. Das Tumorvolumen von SGC-7901 /KD Gruppe abgeleitet Xenografts war vergleichbar mit jener des SGC-7901 /NC-Gruppe, eine deutliche Abnahme des Tumorvolumens von 4 Wochen nach der Tumorzellinokulation aufweisen ( P
< 0,05, Fig. 5B, C). Außerdem wurde das Gewicht der Tumoren abgeleitet von SGC-7901 /KD-Zellen signifikant geringer als die der Kontrollgruppe ( P
< 0,05; Fig. 5D). Nächstes untersuchten wir die Expression von VEGF in der Transplantationsmedizin Tumorproben durch qRT-PCR und Immunhistochemie. Wie in gezeigt. 5E und 5F, Ebenen der VEGF-mRNA und Protein wurden in der SGC-7901 /KD-Gruppe verglichen mit SGC-7901 /NC-Steuerung verringert. Diese in vivo
Daten stehen im Einklang mit unseren In-vitro-
Beobachtungen und bestätigen, dass Silencing Rabex-5 hemmt Magenkrebs Wachstum und die Progression von VEGF Transkriptionsaktivität zu modulieren. Zusammenfassend spielt Rabex-5 eine onkogene Rolle bei Magenkrebs

Diskussion

Obwohl frühere Studien haben gezeigt, dass Rabex-5 spielt eine Rolle bei der Tumorentstehung in verschiedenen Arten von Krebs. [11] - [14], hatte seine Rolle bei der Magenkrebs nicht untersucht. In der vorliegenden Studie haben wir festgestellt, dass Rabex-5 Expression signifikant im Magenkrebsgewebe im Vergleich mit benachbarten normalen Gewebe hochreguliert wird, was anzeigt, dass Rabex-5 zu Magenkrebs tumorigenesis beitragen können. Darüber hinaus wurde die Expression von Rabex-5 signifikant mit der Tumorgröße und Lymphknotenmetastasen assoziiert. Im Gegensatz dazu gab es keine signifikanten Korrelationen zwischen abnormal Rabex-5-Expression und Geschlecht, Alter oder Tumorlokalisation. Dies ist die erste Studie, die die klinisch-pathologischen Bedeutung von Rabex-5-Expression bei Patienten mit Magenkrebs aufzuklären.

Um die Rolle der Rabex-5 in der Tumorförderung untersuchen wir neben umfangreichen Verlust der Funktionsanalyse in RABEX- ausgeführt 5 High-exprimierenden Zelllinien, SGC-7901 und NCI-N87. Erfolgreiche Hemmung der Rabex-5-Expression wurde durch RNAi-Technologie erreicht, und Zuschlags wurde durch Western-Blot bestätigt. Unsere Analysen zeigten, dass die Zellproliferation deutlich wurde in SGC-7901 /KD und NCI-N87 /KD-Zellen und ähnliche Ergebnisse vermindert wurden in Koloniebildungstests erhalten. Wichtig unterstützt, in vivo
Xenotransplantatmodellen diese In-vitro-
Beobachtungen. Dieser Phänotyp kann durch Rabex-5 Regulieren spezifische Gene und Signalwege, um dadurch zu beeinflussen Zellzyklus und Apoptose verursacht werden. In Transwell-Assays, in die untere Kammer weniger SGC-7901 /KD und NCI-N87 /KD-Zellen als Kontrollzellen gewandert, was darauf hindeutet, dass Rabex-5 Migration und Invasion in Magenkrebszellen verbessert. Die Wundheilung wurde ebenfalls signifikant verringert folgende Silencing Rabex-5. Diese Ergebnisse bestätigen die wichtige Rolle der Rabex-5 bei Magenkrebs Zellwachstum und metastatischen Verhalten. Allerdings ist die genaue molekulare Mechanismus, mit dem Rabex-5 diese Effekte ausübt, bleibt unbekannt, da Studien mit Rabex-5 begrenzt sind.

Frühere Studien haben gezeigt, dass Rabex-5 speziell auf die aktive Form von RAB- binden können 5, wodurch die Regulierung der Docking-und Fusion von Endosomen Membranen, die Beweglichkeit von Endosomen und intrazelluläre Signaltransduktion [15]. Die Expression von RAB-5-Proteine ​​wurde mit der Entwicklung von verschiedenen bösartigen Tumoren in Verbindung gebracht worden [16] - [18] und in der Lage ist die Migration von Tumorzellen zu fördern [19], [20]. Angiogenese spielt eine wichtige Rolle in der Tumorgenese [21], und wird von mehreren Faktoren wie der platelet-derived growth factor (PDGF) und den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) [22] geregelt. Der PI3K /Akt-Signalweg kann sowohl von VEGF und PDGF geregelt werden. Beispielsweise VEGF neuroblastoma Proliferation PI3K verbessert durch Aktivierung /Signalisierungs Akt [23]. Ebenso haben Studien gezeigt, daß PDGF die Migrationsfähigkeit von Zellen über den PI3K /AKT Pathway beeinflussen [24]. Die Aktivierung des PI3K /Akt-Signalisierung kann Zell-Apoptose hemmen durch verschiedene Stimuli induziert [25] - [29], und der Zellzyklusprogression zu fördern [30], [31] und damit das Überleben der Zellen und die Proliferation zu fördern. Dieser Stoffwechselweg beteiligt sich auch an der Angiogenese [32], [33], und spielt eine wichtige Rolle bei der Tumorbildung, Invasion und Metastasierung [34], [35]. Unsere Studie zeigt, dass Rabex-5-Silencing eine Abnahme der VEGF-Expression auslöst. Daher hypothesize wir, dass Rabex-5, das Wachstum und metastatischen Fähigkeit von Magenkrebszellen durch Aktivierung von VEGF und seiner stromabwärtigen Signalwegen fördert.

Abschließend zeigen wir, dass Rabex-5 fördert die Proliferation, die Koloniebildung, Migration und Invasion, was darauf hindeutet, dass Rabex-5 kann ein Onkogen in Magenkrebs sein, und ihre Wirkungen können teilweise durch Modulation der VEGF-Aktivierung vermittelt werden. Rabex-5 kann daher eine neue diagnostische und prognostische Marker darstellen und ein neues therapeutisches Ziel bei Magenkrebs. Weitere Anstrengungen sollten die Signalwege zugrunde, diese biologische Phänomene zu klären gemacht werden.

• PLoS ONE: Serum OPN Expression für die Identifizierung von Magenkrebs und atrophische Gastritis und seine Einflussfaktoren
• PLoS ONE: CEACAM6 fördert Magenkrebs Invasion und Metastasierung von über PI3K /AKT Signalweg Epithelial-mesenchymale Transition Induzierende