PLOS ONE: RABEX-5 é regulada e desempenha um papel oncogênico no desenvolvimento do câncer gástrico, ativando o VEGF via de sinalização

Sumário

RABEX-5, um factor de troca do nucleótido guanina-(GEF) para RAB-5, está implicada na tumorigénese e no desenvolvimento de certos cancros humanos. Aqui, nós relatamos que RABEX-5 promove o crescimento do tumor ea capacidade metastático das células cancerosas gástricas tanto in vitro
e in vivo
. Expressão de RABEX-5 é significativamente mais elevada em tecidos de cancro gástrico e está associada com o tamanho do tumor e metástases linfáticas. Além disso, o alvo de silenciamento RABEX 5-proliferação de células de cancro gástrico reduzida e a formação de colónias In vitro
através da indução de uma fase de detenção G0 /G1 e apoptose estimulada de células de cancro gástrico. Knockdown de RABEX-5 também inibiu a cicatrização de feridas, as migrações e as habilidades invasivos de células cancerosas gástricas. Os resultados do in vivo
animais experimentos também foram consistentes com estes in vitro
descobertas. O silenciamento de RABEX-5 levou a uma diminuição da expressão do VEGF. Estes resultados indicam que RABEX-5 é regulada positivamente e desempenha um papel no desenvolvimento do cancro oncogénica gástrica através da activação da via de sinalização de VEGF

citação:. Wang S, Lu A, Chen X, Wei G, Ding J (2014) RABEX-5 é regulada e desempenha um papel oncogênico no desenvolvimento do câncer gástrico, ativando o VEGF via de sinalização. PLoS ONE 9 (11): e113891. doi: 10.1371 /journal.pone.0113891

editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, China

Recebido: 03 de setembro de 2014; Aceito: 31 de outubro de 2014; Publicação: 26 de novembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Esses autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Introdução

Apesar de um declínio na incidência global em certas regiões do mundo, o câncer gástrico continua a ser a quarta maior em incidência e em segundo lugar na mortalidade entre todos os cânceres em todo o mundo [1]. Estudos indicam que os fatores ambientais, tais como Helicobacter pylori
infecção, tabagismo e dieta, podem desempenhar um papel importante no desenvolvimento do câncer gástrico [2]. câncer gástrico em estágio inicial é geralmente assintomática ou associada a sintomas inespecíficos, tais como dispepsia, e pelo tempo que os sintomas ocorrem, muitas vezes ela tem alcançado um estágio avançado. Apesar do uso comum da terapia multimodal (quimioterapia, radioterapia e cirurgia), a sobrevida dos pacientes em 5 anos permanece baixa, em 20-40% [3]. Embora a pesquisa em câncer gástrico tem feito grandes progressos, os mecanismos moleculares subjacentes ao desenvolvimento de câncer gástrico ainda permanece incompreendida.

Exocytosis e endocitose são os principais processos usados ​​pelas células para manter a função fisiológica normal, e transporte vesicular é um núcleo parte deste processo. GTPases pequenas desempenham uma função chave no moléculas intracelulares e um papel muito importante na endocitose e transporte vesicular, incluindo a regulação do crescimento celular, a transdução de sinal, a diferenciação e citoesqueleto de actina edifício e muitos aspectos de outros processos celulares [4]. No superfamília Ras, existem mais de 50 tipos de GTPases, incluindo Rab, que pertence à subfamília maior [5]. Estudos têm mostrado que a maioria das proteínas Rab regulam o transporte de segmentação, fagocitose, e de ancoragem a membranas de vesículas específicas, ao passo que um pequeno número de proteínas Rab regular vesícula brotamento [6], [7]. A pequena GTPase RAB-5, que é distribuído na membrana plasmática e início endossomas, é um regulador mestre do tráfico endocítica início [8]. Como outras pequenas GTPases, RAB-5 é ativado por uma troca de GDP ligado com GTP, catalisada por uma família de fatores de troca do nucle�ido guanina [9]. RABEX-5 foi identificado como um interactor de Rabaptin-5 e possui actividade de GEF para RAB-5 e GTPases relacionadas. Da mesma forma, tanto RABEX-5 e Rabaptin-5 são necessários para a fusão endosome impulsionado RAB-5- in vitro
[10].

Estudos recentes têm indicado que RABEX-5 expressão é significativamente maior em vários tipos de cancro, incluindo o cancro da mama [11], o câncer de próstata [12] e cancro colorectal [13]. Anormal expressão RABEX-5 em tumores sugere que RABEX-5 é significativo na patogênese e progressão do câncer, e podem influenciar o comportamento biológico do tumor. No entanto, ainda não foram determinados o papel e mecanismo de acção de RABEX-5 na carcinogénese do cancro gástrico e progressão. Neste estudo, foram analisados ​​primeira expressão da RABEX-5 em tecidos com câncer gástrico utilizando a reação quantitativa reversa da cadeia de polimerase (qRT-PCR) e imuno-histoquímica. Posteriormente, examinaram os efeitos de RABEX-5 sobre a função biológica do tumor in vitro
e in vivo
. Nossos resultados demonstram que RABEX-5 é abundante e desempenha um papel oncogênico no câncer gástrico.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

foram aprovados Todos os experimentos com animais descritos neste estudo pelo Comitê Institucional de animal Care and Use (IACUC) da Universidade Medical Taishan e todos os animais foram mantidos de acordo com as diretrizes IACUC. A coleta e uso de amostras humanas foram aprovadas pelo Conselho de Revisão Institucional da Universidade de Medicina de Taishan ea afiliada Hospital Central Taian Medical Center, após consentimento informado por escrito de todos os pacientes.

Pacientes e tecido espécimes

Um total de 110 conjuntos de tumores gástricos e tecidos adjacentes, não-tumorais (pelo menos 5 cm da margem do tumor) foram obtidos de pacientes submetidos à cirurgia curativa no Hospital Central Taian entre janeiro de 2010 e dezembro de 2013. Estas incluíam 27 mulheres e 83 homens, com idade média de 59,3 anos (intervalo: 32-80 anos). Nenhum dos pacientes tinha recebido radioterapia ou quimioterapia antes da cirurgia. dados clínico-patológicos foram coletadas e estadiamento do tumor patológico foi determinada de acordo com a Comissão Americana conjunta sobre Câncer (AJCC) sistema de estadiamento TNM câncer gástrico. tipagem histológica foi realizada por, pelo menos, dois patologistas peritos, trabalhando de forma independente de um modo duplamente cego. O estudo foi aprovado pelo Institutional Review Boards de University Medical Taishan ea Taian Central Hospital Medical Center filiados. consentimento informado por escrito foi obtido de cada paciente antes da inclusão no estudo.

linhas de células e condições de cultura

linhas Humanos gástricas célula cancerosa e gástrica imortalizado, linha de células epiteliais da mucosa, GES-1 , foram adquiridas dos institutos de Xangai para Ciências Biológicas, Academia chinesa de Ciências. As linhas celulares foram rotineiramente mantidas em meio RPMI-1640 contendo 10% de soro de vitelo, penicilina (100 UI /ml) e estreptomicina (100 IU /ml) em um 5% de CO _{2 atmosfera a 37 ° C.}

isolamento de ARN total e qRT-PCR

o ARN total foi extraído de amostras de tecido ou de linhas de células utilizando o reagente Trizol (Invitrogen, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. A transcrição reversa foi realizada utilizando 1 ug de ARN total de acordo com as instruções do fabricante (Promega, Madison, WI, EUA). A PCR foi realizada utilizando o reagente de SYBR Green (Applied Biosystems, CA, EUA) e os seguintes iniciadores de PCR; RABEX-5
(para a frente) 5'-TTGGACAGATGGAATTGCAA-3 'e (reverso) 5'-GTTGCAGTGGTGGAGGAAGT-3'; VEGF
(para a frente) 5'-CTGTACCTCCACCATGCCAAGT-3 'e (reverso) 5'-CTTCGCTGGTAGACATCCATGA-3' e GAPDH
(para a frente) 5'-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3 'e (reverso) 5'-GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3 '. As reacções de PCR foram realizadas com uma desnaturação inicial a 95 ° C durante 2 min, seguido de 30 ciclos de 94 ° C durante 30 s, 55 ° C durante 30 s e 72 ° C durante 30 s, com uma extensão final a 72 ° C durante 10 min.
GAPDH foi usada como um controlo interno e todas as reacções foram realizadas em triplicado. Os rácios de RABEX-5
em cada tumor emparelhado com amostra de tecido não-tumoral foram calculados utilizando a 2 ^{-ΔΔCt método.}

Imunohistoquímica

Parafina expressão relativa -embedded secções de tecido a partir de pacientes ou de ratinhos nus foram tratados termicamente a 60 ° C durante 1 h, desparafinados em xileno, re-hidratado em uma série de etanol (100-50%) e tratou-se em 0,01 mol /L de tampão citrato (pH 6,0 ) para a recuperação de antigénio. A actividade da peroxidase endógena foi inibido após incubação com metanol contendo 0,3% H _{2O 2 durante 30 min. As secções foram então incubadas com anticorpos de detecção RABEX-5 (1:50, Santa Cruz Biotechnology, EUA) ou VEGF (1:150; Ab46154, Abcam, EUA) a 4 ° C durante a noite. O procedimento experimental seguinte foi incubada com o anticorpo secundário. As secções de tecido foram contrastadas com hematoxilina de Mayer. As lâminas foram avaliadas de forma independente por dois patologistas, cegos a todos os dados do paciente. A intensidade da coloração para RABEX-5 foi pontuada como 0 (sem coloração), 1 (coloração ligeira), 2 (moderada coloração) ou 3 (coloração intensa). área de coloração foi pontuada como 0 (0%), 1 (1-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) ou 4 (76-100%), na base da percentagem de As células marcadas positivamente. A pontuação de coloração final, calculado como a soma das pontuações de intensidade e extensão, foi dividido em três grupos como se segue: 0-2, expressão negativa; 3-4, fraca expressão; e 5-6, forte expressão.}

silenciamento alvejado de RABEX-5

O lentiviral interferência vector RABEX-5 foi comprado de Shanghai GenePharma Co., Ltd. A sequência do RABEX-5 oligo interferência de direccionamento foi 5'-GGATGCAAACTCGTGGGAA-3 ', enquanto que a sequência de controle não-homóloga era 5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'. células SGC-7901 e NCI-N87 foram plaqueadas em placas de 6 poços (5 x 10 ^{4 células /cavidade), cultivadas a 40% de confluência e tratadas com sobrenadante viral titulados a uma multiplicidade de infecção (moi) de 10.}

análise de mancha

proteínas celulares totais de Western foram extraídos a partir de células utilizando tampão RIPA contendo Cocktail de Inibidor de Protease (Pierce, Rockford, IL, EUA). A proteína foi quantificada utilizando um kit de ensaio de BCA Protein (Pierce). Os extractos celulares (100 ug) foram separados por electroforese em dodecil sulfato de gel de poliacrilamida de sódio a 10%, e transferidos para membranas de fluoreto de polivinilideno. As membranas foram bloqueadas com leite magro a 5% em solução salina tamponada com Tris (TBS) e incubadas com anticorpos primários, a 4 ° C durante a noite. Os anticorpos primários utilizados foram de coelho anti-RABEX-5 (1:200; Santa Cruz Biotechnology), de coelho anti-GAPDH (1:5000; Ab9485, Abcam) e rato anti-VEGF (1:300; Ab46154, Abcam). As membranas foram então lavadas três vezes em solução de TBS-Tween durante 15 minutos, e incubou-se com anticorpos secundários. Os sinais foram detectados utilizando um sistema de detecção de quimioluminescência aumentada (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, EUA), em conformidade com o protocolo do fabricante.

proliferação celular ensaio

A proliferação celular foi medida utilizando um kit de contagem celular -8 (CCK-8; Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japão). células SGC-7901 ou NCI-N87 foram semeadas em placas de 96 poços (1,5 × 10 ^{3 células /poço) e incubou-se durante vários intervalos de tempo (24, 48, 72, 96 e 120 h). O meio de crescimento foi então removido e substituído por 200 ul de meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS e 20 ul de CCK-8 e as placas foram incubadas a 37 ° C durante 3 h. A absorvância foi medida a 450 nm utilizando um leitor de microplacas Safire2. meio RPMI-1640 contendo 10% de FBS e de CCK-8 foi utilizado como um controlo.}

Colónia ensaio de formação de

As células foram semeadas em placas de 6 poços (1 x 10 ^{3 células /poço) e meio de cultura foi substituído a cada 3-4 dias. Depois de uma cultura de 14 dias, colónias de células foram fixadas com paraformaldeído a 4% durante 10 minutos, coradas com violeta de cristal a 0,1% durante 20 min, e fotografados. Colónias com mais de 50 células foram contadas em cada traço.}

Análise do ciclo celular e apoptose

SGC-7901 /KD, as células NCI-N87 /KD e células de controlo foram recolhidas e ciclo celular e a apoptose foi avaliada por citometria de fluxo. Para a análise do ciclo celular, as células foram fixadas com etanol a 75% e armazenadas a 4 ° C durante a noite. No dia seguinte, as células fixadas foram lavadas com PBS, tratadas com ARNase A (50 ug /ml) e coradas com iodeto de propídio (PI) (50 ug /ml) durante 30 min no escuro. As células coradas foram analisadas por citometria de fluxo (FACSCalibur, Becton-Dickinson).

Para a análise da apoptose, um V-APC Apoptosis Detection Kit I Anexina (BD Pharmingen, EUA) foi utilizado de acordo com as instruções do fabricante. PI e Anexina V-APC coloração dupla foi realizada e as células foram analisadas por citometria de fluxo (FACSCalibur, Becton-Dickinson), usando o software celular Quest (Becton-Dickinson). células V-APC-positivos e PI-negativas anexina foram definidos como a sofrer apoptose. Todos os experimentos foram realizados em triplicado e foram calculados os valores médios destes grupos.

migração Transwell e invasão ensaio

Para os ensaios de migração, 1 × 10 ^{5 células foram suspensas em sérica livre de RPMI-1640 e semeadas em câmaras que não foram revestidas com Matrigel (Corning Costar, NY, EUA). Para o ensaio de invasão, a câmara superior foi pré-revestido com Matrigel (BD Bioscience, CA, EUA) de acordo com os protocolos do fabricante, e 1 × 10 5 as células em meio RPMI-1640 isento de soro foram adicionadas à câmara. Para ambos os ensaios, meio contendo FBS a 10% foi adicionada à câmara inferior, como um quimioatractor. Após 24 h de cultura, as câmaras foram coradas com solução de violeta cristal a 0,5% durante 15 min, e imerso em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 10 min. As células na câmara inferior foram posteriormente contados sob um microscópio invertido. Os valores são expressos como números médio de células em cinco campos aleatórios de vista (200 ×).}

-cicatrização de feridas ensaio

As células foram semeadas em placas de 6 poços e cultivadas até atingirem confluência. As feridas foram riscados sobre a monocamada de células utilizando pontas de pipeta de 20 mL. As placas foram lavadas uma vez com meio fresco para remover as células não aderentes a seguir a cultura de células durante 0 ou 48 h (meio sem soro de vitela), e fotografados.

modelo de xenoenxerto

Quatro de semana do sexo masculino de idade ratinhos nus BALB /C foram adquiridos a partir do Instituto de Zoologia da Academia chinesa de Ciências de Xangai. Os animais foram alojados em gaiolas com fundamentos de aparas de madeira em uma sala com temperatura controlada (68-72 ° F) com um ciclo claro-escuro de 12 h e 45-55% de humidade relativa, e foram permitido o livre acesso à dieta e água potável. Resumidamente, a SGC-7901 /KD ou SGC-7901 células /NC foram tripsinizadas e ressuspensas em PBS (pH 7,4) para injecção no interior de um rato, num volume total de 100 ul. A suspensão de células (1 × 10 ^{6 células) foi injectado no flanco direito de ratinhos. O tamanho do tumor foi medido externamente a cada 3 dias utilizando um compasso, e o volume do tumor foi estimada usando a equação: Comprimento (mm) x largura 2 (mm) × 0,52. Para amenizar o sofrimento de ratos observados durante estes estudos experimentais, os ratos foram sacrificados por CO _{2 inalação no 28º dia após a injeção intraperitoneal, e os tumores foram pesados ​​após a dissecação. As amostras foram armazenadas em azoto líquido durante qRT-PCR ou fixado em 4% de formalina para obter secções embebidas em parafina. Todos os procedimentos foram realizados de acordo com as Diretrizes Tenha cuidado e animal aprovado pelo Comitê Animal Care da Taishan University Medical.}}

A análise estatística

Os dados são representados como a média ± desvio padrão (SD). As diferenças estatísticas entre os dois grupos foram examinados por Estudante de t
-teste. Correlações entre RABEX-5 expressão em tecidos de câncer gástrico e os parâmetros clínico foram analisadas pelo teste do qui-quadrado ou teste exato de Fisher. P Art < 0,05 foi considerado significativo, e P Art < 0,01 foi considerado altamente significativo

Resultados

expressão RABEX-5 é regulada no. tecidos de câncer gástrico

A expressão de RABEX-5
foi examinada em câncer gástrico e tecidos não tumorais adjacentes por qRT-PCR. Observamos significativamente mais elevada expressão de RABEX-5
mRNA em tecidos com câncer gástrico em comparação com os tecidos não tumorais correspondentes ( P
. ≪ 0,01, Fig 1A). Estes resultados foram confirmados no nível de proteína, por coloração imuno-histoquímica (Fig. 1B, C, D, E). RABEX 5-expressão foi predominantemente localizada no citoplasma das células cancerosas. RABEX-5 foi regulada em 61,8% (68/110) dos pacientes com câncer gástrico. A seguir, investigou a relação entre RABEX-5 expressão e características clínico-patológicas do câncer gástrico. Regulação positiva de RABEX-5 foi associada com o tamanho do tumor ( P
= 0,035) e metástases em linfonodos ( P
= 0,006), mas não com outros fatores clínico-patológicas, incluindo sexo, idade ou localização do tumor (Tabela 1).

regulação negativa do RABEX-5 inibe a proliferação de células de cancro gástrico e a formação de colónias

próxima investigada a expressão de RABEX-5 em linhas de células gástricas e a linha celular não cancerosa , GES-1, por análise de western blot. RABEX-5 foi expressa em todas as linhas de células testadas, e foi especialmente elevada em células NCI-N87 (fig. 2A) SGC-7901 e. Para explorar as funções de RABEX-5 em linhas celulares de cancro gástrico, foi realizada alvo knockdown de RABEX-5 nas linhas celulares que expressam elevados, SGC-7901 e NCI-N87. RABEX 5-expressão foi significativamente diminuído em SGC-7901 /KD e as células NCI-N87 /KD em comparação com células de controlo (Fig. 2B). Em primeiro lugar, examinou-se o efeito de perda de RABEX-5 sobre o crescimento de células de cancro gástrico. Após 5 dias de cultura, a taxa de crescimento da SGC-7901 /KD e células NCI-N87 /KD foi significativamente mais lento do que os grupos de controle (Fig. 2C). Nós também confirmou estas observações em ensaios de formação de colónia. número de colónias foram significativamente reduzidos em células SGC-7901 /KD e células NCI-N87 /KD em comparação com células de controlo (Fig. 2D), e observou-se que o tamanho da colónia também era menor nos grupos experimentais em comparação com os controlos. Estes dados sugerem que a regulação negativa da RABEX-5 suprime a proliferação de células de cancro gástrico.

regulação negativa do RABEX-5 promove a apoptose de células de cancro gástrico e induz a paragem do ciclo celular G0 /G1

Os efeitos observados de RABEX-5 knockdown no crescimento celular pode ser devido a alterações na progressão do ciclo celular e apoptose. Estudámos, portanto, os efeitos da RABEX-5 silenciamento no ciclo celular e apoptose in vitro
, por citometria de fluxo. análise de citometria de fluxo revelou que a proporção de células na /fase G1 G0 no SGC-7901 /KD ou NCI-N87 células /KD foi maior que no SGC-7901 /NC ou grupos de controle NCI-N87 /NC, enquanto o percentual de células na fase G2 /M foi significativamente diminuída em comparação com os controlos (Fig. 3A, B). Nós também observados efeitos significativos sobre a apoptose nos grupos tratados diferentemente (Fig. 3C e D), com regulação negativa da expressão RABEX-5 que conduz a um aumento da apoptose de células de cancro gástrico.

regulação negativa do RABEX-5 inibe a migração , invasão e capacidade de cicatrização das células cancerosas gástricas

Para investigar a influência da RABEX-5 sobre migração e invasão, nós próxima realizados transpo� ensaios de migração e invasão. Regulação negativa da RABEX-5 migração celular suprimida (SGC-7901 /grupo de KD, 121,3 ± 6,1 células /campo; SGC-7901 /grupo NC, 261,0 ± 10,5 células /campo; NCI-N87 grupo /KD, 108,7 ± 6,1 células /campo; NCI-N87 /NC grupo, 241,7 ± 10,6 células /campo; P
. < 0,05) (Fig 4A, C). Resultados similares foram observados em transpo� ensaios de invasão (SGC-7901 /grupo de KD, 76,3 ± 6,1 células /campo; SGC-7901 /grupo NC, 108,7 ± 6,0 células /campo; grupo NCI-N87 /KD, 60,7 ± 6,0 células /campo; NCI-N87 grupo /NC, 119,0 ± 8,5 células /campo; P Art < 0,05) (Fig 4B, D)

Para investigar o efeito da RABEX-5 na motilidade.. e cicatrização de feridas, também realizado ensaios de cicatrização de feridas. Observou-se que a distância entre as bordas da ferida de SGC-7901 /KD e células NCI-N87 /KD foi marcadamente mais do que aqueles da SGC-7901 /NC ou células NCI-N87 /NC (Fig. 4E). De acordo com estas observações, os níveis de VEGF foram reprimidos em ambos os níveis de mRNA e proteína do SGC-7901 /células KD (Fig. 4F, G).

O silenciamento de RABEX-5 inibe o crescimento do câncer gástrico in vivo

com base no in vitro
resultados descritos acima, ao lado examinou o efeito de RABEX-5 silenciamento no crescimento do tumor in vivo
pela injeção SGC7901 /KD ou SGC7901 /NC células por via subcutânea nas regiões flanco direito de ratinhos nus. O tamanho do tumor foi monitorizado a cada 3 dias com um compasso de calibre. O volume do tumor foi significativamente reduzido em ratinhos 2 semanas após a injecção das células SGC-7901 /KD em comparação com células de controlo ( P
< 0,05; Fig. 5A). O volume de tumor de xenoenxertos derivado do grupo SGC-7901 /KD era comparável ao do grupo /CN SGC-7901, exibindo uma diminuição marcada do volume tumoral 4 semanas após a inoculação de células tumorais ( P
< 0,05, Fig. 5B e C). Além disso, o peso de tumores derivados de células SGC-7901 /KD foi significativamente menor do que a dos controlos ( P
< 0,05; Fig. 5D). A seguir, examinaram a expressão de VEGF em amostras tumorais transplante por qRT-PCR e imuno-histoquímica. Como mostrado na Fig. 5E e 5F, os níveis de mRNA e proteína VEGF foram diminuiu no grupo SGC-7901 /KD comparação com SGC-7901 /controle NC. Estes in vivo
dados são consistentes com nossos in vitro
observações e confirmar que silenciamento de RABEX-5 inibe o crescimento do câncer gástrico e progressão, modulando a atividade transcricional VEGF. Em resumo, RABEX-5 desempenha um papel oncogênico no câncer gástrico

Discussão

Embora estudos anteriores mostraram que RABEX-5 desempenha um papel na tumorigénese em vários tipos de câncer [11]. - [14], o seu papel no câncer gástrico não tinha sido investigado. No presente estudo, descobrimos que RABEX-5 expressão é significativamente regulada positivamente em tecidos com câncer gástrico em comparação com o tecido normal adjacente, indicando que RABEX-5 pode contribuir para tumorigênese câncer gástrico. Além disso, a expressão de RABEX-5 foi significativamente associada com o tamanho do tumor e metástases em linfonodos. Em contraste, não houve correlações significativas entre anormal RABEX-5 expressão e sexo, idade ou localização do tumor. Este é o primeiro estudo para elucidar o significado clínico-patológico de RABEX-5 expressão em pacientes com câncer gástrico.

Para investigar o papel do RABEX-5 na promoção de tumores, o próximo realizada extensa perda de análise de funções em RABEX- 5 linhas de células de alta expressão, SGC-7901 e NCI-N87. inibição bem sucedida da RABEX 5-expressão foi alcançada através de tecnologia RNAi, e knockdown foi confirmada por Western blot. As análises revelaram que a proliferação celular diminuiu significativamente em SGC-7901 /KD e células e resultados semelhantes NCI-N87 /KD foram obtidos em ensaios de formação de colónias. Importante, in vivo
modelos de xenotransplante apoiou estas in vitro
observações. Este fenótipo pode ser causada por RABEX 5-regulação de genes específicos e vias de sinalização, afectando assim ciclo celular e apoptose. Em transpo� ensaios, menos células SGC-7901 /KD e NCI-N87 /KD migraram para a câmara baixa do que as células de controle, sugerindo que RABEX-5 aumenta a migração e invasão em células cancerosas gástricas. Cicatrização de feridas também foi significativamente reduzida seguinte silenciamento de RABEX-5. Estes resultados verificar o papel importante de RABEX-5 em crescimento de células de cancro gástrico e comportamento metastático. No entanto, o mecanismo molecular exacto pelo qual RABEX-5 exerce estes efeitos permanece desconhecida, uma vez que estudos envolvendo RABEX-5 são limitados.

Estudos anteriores demonstraram que RABEX-5 se pode ligar especificamente para a forma ativa da RAB- 5, regulando assim o acoplamento e a fusão de membranas endossómicas, a motilidade dos endossomas e a transdução de sinal intracelular [15]. A expressão de proteínas RAB-5 tem sido associada com o desenvolvimento de vários tumores malignos [16] - [18] e é capaz de promover a migração de células tumorais [19], [20]. A angiogénese desempenha um papel fundamental na tumorigénese [21], e é regulada por vários factores, tais como o factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) e o factor de crescimento endotelial vascular (VEGF) [22]. A /via de sinalização de Akt PI3K pode ser regulada por ambos os VEGF e PDGF. Por exemplo, o VEGF aumenta a proliferação de neuroblastoma por activação da via PI3K /Akt sinalização [23]. Do mesmo modo, estudos têm mostrado que o PDGF pode afectar a capacidade de migração de células através da via PI3K /AKT [24]. A activação de sinalização de PI3K /Akt pode inibir a apoptose celular induzida por diversos estímulos [25] - [29], e promover a progressão do ciclo celular [30], [31], promovendo assim a sobrevivência e proliferação das células. Esta via também participa na angiogénese, [33] [32], e desempenha um papel importante na formação de tumores, invasão e metástase [34], [35]. O nosso estudo mostra que RABEX-5 silenciamento provoca uma diminuição na expressão de VEGF. Por conseguinte, os autores sugerem que RABEX-5 promove o crescimento e a capacidade metastática de células de cancro gástrico, através da activação de VEGF e suas vias de sinalização a jusante.

Em conclusão, nós demonstramos que RABEX-5 promove a proliferação, a formação de colónias, migração e invasão, sugerindo que RABEX-5 pode ser um oncogene no cancro gástrico, e os seus efeitos podem ser parcialmente mediados através da modulação da activação de VEGF. RABEX-5 pode, portanto, representam um novo marcador diagnóstico e prognóstico e um novo alvo terapêutico no cancro gástrico. Mais esforços devem ser feitos para esclarecer as vias de sinalização subjacentes a estes fenómenos biológicos.

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