RABEX-5 A Guaninas-nukleotidų keitimo faktorius (PAF) už RAB-5, yra susijęs Tumorigenesis ir tam tikrų žmogaus vėžio vystymąsi. Čia mes pranešti, kad RABEX-5 skatina naviko augimą ir metastazavusiu gebėjimą skrandžio vėžio ląsteles ir in vitro parsisiųsti ir vivo nurodomoji dalis:. Wangas S Lu A Chen X Wei L Ding J (2014) RABEX-5 yra aktyvinama ir vaidina onkogeniniam vaidmuo skrandžio vėžio vystymąsi aktyvuojant VEGF signalinio kelio. PLoS ONE 9 (11): e113891. Doi: 10,1371 /journal.pone.0113891 redaktorius: Xin-juanis Guan, Honkongo universitetas, Kinija Įstojo rugsėjo 3 d 2014 m Priėmė: Balandis 31, 2014 m Paskelbta: Lapkričio 26, 2014 Visos teisės saugomos: © 2014 Wang et al., Tai atviros prieigos straipsnis platinama pagal Creative Commons Attribution licencija, kuri leidžia nevaržomai naudotis, paskirstymo ir dauginimąsi bet kokioje laikmenoje sąlygomis, su sąlyga, kad pirmasis autorius ir šaltinis įskaitomos Duomenų prieinamumas:. autoriai patvirtina, kad visi duomenys, kuriais grindžiamos išvados visiškai prieinama be apribojimų. Visi atitinkami duomenys yra per popieriaus ir jo Pagalbinė informacija failus Finansavimas:. Šie autoriai neturi paramą ar finansavimą pranešti konkuruojančių interesų. Autoriai pareiškė, kad nėra konkuruojantys interesai egzistuoja. Įvadas Nors pasaulinės sergamumas tam tikromis pasaulio regionuose mažėja, skrandžio vėžys išlieka ketvirtas didžiausias sergamumas ir antra mirtingumo tarp visų vėžio visame pasaulyje [1]. Tyrimai rodo, kad aplinkos veiksniai, pavyzdžiui, Helicobacter pylori egzocitozės būdu ir Endocitozė yra ląstelės naudojamos palaikyti normalų fiziologinį funkciją pagrindiniai procesai, o pūslelės transportas yra pagrindinė šio proceso dalis. Maži GTPases žaisti jungiklio funkciją ląstelėje molekulių ir labai svarbų vaidmenį Endocitozė ir pūslelės transporto, įskaitant ląstelių augimą, signalo perdavime, diferenciacijos ir aktino citoskeleto pastato ir daugeliu aspektų kitų ląstelinių procesų [4] reglamentą. Į Ras superfamily, yra daugiau nei 50 tipų GTPases, įskaitant Rab, kuri priklauso didžiausiai pošeimio [5]. Tyrimai parodė, kad Rab baltymų dauguma reglamen nukreipti transportą, fagocitozę ir pūslelės Prijungimas prie konkrečių membranas, o nedidelis skaičius Rab baltymų reguliuoti pūslelės jaunieji [6], [7]. Mažas GTPase RAB "-5, kuris yra platinamas plazminės membranos ir ankstyvo endosomes, yra meistras reguliatorius pradžioje endocytic prekyba [8]. Kaip ir kiti mažų GTPases RAB-5 aktyvuojamas parodo vidurkį BVP mainų su GTP, katalizuoja guanino-nukleotidų mainų veiksnių šeimos nariai [9]. RABEX-5 buvo identifikuotas kaip Rabaptin-5 sąveikautojo ir turi GEF veiklą į RAB-5 ir gretutinių GTPases. Be to, tiek RABEX-5 ir Rabaptin-5 yra būtini RAB-5 varoma endosome sintezės in vitro nurodė Naujausi tyrimai, kad RABEX-5 išraiška yra gerokai didesnis keliais vėžio, įskaitant krūties vėžio [11], prostatos vėžio [12] ir kolorektalinio vėžio [13]. Nenormalus RABEX-5 išraiška navikų rodo, kad RABEX-5 yra reikšmingas vėžio patogenezės ir progresavimo, ir gali daryti įtaką auglio biologinė elgsena. Tačiau vaidmuo ir veikimo mechanizmas RABEX-5 skrandžio vėžio kancerogenezėje ir progresavimo dar nebuvo nustatytas. Šiame tyrime mes pirmą kartą analizuojama išraišką RABEX-5 skrandžio vėžio audiniuose naudojant kiekybinį atvirkštinės transkripcijos-polimerazės grandininė reakcija (KRL-PGR) ir imunohistocheminis. Vėliau mes išnagrinėjo RABEX-5 poveikį naviko biologinės funkcijos in vitro parsisiųsti ir vivo Etika pareiškimas Visos aprašytos šiame tyrime bandymai su gyvūnais buvo patvirtinta institucinių gyvūnų priežiūrai ir naudojimui komiteto (IACUC) ne Taishan medicinos universiteto ir visų gyvūnų išliko laikantis IACUC gaires. Rinkimas ir naudojimas žmogaus mėginiai buvo patvirtintas Institucijų peržiūros valdybos Taishan medicinos universiteto ir susijusi taian Centrinė ligoninės medicinos centras, po informuotas rašytiniu sutikimu iš visų pacientų. 110 rinkinių skrandžio navikų ir greta, ne navikų audiniuose (ne mažiau kaip 5 cm nuo naviko marža) iš viso buvo gauta iš pacientų, kuriems buvo atlikta gydomoji operacija ne Taian centrinėje ligoninėje nuo 2010 sausio ir 2013 m Apėmė 27 moterų ir 83 vyrų, kurių vidutinis amžius 59,3 metų (ribos: 32-80 metų). Nė vienam pacientui gavo radioterapija ar chemoterapija prieš operaciją. Klinikos duomenys buvo renkami ir patologinis naviko stadija buvo nustatomas pagal Amerikos jungtinio komiteto vėžys (AJCC) skrandžio vėžys TNM. Histologinis rašyti atliko ne mažiau kaip dviejų ekspertų patologai, savarankiškai dirbti dvigubai aklu metodu. Tyrimas buvo patvirtintas pagal institucinius apžvalga tarybų Taishan medicinos universiteto ir kitų susijusių taian Centrinės ligoninės medicinos centras. Parašė informuotas sutikimas buvo gautas iš kiekvieno paciento prieš įtraukimo į tyrimą. Žmogaus skrandžio vėžio ląstelių linijos ir įamžino skrandžio, gleivinės epitelio ląstelių linija, GES-1 buvo įsigytas iš Šanchajaus institutai biologijos mokslų, Kinijos mokslų akademijos. Ląstelių linijos buvo nuolat išlaikoma RPMI-1640 terpėje, turinčioje 10% serumas iš veršiuko, peniciliną (100 TV /ml) ir streptomicino (100 TV /ml) 5% CO 2 atmosferoje esant 37 ° C temperatūroje. viso RNR buvo išskirta iš audinių pavyzdžius ar ląstelių linijų, naudojančių Trizol reagento (Invitrogen, JAV), pagal gamintojo instrukcijas. Atvirkštinės transkripcijos buvo atliekama naudojant 1 Įig visos RNR pagal gamintojo instrukcijas (PROMEGA, Madison, WI, JAV). PGR buvo atliekama naudojant SYBR Green reagentą (taikoma BIOSYSTEMS, CA, JAV) ir šiuos PGR pradmenis; RABEX-5 parafinas -embedded audinio skyriai iš pacientų arba nuogas pelių buvo termiškai apdoroti esant 60 ° C temperatūroje 1 h, devaškuoti ksilene, iš naujo-hidratuotas etanolyje serijos (100-50%) ir apdorojamos 0,01 mol /L citrato buferio (pH 6,0 ) antigeno išimti. Endogeninė peroksidazės aktyvumas buvo slopinamas po inkubacijos su metanolio, kuriame yra 0,3% H 2O 2 30 min. tada skyriai buvo inkubuojami su antikūnai aptikti RABEX-5 (1:50, Santa Cruz Biotechnology, JAV) arba VEGF (1:150; Ab46154, Abcam, JAV), esant 4 ° C naktį. Taip eksperimentinio procedūra buvo inkubuojami su antriniais antikūnais. Audinių dalys buvo counterstained su Mayer hematoksilinu. Skaidrės buvo nepriklausomai įvertintas dviem patologai, apakinti bet kuriam pacientui duomenis. Dažymo intensyvumas RABEX-5 pelnytas kaip 0 (dažymo), 1 (lengvas dažymo), 2 (vidutinio žyme) ar 3 (intensyvi dėmių). Dažymo plotas pelnytas kaip 0 (0%), 1 (1-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) arba 4 (76-100%), dėl procentais pagrindu teigiamai tamsintas ląsteles. Galutinis dažymo rezultatas, apskaičiuojamas kaip intensyvumas ir pratęsimo balai sumą, buvo suskirstyti į tris grupes: 0-2, neigiama išraiška; 3-4, silpnas išraiška; ir 5-6, stipri išraiška. Tikslinės triukšmo slopinimo ir RABEX-5 RABEX-5 lentiviruso trukdžių vektorius buvo įsigytas iš Šanchajaus GenePharma Co, Ltd iš RABEX-5 seka trukdžių taikymo oligo buvo 5'-GGATGCAAACTCGTGGGAA-3 ', o ne homologinis kontrolė seka buvo 5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'. SGC-7901 ir NVI-N87 ląstelės buvo padengtas į 6-duobučių lėkštelėse (5 × 10 4 ląstelių /duobutėje), auginami iki 40% santakoje ir gydomi titered virusinės centrifuguojamas esant infekcijos (moi) 10 gausa. Vakarų dėmė analizė Sveikos ląstelių baltymai buvo paimti iš ląstelių naudojant Ripa buferį, kuriame proteazės inhibitorius Kokteilių (Pierce, Rokfordas, Ilinojus, JAV). Baltymų buvo įvertintas naudojant BCA Baltymai Analizės rinkinį (Pierce). Mobilaus ryšio ekstraktai (100 ug) buvo atskirtos nuo 10% natrio dodecilsulfato poliakrilamido gelio elektroforezės, ir perkeliamas ant polivinilideno fluorido membranas. Membranos buvo užblokuotas su 5% lieso pieno Tris-buferio druskų tirpalu (TBS) ir inkubuojama su pirminių antikūnų, esant 4 ° C temperatūroje per naktį. Naudojami pirminiai antikūnai buvo triušio prieš RABEX-5 (1:200; Santa Cruz Biotechnology), triušių anti-GAPDH (1:5000; Ab9485, Abcam) ir pelės anti-VEGF (1:300; Ab46154, Abcam). Plėvės tada triskart plaunami TBS-Tween tirpalo 15 min, ir inkubuojami su antrinių antikūnų. Signalai buvo aptikta naudojant sustiprintą chemiluminescencja aptikimo sistemą (Amersham biologijos, PISCATAWAY NJ, JAV) pagal gamintojo protokolą. ląstelių proliferacija buvo matuojamas naudojant Mobilusis Skaičiavimo Kit -8 (CCK-8; Dojindo laboratorijos, Kumamoto, Japonija). SGC-7901 arba NVI-N87 ląstelės buvo pasėjamos į 96-duobučių lėkštelėse (1,5 × 10 3 ląstelių /gerai) ir inkubuojama įvairių laiko momentų (24, 48, 72, 96 ir 120 val). tada auginimo terpė buvo pašalintas ir pakeistas su 200 pL RPMI-1640 terpėje, turinčioje 10% FBS ir 20 pL CCK-8 ir plokštelės buvo inkubuojami 37 ° C temperatūroje 3 val. Optinių buvo matuojamas 450 nm, naudojant Safire2 microplate skaitytuvą. RPMI-1640 terpė su 10% FBS ir CCK-8 buvo naudojamas kaip kontroliuoti. Ląstelės buvo pasėjamos į 6-duobučių lėkštelėse (1 × 10 3 ląstelių /gerai) ir kultūros terpė buvo keičiami kas 3-4 dienas. Po 14 dienų kultūrą, mobilieji kolonijos buvo nustatytos su 4% paraformaldehido 10 min, tamsintas su 0,1% violetinei 20 min, ir fotografuojami. Kolonijos su daugiau nei 50 ląstelių buvo skaičiuojami kiekvienoje brūkšnys. SGC-7901 /KD, NVI-N87 /KD ląstelių ir kontrolinių ląstelių buvo surinkti ir ląstelės ciklo ir apoptozė buvo įvertintas tėkmės citometrijos metodą. Už ląstelių ciklo analizės, ląstelės buvo nustatyti su 75% etanolio ir saugomi 4 ° C temperatūroje per naktį. Kitą dieną, fiksuotos ląstelės buvo išplauti su PBS, veikiama RNaze A (50 mikrogramų /ml) ir nudažomi su propidiumo jodido (PI) (50 mikrogramų /ml) 30 min tamsoje. Tamsintas ląstelės buvo analizuojami tėkmės citometrijos (FACSCalibur, Becton Dickinson-). apoptozė analizės, An aneksinu-APC Apoptozę aptikimas komplektas I (BD Pharmingen, JAV) buvo naudojama pagal gamintojo instrukcijas. VšĮ ir aneksinu-APC dvigubo dažymo buvo atlikta ir ląstelės buvo analizuojami tėkmės citometrijos (FACSCalibur, Becton Dickinson-), naudojant Mobilusis Quest programinę įrangą ( "Becton Dickinson-). Aneksinu-APC-teigiamas ir PI neigiami ląstelės buvo apibrėžiamas kaip vyksta apoptozė. Visi eksperimentai buvo atliekami trimis egzemplioriais ir vidutinėmis vertėmis, šių grupių buvo skaičiuojamas. migracijos tyrimus, yra 1 × 10 5 ląstelės buvo sustabdytas serum- nemokama RPMI-1640 ir vidutinės padengtą ant kamerų, kurios nebuvo padengtos Matrigel (Corning costar, NY, JAV). Dėl invazijos metodu, viršutinė kamera buvo precoated su Matrigel (BD biologijos mokslų, CA, JAV) pagal gamintojo protokolai ir 1 × 10 5 ląstelės serumo neturinčioje RPMI-1640 terpėje buvo įtraukta į kamerą. Už abu tyrimai, terpę, turinčią 10% FBS buvo įtraukta į apatinę kamerą kaip chemoattractant. Po to, kai 24 h kultūros, kameros buvo tamsintas su 0,5% metilvioletinio tirpalo 15 min, ir panardintas tirpalo fosfato buferio druskų tirpalo (PBS) 10 min. Ląstelės apatinę kamerą vėliau buvo skaičiuojami pagal apversto mikroskopu. Vertės išreiškiamos kaip vidutinis ląstelių skaičių iš penkių atsitiktinių matymo laukais (200 ×). Ląstelės buvo pasėjamos į 6-duobučių lėkštelėse ir kultūringas, kol jie pasiekė santakoje. Žaizdos buvo subraižyti nuo ląstelių monosluoksnio 20-iL pipetės antgalius. Lėkštės vieną kartą plaunami šviežią terpę pašalinti ne prilipusios ląsteles po kultūros ląstelių 0 arba 48 h (vidutinis be serumas iš veršiuko) ir fotografavo. Keturių week- Maschio BALB /c nude pelėms buvo įsigytas iš zoologijos instituto Kinijos mokslų akademijos Šanchajuje. Gyvūnai buvo laikomi narvuose su medienos drožlių kraiką į kontroliuojamos temperatūros patalpoje (68-72 ° F) su 12-h šviesos ir tamsos ciklo ir 45-55% santykinei drėgmei ir buvo leidžiama laisvai patekti į mitybą ir geriamojo vandens. Trumpai tariant, Tarybos generalinis sekretoriatas-7901 /KD ar SGC-7901 /NC ląstelės buvo tripsinizuojamos ir sumaišymo PBS (pH 7,4), injekcinis į vieną pele, bendro tūrio 100 ul. Ląstelių suspensija (1 × 10 6 ląstelių) buvo švirkščiamas į dešinio krašto pelių. Naviko dydis buvo matuojamas ribų kas 3 dienas naudojant Slankmatis, ir naviko tūris buvo apskaičiuotas naudojant formulę: ilgis (mm) x plotis 2 (mm) × 0,52. Norėdami pagerinti bet kokį pastebėtą šių eksperimentinių tyrimų metu pelių kančias, pelėms buvo numarinti pagal CO 2 inhaliacijos apie 28 dieną po injekciją į pilvą, ir augliai buvo sveriami po skrodimo. Mėginiai buvo laikomi skystame azote už KRL-PCR arba nustatyti 4% formalinu gauti parafine esančio skyrius. Visos procedūros buvo atliktos atsižvelgiant į gyvūnų priežiūrai ir naudojimui gairių dėl Taišanas medicinos universiteto Gyvūnų priežiūros komiteto patvirtintų. Duomenų atstovauja kaip vidurkis ± standartinis nuokrypis (SD). Statistinių skirtumų tarp šių dviejų grupių buvo išnagrinėti Studento , T Rezultatai RABEX-5 išraiška yra aktyvinama visų. skrandžio vėžio audiniuose ir RABEX-5 downregulation iš RABEX-5 slopina skrandžio vėžio ląstelių proliferacija ir kolonija formavimas kitas tyrė RABEX-5 išraišką skrandžio ląstelių linijų ir ne tik vėžio ląstelių linijos , GES-1, kurią Vakarų dėmė analizė. RABEX-5 buvo išreikštas visų ląstelių linijų išbandytų, ir buvo ypač didelis SGC-7901 ir NVI-N87 ląstelių (Pav. 2a). Ištirti RABEX-5 funkcijas skrandžio vėžio ląstelių linijas, mes atliekame skirta triuškinantis iš RABEX-5 aukšto išreikšti ląstelių linijų, SGC-7901 ir NVI-N87. RABEX-5 išraiška buvo žymiai sumažėjo SGC-7901 /KD ir NVI-N87 /KD ląstelių, lyginant su kontrolinės ląstelių (2b pav.). Pirma, mes išnagrinėjo praradimo RABEX-5 poveikį skrandžio vėžio ląstelių augimą. Po 5 dienų kultūra, augimo tempas SGC-7901 /KD ir NVI-N87 /KD ląstelių buvo gerokai lėtesnis nei kontrolinės grupės (2c pav.). Mes taip pat patvirtino šias pastabas kolonija formavimo tyrimais. Colony skaičiai buvo žymiai sumažintas SGC-7901 /KD ląstelių ir NVI-N87 /KD ląstelių, lyginant su kontrolinės ląstelių (. 2D pav) ir mes nustatėme, kad kolonija dydis taip pat buvo mažesnis eksperimentinių grupių, lyginant su kontroline grupe. Šie duomenys rodo, kad downregulation iš RABEX-5 slopina skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją. pastebėtus poveikio RABEX-5 nokdaunas ant ląstelių augimą gali būti dėl pokyčių ląstelės ciklo progresavimo ir apoptozės. Todėl išnagrinėjo RABEX-5 nuslopinami poveikį ląstelės ciklo ir apoptozės in vitro Jei ištirti RABEX-5 įtakos migracijos ir invazija, kitą kartą atlikta transwell migracijos ir invazija tyrimų. Downregulation iš RABEX-5 nutylėtų ląstelių migracijos (SGC-7901 /KD Group, 121.3 ± 6.1 ląstelių /laukas; SGC-7901 /AP grupė, 261,0 ± 10,5 ląstelių /laukas; NVI-N87 /KD Group, 108,7 ± 6,1 ląstelių /laukas; NVI-N87 /AP grupė, 241,7 ± 10,6 ląstelių /laukas P Jei ištirti RABEX-5 poveikį motorikai.. ir žaizdų gijimas, mes taip pat atlikti žaizdų gijimo tyrimų. Matėme, kad atstumas tarp žaizdos kraštų SGC-7901 /KD ir NVI-N87 /KD ląstelių buvo žymiai ilgiau nei SGC-7901 /NC ar NVI-N87 /NC ląstelių (pav. 4e). Pagal šias pastabas, lygiai VEGF buvo downregulated tiek mRNR ir baltymų kiekiai SGC-7901 /KD ląstelių (4f G pav.). remiantis in vitro, aprašyta aukščiau Diskusijos Nors ankstesni tyrimai parodė, kad RABEX-5 vaidina svarbų vaidmenį tumorigenezei kelių tipų vėžio [11]. - [14], nebuvo ištirtas jo vaidmuo skrandžio vėžio. Šioje studijoje, mes nustatėme, kad RABEX-5 išraiška yra gerokai aktyvinama skrandžio vėžio audiniuose palyginti su gretimuose normaliuose audiniuose, nurodant, kad RABEX-5 gali prisidėti prie skrandžio vėžio Tumorigenesis. Be to, iš RABEX-5 išraiška buvo reikšmingai susijęs su naviko dydžio ir limfmazgių metastazių. Priešingai, nebuvo jokių reikšmingų koreliacijų tarp nenormalaus RABEX-5 saviraiškos ir lyties, amžiaus ar naviko vietą. Tai pirmasis tyrimas, išsiaiškinti klinikos reikšmę RABEX-5 išraiškos pacientams, sergantiems skrandžio vėžiu. Jei ištirti RABEX-5 vaidmenį navikų skatinimo, kitą kartą atlikta daug nuostolių funkcija analizės RABEX- 5 aukštas ekspresija ląstelių linijas, SGC-7901 ir NVI-N87. Sėkmingas slopinimas RABEX-5 išraiška buvo pasiekta RNAi technologijų ir nokdaunas buvo patvirtinta Vakarų dėmė. Mūsų tyrimai parodė, kad ląstelių proliferacija buvo žymiai sumažėjo SGC-7901 /KD ir NVI-N87 /KD ląstelių ir panašūs rezultatai buvo gauti kolonija formavimo tyrimais. Svarbu tai, kad , in vivo Ankstesni tyrimai parodė, kad RABEX-5 gali specialiai jungiasi prie aktyvios formos RAB- 5, tokiu būdu reguliuojant jungiamojo ir sintezės endosomal membranų, kad endosomes ir ląstelėje signalo perdavime [15] motoriką. RAB-5 baltymų išraiška buvo susijęs su įvairių piktybinių navikų [16] plėtros - [18] ir yra pajėgus skatinti migracijos auglio ląstelių [19], [20]. Angiogenezę vaidina svarbų vaidmenį Tumorigenesis [21], ir reglamentuoja keleto veiksnių, tokių kaip trombocitų kilmės augimo faktoriaus (PDGF) ir kraujagyslių endotelio augimo faktoriaus (VEGF) [22]. PI3K /Akt signalinio kelio gali būti reguliuojamas tiek VEGF ir PDGF. Pavyzdžiui, VEGF pagerina neuroblastoma platinimu aktyvuojant PI3K /Akt signalizacijos [23]. Be to, tyrimai parodė, kad PDGF gali paveikti migracijos galimybę ląstelių per PI3K /AKT kelyje [24]. Aktyvinimas PI3K /Akt signalizacijos gali slopinti ląstelių apoptozę sukeltas įvairių dirgiklių [25] - [29], ir skatinti ląstelinį ciklą [30], [31], taip skatinant ląstelių išgyvenimą ir platinimu. Ši stažuotė taip pat dalyvauja angiogenezę [32], [33], ir vaidina svarbų vaidmenį navikų susidarymo, invazija ir metastazių [34], [35]. Mūsų tyrimas rodo, kad RABEX-5 slopinimo sukelia į VEGF išraiškos sumažėjimą. Taigi, mes iškėlė hipotezę, kad RABEX-5 skatina augimą ir metastazavusiu gebėjimą skrandžio vėžio ląsteles per aktyvavimo VEGF ir jos paskesnių signalizacijos būdus. Taigi, mes įrodyti, kad RABEX-5 skatina proliferaciją, kolonijų susidarymą, migracijos ir invazijos, tai rodo, kad RABEX-5 gali būti skrandžio vėžio onkogeno, ir jo poveikis gali būti iš dalies tarpininkaujant moduliavimu, VEGF aktyvacijos. Todėl RABEX-5 gali atstovauti naują diagnostinį ir prognostinę žymeklį ir naujoviška gydomąjį tikslą skrandžio vėžio. Reikėtų dėti daugiau pastangų išsiaiškinti signalo perdavimo kelių pagrindinių šie biologiniai reiškiniai.
. Išraiška RABEX-5 yra žymiai didesnis skrandžio vėžio audiniuose ir yra susijęs su naviko dydžio ir limfmazgių metastazių. Be to, tikslingai nutildymo iš RABEX-5 sumažėjusio skrandžio vėžio ląstelių proliferaciją ir "Colony formavimas in vitro pervežimas sukuriant G0 /G1 fazės arešto indukcijos, ir skatino skrandžio vėžio ląstelių apoptozę. Nokdaunas iš RABEX-5 slopina žaizdų gijimą, migracijos ir invazinių gebėjimų skrandžio vėžio ląsteles. Rezultatų , in vivo
bandymai su gyvūnais, taip pat atitiko šių vitro
išvadas. Triukšmo slopinimo ir RABEX-5 lėmė sumažėjęs išraišką VEGF. Šie rezultatai rodo, kad RABEX-5 yra aktyvinama ir vaidina onkogeninio vaidmenį skrandžio vėžio išsivystymo aktyvuojant VEGF signalizacijos kelią
infekcijos, rūkymas ir dietos, gali vaidinti svarbų vaidmenį skrandžio vėžio [2] kūrimą. Jaunesniųjų skrandžio vėžys yra dažniausiai besimptomė arba susijęs su nespecifinių simptomų, pavyzdžiui, dispepsija, o iki to laiko, simptomų, ji dažnai pažengus į priekį. Nepaisant bendro naudojimo multimodalinio terapija (chemoterapija, radiacija ir chirurgija), 5 metų išgyvenamumas pacientų išlieka žemas, 20-40% [3]. Nors tyrimai skrandžio vėžio padarė didelę pažangą, molekulinius mechanizmus pagrindinės skrandžio vėžio vystymąsi lieka nepilnai suprastas.
[10].
. Mūsų rezultatai rodo, kad RABEX-5 ekspresija ir vaidina onkogeninio vaidmenį skrandžio vėžio.
Medžiagos ir metodai
Pacientai ir audinių mėginiai
Mobilaus ryšio linijų ir auginimo sąlygos
iš viso RNR išskyrimas ir KRL-PGR
(pirmyn) 5'-TTGGACAGATGGAATTGCAA-3 "ir (reversas) 5'-GTTGCAGTGGTGGAGGAAGT-3"; VEGF
(pirmyn) 5'-CTGTACCTCCACCATGCCAAGT-3 "ir (reversas) 5'-CTTCGCTGGTAGACATCCATGA-3" ir GAPDH
(pirmyn) 5'-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3 "ir (reversas) 5'-GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3 '. PGR reakcijos buvo atliktas su pradiniu denatūruojant 95 ° C temperatūroje 2 min, o po to 30 ciklų 94 ° C temperatūroje 30 S, 55 ° C temperatūroje 30 s ir 72 ° C temperatūroje 30 s, su paskutinį kartą pratęsti 72 ° C 10 min. GAPDH
buvo naudojamas kaip vidaus kontrolės ir visų reakcijos buvo pakartotas tris kartus. Į santykinė išraiška santykis RABEX-5
kiekvieno prijungto naviko ne naviko audinio mėginio buvo apskaičiuotas naudojant 2 -ΔΔCt metodas.
imunohistocheminis
ląstelių proliferacija tyrimas
kolonija formavimas tyrimas
analizė ląstelės ciklo ir apoptozė
Transwell migracija ir invazija tyrimas
Žaizdų gijimo tyrimas
ksenografiniuose modelis
Statistinė analizė
-test. Koreliacija tarp RABEX-5 išraiškos skrandžio vėžio audiniuose ir klinikos parametrų buvo analizuojami chi kvadrato ar Fisher'io bandymus. P
< 0,05 buvo laikomas svarbiu, ir P
< 0,01 buvo laikomas labai reikšmingas
buvo nagrinėjama skrandžio vėžio ir gretimų ne navikų audiniuose, atliekant KRL-PGR išraiška. Mes pastebėta žymiai didesnę raišką RABEX-5 pervežimas mRNR skrandžio vėžio audiniuose, palyginti su atitinkamomis ne navikų audiniuose ( P
. ≪ 0,01, pav 1A). Šie rezultatai buvo patvirtinta per baltymų lygiu imunohistocheminį dažymo (pav. 1B, C, D, E). RABEX-5 išraiška buvo daugiausia lokalizuotas vėžinių ląstelių citoplazmoje. RABEX-5 buvo aktyvinama į 61,8% (68/110) skrandžio vėžiu sergantiems pacientams. Mes šalia tyrė tarp RABEX-5 saviraiškos ir clinicopathologic bruožų skrandžio vėžio ryšį. Ląstelę RABEX-5 buvo susijęs su naviko dydį ( P
= 0,035) ir limfmazgių metastazių ( P
= 0,006), bet ne su kitais klinikos veiksnių, įskaitant lytį, amžių ar naviko vietą (1 lentelė).
downregulation iš RABEX-5 skatina apoptozę skrandžio vėžio ląsteles ir skatina G0 /G1 ląstelės ciklo suėmimą
, naudojant tėkmės citometrijos. Tėkmės citometrijos analizė parodė, kad ląstelių dalis į G0 /G1 fazės SGC-7901 /KD ar NVI-N87 /KD ląstelės buvo didesnis nei SGC-7901 /NC ar NVI-N87 /NC kontrolinių grupių, o procentais ląstelės G2 /M etapas buvo žymiai sumažėjo, palyginti su kontroline grupe (pav. 3A, B). Mes taip pat pastebėjo didelį poveikį apoptozės į skirtingai gydomų grupių (pav. 3C, D), su downregulation iš RABEX-5 išraiška, sukelianti skrandžio vėžio ląstelių apoptozės padidėjimas.
downregulation iš RABEX-5 slopina migracija , invazija ir žaizdų gijimo gebėjimas skrandžio vėžio ląstelių
. < 0,05) (pav 4A, C). Panašūs rezultatai buvo pastebėtas transwell invazija tyrimai (SGC-7901 /KD grupės, 76,3 ± 6,1 ląstelių /srityje; SGC-7901 /NC grupę, 108,7 ± 6,0 ląstelių /srityje; NVI-N87 /KD Group, 60,7 ± 6,0 ląstelių /lauko; NVI-N87 /AP grupė, 119,0 ± 8,5 ląstelių /srityje; p
< 0,05) (pav 4B, D),
Triukšmo slopinimo ir RABEX-5 slopina skrandžio vėžio augimo in vivo
išvados, kitą kartą išnagrinėjo RABEX-5 nuslopinami poveikį naviko augimui in vivo, pervežimas įpurškiant SGC7901 /KD ar SGC7901 /NC ląstelės po oda į dešinio krašto regionuose nuogas pelėmis. Naviko dydis buvo stebimi kas 3 dienas su slankmačiu. Naviko tūris buvo gerokai sumažintas pelėms 2 savaites po injekcijos SGC-7901 /KD ląstelių, lyginant su kontrolinių ląstelių ( P
< 0,05; pav. 5A). Navikas tūris audiniuose, kilęs iš SGC-7901 /KD grupėje buvo panašus į tą, iš SGC-7901 /NC grupės, eksponuoti žymų sumažėjimą naviko tūrio 4 savaites po skiepijimo naviko ląstelių ( P
< 0,05, pav. 5B, C). Be to, navikai, gautų iš SGC-7901 /KD ląstelių svoris buvo žymiai mažesnis nei kontrolės ( P
< 0,05; pav. 5d). Mes šalia išnagrinėjo VEGF išraišką transplantacija navikų mėginiuose atliekant KRL-PGR ir imunohistocheminiu. Kaip parodyta Fig. 5E ir 5F, lygiai VEGF mRNR ir baltymų buvo sumažėjo SGC-7901 /KD grupėje, palyginti su SGC-7901 /NC kontrolę. Tai in vivo
duomenys sutaptų su mūsų vitro
pastabas ir patvirtina, kad RABEX-5 slopina skrandžio vėžio augimą ir progresavimą, keičiant VEGF transkripcijos veiklą nutildymo. Apibendrinant galima teigti, RABEX-5 atlieka onkogeninio vaidmenį skrandžio vėžio
ksenografiniuose modeliai palaiko šiuos vitro
pastabas. Tai fenotipas gali būti sukeltas RABEX-5 reglamentuojantį konkrečius genus ir signalizacijos kelius, taip darydami poveikį ląstelių ciklą ir apoptozę. Be transwell tyrimų, mažiau SGC-7901 /KD ir NVI-N87 /KD ląstelės migravo į apatinę kamerą negu kontrolinių ląstelių, o tai rodo, kad RABEX-5 skatina migraciją ir invazija skrandžio vėžio ląsteles. Žaizdų gijimas taip pat buvo reikšmingai sumažėjo po nuslopinami iš RABEX-5. Šie rezultatai patikrinti svarbų RABEX-5 skrandžio vėžio ląstelių augimą ir metastazavusiu elgesį. Tačiau tiksli molekulinės mechanizmas, pagal kurį RABEX-5 daro tokį poveikį lieka nežinoma, nes tyrimų su RABEX-5 yra ribotos.