Ploche ONE: RABEX-5 je stimulovaná a hrá onkogénnych úlohu v žalúdku vzniku rakoviny aktiváciou VEGF signalizácia Pathway

abstraktné

RABEX-5, výmenný guanín nukleotidu faktora (GEF) pre RAB-5 , sa podieľa na vzniku nádorov a vo vývoji niektorých ľudských nádorov. Tu sme správu, že RABEX-5 podporuje rast nádoru a metastatického schopnosť rakovinových buniek žalúdka obaja in vitro stroje a in vivo
. Expresie RABEX-5, je významne vyššia u karcinómu žalúdka tkanivách a je spojená s veľkosťou nádoru a lymfatických uzlín. Okrem toho, cielené umlčanie RABEX-5 zníženú proliferáciu nádorových buniek žalúdočnej a tvorbu kolónií in vitro
cez indukciu G0 /G1 fáze zástave a stimulovanej žalúdočnej rakovinových buniek apoptózu. Vyradenie RABEX-5 inhibujú tiež hojenie rán, migrácia a invazívne schopnosťou nádorových buniek žalúdka. Výsledky vivo
pokusov na zvieratách boli tiež v súlade s týmito in vitro
nálezy u. Umlčanie RABEX-5 viedlo k zníženiu expresie VEGF. Tieto výsledky ukazujú, že RABEX-5 je up-regulovaná a hrá onkogénnu úlohu vo vývoji rakoviny žalúdka tým, že aktivuje signálne dráhy VEGF

Citácia :. Wang S, Lu A, Chen X, Wei L, Ding J (2014) RABEX-5 je stimulovaná a hrá onkogénnych úlohu v žalúdku rozvoj rakoviny aktiváciou VEGF signálny dráhu. PLoS ONE 9 (11): e113891. doi: 10,1371 /journal.pone.0113891

Editor: Xin-Yuan Guan, The University of Hong Kong, Čína

prijatá: 03.09.2014; Prijaté: 31. októbra 2014; Publikované: 26.novembra 2014

Copyright: © 2014 Wang et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Dostupné dát: Text. autori potvrdzujú, že všetky údaje súvisiace závery sú plne k dispozícii bez obmedzenia. Všetky relevantné údaje sú v papiera a jeho podporné informácie súbory

Financovanie :. Títo autori nemajú žiadnu podporu ani finančné prostriedky hlásiť

Konflikt záujmov :. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy existujú.

Úvod

Napriek poklesu celosvetového výskytu v určitých regiónoch sveta, rakovina žalúdka zostáva štvrtá najvyššia v incidenciu a druhý v úmrtnosti medzi všetkými rakoviny po celom svete [1]. Štúdie ukazujú, že faktory životného prostredia, ako je napríklad Helicobacter pylori
infekcie, fajčenie cigariet a diéty, môžu zohrávať dôležitú úlohu pri vzniku karcinómu žalúdka [2]. Ranej fáze rakovina žalúdka je zvyčajne bez príznakov alebo v kombinácii s nešpecifickými príznakmi, ako je dyspepsia, a v čase, keď sa objavia príznaky, sa často nachádza v pokročilom štádiu. Cez spoločnom využívaní multimodálne liečby (chemoterapia, radiačnej a chirurgii), 5-ročné prežitie pacientov zostáva na nízkej úrovni, na 20-40% [3]. Hoci výskum rakoviny žalúdka zaznamenala veľký pokrok, molekulárne mechanizmy, ktoré sú základom pre vývoj rakoviny žalúdka zostáva nedokonale pochopený.

Exocytóza a endocytózy sú kľúčové procesy bunkami používajú na udržanie normálnej fyziologickú funkciu, a vačkov doprava je kľúčovou súčasťou tohto procesu. Malé GTPases hrať spínacie funkciu v intracelulárnych molekulách a veľmi dôležitú úlohu v endocytózy a vačkov dopravy, vrátane regulácie bunkového rastu, prenos signálu, diferenciácia a aktínu cytoskeletu budovy a mnoho aspektov ostatných bunkových procesov [4]. V Ras superfamily, existuje viac ako 50 druhov GTPase vrátane Rab, ktorý patrí k najväčším podčeľade [5]. Štúdie ukázali, že väčšina Rab proteíny regulujú zacielenie na dopravu, fagocytózu a vačkov ukotvenie na konkrétne membrány, zatiaľ čo malý počet Rab proteínov regulovať vačok pučiace [6], [7]. Malý GTPase RAB-5, ktorý je distribuovaný v plazmatické membráne a čoskoro endosomech, je majstrom regulátor skorého endocytických obchodovanie [8]. Rovnako ako iné malé GTPázy, RAB-5 je aktivovaný výmenou naviazaného HDP s GTP, katalyzovanou rodiny výmenných guanín-nukleotid faktory [9]. RABEX-5 bol identifikovaný ako interactor z Rabaptin-5 a má aktivitu GEF k RAB-5 a súvisiacich GTPase. Rovnako tak, ako RABEX-5 a Rabaptin-5 sú nutné pre RAB-5-riadený endozomu fúzie in vitro
[10].

Nedávne štúdie ukázali, že RABEX-5 expresie je významne vyššia v niekoľkých druhov rakoviny, vrátane rakoviny prsníka [11], rakoviny prostaty [12] a kolorektálneho karcinómu [13]. Abnormálne RABEX-5 expresiu v nádoroch naznačuje, že RABEX-5 je významná v patogenéze rakoviny a progresie, a môže ovplyvniť nádorové biologické správanie. Avšak role a mechanizmus účinku RABEX-5 v žalúdku karcinogenéze rakoviny a progresie nebola stanovená. V tejto štúdii sme najprv analyzovali expresiu RABEX-5 v žalúdočnej rakovinové tkanive za použitia kvantitatívne reverznej transkripcie-polymerázovej reťazovej reakcie (QRT-PCR) a imunohistochémia. Následne sme skúmali účinky RABEX-5 na nádorovú biologické funkcie in vitro stroje a in vivo
. Naše výsledky ukazujú, že RABEX-5 je nadmerne exprimovaný a hrá úlohu v onkogénne rakoviny žalúdka.

materiáloch a metódach

Ethics Prehlásenie

Všetky pokusy na zvieratách popísané v tejto štúdii boli schválené o používanie a ošetrovanie výboru pre ústavné zvierat (IACUC) na Taishan lekárskej univerzite a všetkých zvierat udržiavali v súlade s pokynmi IACUC. Zber a využitie ľudských vzoriek boli schválené Institutional Review Board Taishan lekárskej univerzity a sesterské Taian Central Hospital Medical Center, po informovaný písomný súhlas od všetkých pacientov.

Pacienti a tkanivové vzorky

celkom 110 sád nádorov žalúdka a priľahlá, nenádorových tkanív (aspoň 5 cm od okraja tumoru) boli získané od pacientov, ktorí podstúpili kuratívny chirurgický zákrok na Taian centrálnej nemocnice v období od januára 2010 do decembra 2013. Títo zahŕňali 27 žien a 83 mužov s priemerným vekom 59,3 rokov (rozmedzie 32-80 rokov). Žiadny pacient dostal rádioterapii alebo chemoterapii pred operáciou. Klinicko-patologické údaje boli zhromaždené a patologické nádor staging bola stanovená podľa Spoločného výboru amerického rakoviny (AJCC) žalúdočné karcinóm TNM predstavovať systém. Histologické typizácie bola vykonaná s najmenej dvoma odborných patológov, pracujúci nezávisle na sebe v dvojito zaslepenej. Štúdia bola schválená inštitucionálne Review radách Taishan lekárskej univerzity a sesterské Taian Central Hospital Medical Center. Písomný informovaný súhlas bol získaný od každého pacienta pred vstupom do štúdie v štúdii.

Bunkové línie a kultivačné podmienky

ľudských bunkových línií karcinómu žalúdka a imortalizované žalúdočnej sliznice, epiteliálne bunková línia, GES-1 , boli zakúpené z Shanghai inštitútov biologických vied, čínskej akadémie vied. Bunkové línie boli rutinne udržiavané v médiu RPMI-1640 obsahujúcom 10% teľacieho séra, penicilínom (100 IU /ml) a streptomycínom (100 IU /ml) v atmosfére 5% CO _{2 atmosfére pri teplote 37 ° C.}

Total RNA izolácie a QRT-PCR

Celková RNA bola extrahovaná zo vzoriek tkanív alebo bunkových línií za použitia TRIzolu činidla (Invitrogen, USA), podľa inštrukcií výrobcu. Reverzný transkripcie bola vykonaná za použitia 1 ug celkovej RNA podľa návodu výrobcu (Promega, Madison, WI, USA). PCR bola vykonaná za použitia SYBR Green činidla (Applied Biosystems, CA, USA) a nasledujúcich primerov PCR; RABEX-5
(dopredu) 5'-TTGGACAGATGGAATTGCAA-3 'a (reverznej) 5'-GTTGCAGTGGTGGAGGAAGT-3'; VEGF
(dopredu) 5'-CTGTACCTCCACCATGCCAAGT-3 'a (reverznej) 5'-CTTCGCTGGTAGACATCCATGA-3' a GAPDH
(dopredu) 5'-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3 'a (reverznej) 5'-GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3 '. PCR reakcie boli vykonané s počiatočnou denaturácia pri 95 ° C po dobu 2 minúty, nasleduje 30 cyklov pri teplote 94 ° C počas 30 s, 55 ° C počas 30 sekúnd a 72 ° C počas 30 s, s konečnou predĺženie pri 72 ° C po dobu 10 min. GAPDH
bola použitá ako vnútorná kontrola a všetky reakcie boli vykonávané v triplikátech. Tieto relatívna pomery expresie RABEX-5
v každom spárovaného nádoru na nenádorových vzorky tkaniva boli vypočítané s použitím ^{-ΔΔCt metóda je 2.}

Imunohistochémia

parafín -embedded tkanivové rezy z pacientov alebo u nahých myší boli tepelne spracované pri teplote 60 ° C počas 1 h, odparafínované v xyléne, znovu hydratovaná v rade etanolu (100 až 50%) a spracuje sa 0,01 mol /l citrátového pufru (pH 6,0 ) pre získanie antigénu. Endogénnej peroxidázy aktivita bola inhibovaná po inkubácii s metanol s obsahom 0,3% H _{2O 2 po dobu 30 minút. Rezy potom boli inkubované s protilátkami detekciu RABEX-5 (1:50, Santa Cruz Biotechnology, USA) alebo VEGF (1: 150; Ab46154, abca, USA) pri 4 ° C cez noc. V nasledujúcej experimentálny postup sa inkubuje so sekundárnou protilátkou. Tkanivové rezy boli kontrastne Mayerovým hematoxylínom. Sklíčka bola vyhodnotená samostatne dvoma patológmi, stínil všetky dáta pacienta. Intenzita farbenia na RABEX-5 bol hodnotený ako 0 (žiadne farbenie), 1 (mierne farbenie), 2 (stredná farbenie) alebo 3 (intenzívne farbenie). Farbenie oblasť bola hodnotená ako 0 (0%), 1 (1-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) a 4 (76-100%), na základe percentuálneho podielu pozitívne farbené bunky. Konečné skóre farbenie, počítané ako súčet skóre intenzitu a rozšírenie, bol rozdelený do troch skupín nasledovne: 0-2, negatívne vyjadrenia; 3-4, slabý výraz; a 5-6, silná expresia.}

cielené umlčanie RABEX-5

RABEX-5 lentivirový interferencie vektor bol zakúpený od Shanghai GenePharma Co., Ltd. sekvenciu RABEX-5 interferencie cielenie oligonukleotid je 5'-GGATGCAAACTCGTGGGAA-3 ', zatiaľ čo non-homológnej kontrolné sekvencie bola 5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'. SGC-7901 a NCI-N87 bunky boli nanesené na 6-jamkové doštičky (5 x 10 ^{4 buniek /jamku), pestované do 40% zhlukovania a ošetrené titrovaný vírusového supernatantu pri multiplicitě infekcie (MOI) 10.}

Western blot analýza

celých buniek proteíny boli extrahované z buniek za použitia RIPA pufra, ktorý obsahuje Protease Inhibitor Cocktail (Pierce, Rockford, IL, USA). Proteín bol kvantifikovaný pomocou testu BCA Protein Kit (Pierce). Bunkové extrakty (100 ug) boli od seba oddelené 10% dodecylsulfát sodný elektroforézou na polyakrylamidovom gélu a prenesené na PVDF membrány. Membrány boli blokované 5% netučného mlieka v Tris-pufrovanom fyziologickom roztoku (TBS) a inkubované s primárnymi protilátkami pri 4 ° C cez noc. Primárne protilátky boli králičie anti-RABEX-5 (1: 200; Santa Cruz Biotechnology), králičie anti-GAPDH (1: 5000; Ab9485, abca) a myší anti-VEGF (1: 300; Ab46154, abca). Membrány potom boli trikrát premyté v TBS-Tween po dobu 15 minút, a inkubujú sa sekundárne protilátky. Signály boli detekované za použitia rozšírenej detekcie chemiluminiscencie systém (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, USA) v súlade s protokolom výrobcu.

testu proliferácie buniek

Bunková proliferácia sa merala za použitia Cell počítanie Kit -8 (CCK-8, Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japonsko). SGC-7901 alebo NCI-N87 bunky boli vrúbľovať do 96-jamkových doštičiek (1,5 x 10 ^{3 buniek /jamku) a inkubované po dobu rôznych časových bodoch (24, 48, 72, 96 a 120 h). Rastové médium bolo odstránené a nahradené 200 ul RPMI-1640 obsahujúcom 10% FBS a 20 ul CCK-8 a doštičky boli inkubované pri teplote 37 ° C počas 3 hodín. Absorbancia bola meraná pri 450 nm za použitia čítačky mikrodoštičiek Safire2. RPMI-1640 obsahujúcom 10% FBS a CCK-8 bol použitý ako kontrola.}

Colony testu tvorenie

Bunky boli vrúbľovať do 6-jamkových doštičiek (1 x 10 ^{3 buniek /jamka) a kultivačné médium bolo nahradené každé 3-4 dni. Po kultivácii po 14 dňoch, bunkové kolónie boli fixované 4% paraformaldehydom po dobu 10 minút, zafarbené 0,1% kryštálovou violeťou po dobu 20 minút, a fotografovať. Kolónie s viac ako 50 buniek, sa počíta so v každej palubnej doske.}

Analýza bunkového cyklu a apoptóza

SGC-7901 /KD, NCI-N87 /KD bunky a kontrolné bunky sa zhromaždia a bunkového cyklu a apoptóza bola hodnotená prietokovou cytometriou. Na analýzu bunkového cyklu boli bunky fixované 75% etanolom a skladovať pri teplote 4 ° C cez noc. Nasledujúci deň, Fixované bunky boli premyté PBS, spracuje sa s RNázou A (50 ug /ml) a zafarbené propidium jodidom (PI) (50 ug /ml) počas 30 minút v tme. Zafarbený boli bunky analyzované prietokovou cytometriou (FACSCalibur, Becton-Dickinson).

Pre analýzu apoptózy, čo annexinu V-APC Apoptosis Detection Kit I (BD Pharmingen, USA) bol použitý podľa návodu výrobcu. PI a annexin V-APC dvojité farbenie bolo vykonané a bunky boli analyzované pomocou prietokovej cytometrie (FACSCalibur, Becton-Dickinson) za použitia softvéru Cell Quest (Becton-Dickinson). Annexin V-APC-pozitívne a Pl-negatívne bunky boli definované ako apoptózu. Všetky experimenty boli vykonávané trojmo a priemerné hodnoty týchto skupín boli vypočítané.

Transwell migrácie a invázie test

V prípade migrácie testy, 1 × 10 ^{5 bunky boli suspendované v séra o bez RPMI-1640 médiu a nanesené na komory, ktoré neboli potiahnuté Matrigel (Corning Costar, NY, USA). Pre test invázie, horná komora bola potiahnuté Matrigelu (BD Bioscience, CA, USA) podľa protokolu výrobcu, a 1 x 10 5 buniek v bezsérovém médiu RPMI-1640 boli pridané do komory. Pre obidva testy, médiu obsahujúcom 10% FBS bolo pridané do dolnej komory ako chemoatraktantu. Po 24 hodinách sa kultúry, komory boli zafarbené 0,5% roztokom kryštálovej violete po dobu 15 minút, a ponorený vo fosfátom pufrovanom fyziologickom roztoku (PBS) po dobu 10 min. Buniek v dolnej komore boli následne počítané pod inverzným mikroskopom. Hodnoty sú vyjadrené ako stredná hodnota počtu buniek v piatich náhodných zornom poli (200 ×).}

hojenie rán test

Bunky boli schovať na 6-jamkové doštičky a kultivované, kým nedosiahli zhlukovania. Rany boli poškrabal na monovrstvě buniek za použitia 20-ul pipety tipy. Doštičky boli raz premyté čerstvým médiom pre odstránenie non-adherentních buniek po kultivácii buniek na 0 až 48 h (médium bez teľacieho séra) a fotografovať.

modelu xenoimplantátu

Four-týd- nu starý samec BALBI /C nahé myši boli zakúpené z ústavu zoológie, čínskej akadémie vied Šanghaji. Zvieratá boli chované v klietkach s drevnú štiepku posteľnou bielizňou v regulovanou teplotou miestnosti (68 až 72 ° F) s cyklu svetlo-tma 12 h a 45 až 55% relatívnej vlhkosti vzduchu, a bol povolený voľný prístup k potrave a pitnej vody. Stručne povedané, SGC-7901 /KD alebo SGC-7901 /NC boli bunky trypsinizovány a resuspendované v PBS (pH 7,4) pre injekcie do jednej myši, v celkovom objeme 100 ul. Suspenzie buniek (1 x 10 ^{6 buniek) podali do pravého boku myší. Veľkosť nádoru bola meraná externe raz za 3 dni pomocou posuvného merítka a objem nádoru bol odhadnutý pomocou rovnice: dĺžka (mm) x šírka 2 (mm) x 0,52. K zlepšeniu akékoľvek utrpenie myší pozorované pri týchto experimentálnych štúdií, boli myši usmrtené CO _{2 inhaláciu v 28. deň po intraperitoneálnej injekcie, a nádory boli vážené po sekcii. Vzorky boli uložené v kvapalnom dusíku pre QRT-PCR alebo fixované v 4% formaldehydu pre získanie parafínových sekcií. Všetky postupy sa vykonávali podľa pokynov zvieraťu starostlivosť a používanie schválených Výborom pre Taishan Medical University starostlivosť o zvieratá.}}

Štatistická analýza

Dáta sú reprezentované ako priemer ± štandardná odchýlka (SD). Štatistické rozdiely medzi oboma skupinami boli skúmané Študent je t
-test. Korelácia medzi RABEX-5 expresie v karcinómu žalúdka tkanivách a klinicko-parametre boli analyzované pomocou chi-kvadrát alebo Fisherovho exaktného testu. P Hotel < 0,05 bola považovaná za významnú, a P Hotel < 0,01 bola považovaná za veľmi významný

Výsledky

výrazom RABEX-5 je up-regulovaná v. rakovina žalúdka tkaniva

expresie RABEX-5
bola skúmaná v karcinómu žalúdka a okolitom normálnom tkanív QRT-PCR. Pozorovali sme významne vyššie expresiu RABEX-5
mRNA v žalúdočných rakovinových tkanivách v porovnaní so zodpovedajúcimi non-nádorového tkaniva ( P
. ≪ 0,01, obr 1A). Tieto výsledky boli potvrdené na úrovni proteínu imunohistochemickým farbením (obr. 1B, C, D, E). RABEX-5 expresie bola prevažne lokalizované v cytoplazme nádorových buniek. RABEX-5 bola up-regulovaná v 61,8% (68/110) pacientov s rakovinou žalúdka. Ďalej sme skúmali vzťah medzi RABEX-5 expresie a patologickým rysy karcinómu žalúdka. Upregulace RABEX-5 bol spojený s veľkosti nádoru ( P
= 0,035) a lymfatických uzlín ( P
= 0,006), ale nie s ostatnými klinicko faktorov, vrátane pohlavia, veku a umiestnenia nádoru (tabuľka 1).

upregulace RABEX-5 inhibuje proliferáciu buniek rakoviny žalúdka a tvorba kolónií

Ďalej sme skúmali expresiu RABEX-5 v bunkových líniách žalúdočných a bunkové línie bez rakoviny , GES-1, analýzou westernovým prenosom. RABEX-5 bol exprimovaný vo všetkých testovaných bunkových líniách, a to najmä s vysokým obsahom SGC-7901 a NCI-N87 buniek (obr. 2A). Ak chcete preskúmať funkcie RABEX-5 v žalúdočných rakovinových bunkových línií sme vykonali cielené vyraďujúce RABEX-5 v bunkových líniách vysokej expresiou, SGC-7901 a NCI-N87. RABEX-5 expresie bola v SGC-7901 /KD a NCI-N87 /KD buniek významne znížila v porovnaní s kontrolnými bunkami (obr. 2B). Najprv sme skúmali účinok straty RABEX-5 na rast buniek karcinómu žalúdka. Po 5 dňoch kultivácie tempo rastu SGC-7901 /KD a NCI-N87 /KD buniek bol výrazne pomalší ako kontrolnej skupiny (obr. 2C). Tiež potvrdil, tieto pozorovania v testoch tvorby kolónií. Čísla kolónie boli významne znížené v SGC-7901 /KD buniek a NCI-N87 /KD buniek v porovnaní s kontrolnými bunkami (Obr. 2D), a sme zistili, že veľkosť kolónie, bolo tiež menšie v experimentálnych skupinách v porovnaní s kontrolami. Tieto údaje naznačujú, že zníženie expresie z RABEX-5 potláča žalúdočnú množenie rakovinových buniek.

znižujúce množstvo RABEX-5 podporuje apoptózu rakovinových buniek žalúdočnej a indukuje G0 /G1 bunkového cyklu

pozorovaných účinkov RABEX-5 knockdown na bunkový rast, môže byť v dôsledku zmien v progresii bunkového cyklu a apoptózy. Preto sme skúmali účinky RABEX-5 umlčanie na bunkový cyklus a apoptózu in vitro
, pomocou prietokovej cytometrie. Analýza prietokovou cytometriou ukázalo, že podiel buniek v G0 /G1 fáze v SGC-7901 /KD alebo NCI-N87 /KD buniek bola vyššia ako v SGC-7901 /NC alebo NCI-N87 kontrolnou skupinou /NC, zatiaľ čo podiel bunky v G2 /M fázy sa významne znížila v porovnaní s kontrolami (obr. 3A, B). Tiež sme pozorovali významné účinky na apoptózu v rôzne liečených skupín (Obr. 3C, D), s downregulace RABEX-5 expresie vedie k zvýšeniu žalúdočnej rakovina bunkovej apoptózy.

upregulace RABEX-5 inhibuje migráciu , invázia a hojenie rán schopnosť rakovinových buniek žalúdka

Ak chcete skúmať vplyv RABEX-5 o migrácii a invázii, máme ďalšiu vykonaná transjamkových migrácie a invázie testy. Downregulaci RABEX-5 potlačeným migráciu buniek (SGC-7901 skupine /KD, 121,3 ± 6,1 bunky /odbor; SGC-7901 /NC skupina, 261,0 ± 10,5 buniek /odbor; NCI-N87 /skupina KD, 108,7 ± 6,1 buniek /pole; NCI-N87 /NC skupina, 241.7 ± 10,6 buniek /poľa; P
. < 0,05) (obr 4A, C). Podobné výsledky boli pozorované u transwell invázie testoch (SGC-7901 skupine /KD, 76,3 ± 6,1 buniek /oblasti; SGC-7901 /skupina NC, 108.7 ± 6,0 buniek /poľa; NCI-N87 /skupiny KD, 60,7 ± 6,0 buniek /pole; NCI-N87 /NC skupina, 119,0 ± 8,5 buniek /poľa; P Hotel < 0,05) (obr 4B, D)

Pre skúmanie účinku RABEX-5 na pohyblivosť .. a hojenie rán, tiež vykonané testy pre hojenie rany. Pozorovali sme, že vzdialenosť medzi okraje rany z SGC-7901 /KD a NCI-N87 /KD buniek bola výrazne dlhšia ako u SGC-7901 /NC alebo NCI-N87 /NC-buniek (obr. 4E). V súlade s týmito pozorovaniami, hladiny VEGF boli downregulated tak na úrovni mRNA a bielkovín v SGC-7901 /KD buniek (obr. 4F, G).

Umlčanie RABEX-5 inhibuje rast rakoviny žalúdka in vivo

na základe in vitro je opísané
uvedené zistenia, Ďalej sme skúmali vplyv RABEX-5 umlčanie na rast nádoru in vivo
vstrekovaním SGC7901 /KD alebo SGC7901 /NC buniek subkutánne do pravého boku regiónoch nahých myší. Veľkosť nádoru bola monitorovaná za 3 dni s strmeňom. Objem nádoru bol významne znížený u myší 2 týždne po injekcii SGC-7901 /KD buniek v porovnaní s kontrolnými bunkami ( P
menšie ako 0,05, obr. 5A). Objem nádoru xenoimplantátů odvodený z SGC-7901 /skupiny KD bola porovnateľná s SGC-7901 /NC skupiny, vykazujúce výrazné zníženie objemu nádoru 4 týždne po inokulácii nádorových buniek ( P Hotel < 0,05, obr. 5B, C). Okrem toho je hmotnosť nádorov odvodených od SGC-7901 /KD buniek bola významne menšie ako u kontrol ( P
menšie ako 0,05, obr. 5D). Ďalej sme skúmali expresiu VEGF vo vzorkách transplantácii nádoru pomocou QRT-PCR a imunohistochémia. Ako je znázornené na Obr. 5E a 5F, hladiny VEGF mRNA a bielkoviny boli znížené v SGC-7901 /skupine KD v porovnaní s SGC-7901 /NC kontrolou. Tieto in vivo
údaje sú v súlade s našimi in vitro
pozorovania a potvrdzujú, že umlčanie RABEX-5 inhibuje rast rakoviny žalúdka a progresii tým, že modulujú VEGF transkripčný aktivitu. Súhrnne možno povedať, RABEX-5 hrá úlohu v onkogénne karcinómu žalúdka

Diskusia

Aj keď predchádzajúce štúdie ukázali, že RABEX-5 hrá úlohu v tvorbe nádorov v niekoľkých typov rakoviny [11]. - [14], neboli skúmané jeho úloha v rakovine žalúdka. V tejto štúdii sme zistili, že RABEX-5 expresie je významne up-regulovaná v žalúdočnej rakovinové tkanive v porovnaní s priľahlou normálnou tkanív, čo naznačuje, že RABEX-5, môže prispievať k vzniku nádorov žalúdka rakoviny. Okrem toho, expresia RABEX-5 bol významne spojené s veľkosťou nádoru a lymfatických uzlín. V kontraste, tam neboli žiadne významné korelácie medzi abnormálne RABEX-5 prejavu a pohlavia, veku alebo umiestnenia nádoru. Toto je prvá štúdia na objasnenie klinicko význam RABEX-5 expresie u pacientov s rakovinou žalúdka.

Ak chcete skúmať úlohu RABEX-5 v podpore nádorov, máme ďalšie vykonal rozsiahlu stratu funkčné analýzy v RABEX- 5 bunkové línie vysoko exprimujúce, SGC-7901 a NCI-N87. Úspešné inhibícia RABEX-5 expresie bolo dosiahnuté technológie RNAi, a knockdown bola potvrdená metódou Western blot. Naše analýzy odhalili, že proliferácia buniek bola v SGC-7901 /KD a NCI-N87 /KD buniek a podobné výsledky výrazne znížil boli získané pri testoch tvorby kolónií. Dôležité je, že vivo
xenograftových modely podporované tieto in vitro
pozorovanie. Tento fenotyp môže byť spôsobené RABEX-5 reguláciu špecifické gény a signálnych dráh, čím ovplyvňuje bunkový cyklus a apoptózu. V transwell testoch, menej SGC-7901 /KD a NCI-N87 /KD bunky prenesené do dolnej komory, než kontrolné bunky, čo naznačuje, že RABEX-5 zvyšuje migráciu a inváziu do buniek karcinómu žalúdka. Hojenie rán bola tiež významne znížila po umlčanie RABEX-5. Tieto výsledky potvrdzujú, dôležitú úlohu RABEX-5 v žalúdku rastu nádorových buniek a metastatického správania. Avšak presný molekulárnej mechanizmus, ktorým pôsobí RABEX-5 tieto účinky zostáva neznámy, pretože štúdií zahŕňajúcich RABEX-5 sú obmedzené.

Predchádzajúce štúdie ukázali, že RABEX-5 môže špecificky viazať na aktívnu formu RAB- 5, čím sa reguluje dokovania a fúzie endosomálním membrán, pohyblivosť endosomů a intracelulárneho prenosu signálu [15]. Expresie RAB-5 proteínov bola spojená s rozvojom rôznych zhubných nádorov [16] - [18] a je schopný podporovať migráciu nádorových buniek [19], [20]. Angiogenézy hrá kľúčovú úlohu pri vzniku nádorov [21], a je regulovaná mnohými faktormi, ako je rastový faktor odvodený od krvných doštičiek (PDGF) a vaskulárny endoteliálny rastový faktor (VEGF), [22]. PI3K /Akt signálnej dráhy môže byť regulovaná ako VEGF a PDGF. Napríklad VEGF zvyšuje neuroblastóm proliferáciu aktiváciou PI3K /Akt signalizáciu [23]. Podobne, štúdie ukázali, že PDGF môže mať vplyv na migračné schopnosť buniek cez PI3K /Akt dráhy [24]. Aktivácia PI3K /Akt signalizácie môže inhibovať bunkovú apoptózu vyvolanú rôznymi podnetmi [25] - [29], a podporovať progresiu bunkového cyklu [30], [31], a tým podporovať prežívanie buniek a proliferáciu. Táto dráha sa tiež podieľa na angiogenézu [32], [33], a hrá dôležitú úlohu pri vzniku nádorov, invázie a metastáz [34], [35]. Naša štúdia ukazuje, že RABEX-5 umlčanie vyvolá pokles expresie VEGF. Preto sme sa predpokladať, že RABEX-5 podporuje rast a metastatický schopnosť buniek karcinómu žalúdka prostredníctvom aktivácie VEGF a jeho následných signálnych dráh.

Na záver by sme dokázať, že RABEX-5 podporuje proliferáciu, tvorbu kolónií, migrácia a invázie, čo naznačuje, že RABEX-5 môže byť onkogén u karcinómu žalúdka, a jeho účinky môžu byť čiastočne sprostredkované moduláciou aktivácie VEGF. RABEX-5 preto môže predstavovať nový diagnostický a prognostický marker a nový terapeutický cieľ v rakoviny žalúdka. je potrebné vyvinúť väčšie úsilie, aby objasnila signálnych dráh vyplývajúcich z týchto biologických javov.

• Ploche ONE: Sérum OPN Expression pre identifikáciu rakoviny žalúdka a atrofickú gastritídou a jej ovplyvňujúce faktory
• Ploche ONE: CEACAM6 podporuje rakovina žalúdka invázie a metastázovaniu indukciou epitel-mezenchýme prechod cez PI3K /AKT signálnej dráhy