RABEX-5, en guanin-nukleotid utbyte faktor (GEF) för RAB-5, är inblandad i tumorigenes och i utvecklingen av vissa humana cancerformer. Här rapporterar vi att RABEX-5 främjar tumörtillväxt och metastatisk förmåga gastric cancerceller både In vitro Mössor och In vivo Citation:. Wang S, Lu A, Chen X, Wei L, Ding J (2014) RABEX-5 uppregleras och spelar en onkogen roll i Gastric cancerutveckling genom att aktivera VEGF signalväg. PLoS ONE 9 (11): e113891. doi: 10.1371 /journal.pone.0113891 Redaktör: Xin Yuan Guan, University of Hong Kong, Kina Mottagna: 3 september 2014. Accepteras: 31 oktober 2014; Publicerad: 26 november 2014 Copyright: © 2014 Wang et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit datatillgänglighet. Det författarna bekräftar att all data som ligger till grund resultaten är helt utan begränsning. Alla relevanta uppgifter finns inom pappers- och dess stödjande information filer Finansiering:. Dessa författare har inget stöd eller finansiering för att rapportera Konkurrerande intressen. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns. Inledning Trots en nedgång i den globala förekomsten i vissa regioner i världen, förblir magcancer den fjärde högsta i förekomst och andra i dödlighet bland alla cancerformer i världen [1]. Studier visar att miljöfaktorer, såsom Helicobacter pylori Exocytos och endocytos är viktiga processer som används av celler för att upprätthålla normal fysiologisk funktion, och vesikler transporter är en kärna en del av denna process. Små GTPaser spelar en switch funktion i intracellulära molekyler och en mycket viktig roll i endocytos och vesikler transporter, inklusive reglering av celltillväxt, signaltransduktion, differentiering och aktin cytoskelettet byggnad och många aspekter av andra cellulära processer [4]. I Ras super, det finns mer än 50 typer av GTPaser, inklusive Rab, som tillhör den största underfamiljen [5]. Studier har visat att majoriteten av Rab proteinerna reglerar inriktning transport, fagocytos, och vesikel dockning till specifika membran, medan ett litet antal Rab proteiner reglerar vesikel spirande [6], [7]. Den lilla GTPas RAB-5, som distribueras i plasmamembranet och tidiga endosomer, är en mästare regulator av tidig endocytiska handel [8]. Liksom andra små GTPaser är RAB-5 aktiveras genom ett utbyte av bundet BNP med GTP, katalyseras av en familj av guanin-nukleotid utbyte faktorer [9]. RABEX-5 identifierades som en Interactor av Rabaptin-5 och har GEF aktivitet mot RAB-5 och relaterade GTPaser. Likaså både RABEX-5 och Rabaptin-5 är nödvändiga för RAB-5-driven endosomen fusion In vitro Nya studier har visat att RABEX-5 uttryck är betydligt högre i flera cancerformer, bland annat bröstcancer [11], prostatacancer [12] och kolorektal cancer [13]. Onormal RABEX-5 uttryck i tumörer antyder att RABEX-5 är betydande i cancer patogenes och progression, och kan påverka tumör biologiska beteende. Men roll och verkningsmekanismen för RABEX-5 i magcancer cancer och progression har ännu inte fastställts. I denna studie, först analyserade vi uttryck av RABEX-5 i magcancer vävnader med hjälp av kvantitativ omvänd transkriptionspolymeraskedjereaktion (QRT-PCR) och immunohistokemi. Därefter undersökte vi effekterna av RABEX-5 på tumör biologisk funktion In vitro Mössor och In vivo Etik Statement Alla djurförsök som beskrivs i denna studie godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid Taishan Medical University och alla djur hölls i enlighet med IACUC riktlinjer. Insamling och användning av mänskliga prov godkändes av Institutional Review Board i Taishan Medical University och anslutna Taian Central Hospital Medical Center, efter informerat skriftligt medgivande från alla patienter. En totalt 110 uppsättningar av gastriska tumörer och angränsande, icke-tumörvävnader (åtminstone 5 cm från tumören marginal) erhölls från patienter som genomgick kurativ kirurgi vid Taian centralsjukhuset mellan januari 2010 och december 2013. Dessa omfattade 27 kvinnor och 83 män med en medelålder på 59,3 år (intervall: 32-80 år). Inga patienter hade fått radioterapi eller kemoterapi före operation. Kliniskt patologiska uppgifterna samlades in och patologisk tumörstadieindelning bestämdes enligt den amerikanska kommittén för cancer (AJCC) magcancer TNM. Histologisk typning utfördes av minst två expert patologer, arbeta självständigt i en dubbel-blind sätt. Studien godkändes av Institutional Review Boards of Taishan Medical University och anslutna Taian Central Hospital Medical Center. Skriftligt informerat samtycke erhölls från varje patient före inskrivning i studien. Mänskliga gastric cancercellinjer och förevigade gastric, mucosal epitelceller linje, GES-1 , köptes från Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences. Cellinjer hölls rutinmässigt i RPMI-1640-medium innehållande 10% kalvserum, penicillin (100 lU /ml) och streptomycin (100 lU /ml) i en 5% CO 2 atmosfär vid 37 ° C. Total RNA-isolering och QRT-PCR Total RNA extraherades från vävnadsprover eller cellinjer med användning av Trizol-reagens (Invitrogen, USA), enligt tillverkarens instruktioner. Omvänd transkription utfördes med användning av 1 pg av totalt RNA i enlighet med tillverkarens instruktioner (Promega, Madison, WI, USA). PCR utfördes med användning av SYBR Green reagens (Applied Biosystems, CA, USA) och följande PCR-primers; RABEX-5 Paraffin -embedded vävnadssnitt från patienter eller nakna möss värmebehandlades vid 60 ° C under 1 h, awaxas i xylen, re-hydratiserades i en etanolserie (från 100 till 50%) och behandlades i 0,01 mol /L citrat-buffert (pH 6,0 ) för antigenåtervinning. Endogen peroxidasaktivitet var inhiberad efter inkubering med metanol innehållande 0,3% H 2O 2 i 30 min. Sektioner inkuberades sedan med antikroppar detektera RABEX-5 (01:50, Santa Cruz Biotechnology, USA) eller VEGF (1:150; Ab46154, Abcam, USA) vid 4 ° C över natten. Följande experimentella förfarande inkuberades med den sekundära antikroppen. Vävnadssnitt motfärgades med Mayers hematoxylin. Glasen oberoende utvärderats av två patologer, förblindade eventuella patientuppgifter. Färgningsintensiteten för RABEX-5 poängsattes som 0 (ingen färgning), 1 (mild färgning), 2 (måttlig färgning) eller 3 (intensiv färgning). Färgning område poängsattes som 0 (0%), 1 (1-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) eller fyra (76-100%), på basis av den procentandel av positivt färgade celler. Den slutliga färgning poäng, beräknat som summan av intensitet och förlängnings poäng, delades in i tre grupper enligt följande: 0-2, negativ uttryck; 3-4, svagt uttryck; och 5-6, starkt uttryck. Riktad tysta RABEX-5 RABEX-5 Lentiviral störningsvektor köptes från Shanghai GenePharma Co., Ltd. Sekvensen för RABEX-5 interferens targeting oligo var 5'-GGATGCAAACTCGTGGGAA-3 ', medan den icke-homologa kontrollsekvens var 5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'. SGC-7901 och NCI-N87-celler ströks ut i 6-brunnsplattor (5 x 10 4 celler /brunn), som odlas till 40% konfluens och behandlades med titrerades viral supernatant vid en infektionsmultiplicitet (moi) av 10. Western blot-analys Hela cellproteiner extraherades från celler med hjälp av RIPA-buffert innehållande Protease Inhibitor Cocktail (Pierce, Rockford, IL, USA). Protein kvantifierades med användning av en BCA Protein Assay Kit (Pierce). Cellextrakt (100 pg) separerades genom 10% natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gelelektrofores, och överfördes på polyvinylidenfluorid-membran. Membranen blockerades med 5% fettfri mjölk i Tris-buffrad saltlösning (TBS) och inkuberades med primära antikroppar vid 4 ° C över natten. De primära antikropparna som användes var kaninanti-RABEX-5 (1:200, Santa Cruz Biotechnology), kanin anti-GAPDH (1:5000, Ab9485, Abcam) och mus anti-VEGF (1:300, Ab46154, Abcam). Membranen tvättades sedan tre gånger i TBS-Tween-lösning under 15 min och inkuberades med sekundära antikroppar. Signaler detekterades med användning av en förbättrad detektions kemiluminescens (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, USA) i enlighet med tillverkarens protokoll. Cellproliferation mättes med användning av en cellräkning Kit -8 (CCK-8, Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japan). SGC-7901 eller NCI-N87-celler såddes i 96-brunnars plattor (1,5 x 10 3 celler /brunn) och inkuberades under olika tidpunkter (24, 48, 72, 96 och 120 h). Tillväxtmedium avlägsnades sedan och ersattes med 200 pl RPMI-1640-medium innehållande 10% FBS och 20
. Expression av RABEX-5 är signifikant högre i gastriska cancervävnader och är associerad med tumörstorlek och lymfkörtel metastas. Dessutom riktade tysta RABEX-5 reducerad magcancer celltillväxt och kolonibildning In vitro
via induktion av en G0 /G1-fasen stillestånd, och stimulerade magcancer cell apoptos. Knockdown av RABEX-5 också hämmade sårläkning, migration och de invasiva förmåga gastric cancerceller. Resultaten av In vivo
djurförsök var också i linje med dessa in vitro
resultat. Tysta RABEX-5 ledde till minskat uttryck av VEGF. Dessa resultat indikerar att RABEX-5 uppregleras och spelar en onkogen roll vid gastrisk cancerutveckling genom att aktivera VEGF-signaleringsvägen
infektion, rökning och kost, kan spela en viktig roll i gastric utveckling [2] cancer. Tidigt stadium magcancer är vanligtvis asymtomatisk eller associerade med ospecifika symtom såsom dyspepsi, och när symtom uppträder, har det ofta nått ett långt framskridet stadium. Trots den allmänna användningen av multimodal terapi (kemoterapi, strålning och kirurgi), förblir 5-års överlevnad av patienter med låg, vid 20-40% [3]. Även forskning i magsäckscancer har gjort stora framsteg, förblir de molekylära mekanismer som ligger bakom utvecklingen av magcancer ofullständigt känd.
[10].
. Våra resultat visar att RABEX-5 är överuttryckt och spelar en onkogen roll i magcancer.
Material och metoder
Patienter och vävnadsprover
Cellinjer och odlingsbetingelser
(framåt) 5'-TTGGACAGATGGAATTGCAA-3 'och (bakåt) 5'-GTTGCAGTGGTGGAGGAAGT-3'; VEGF
(framåt) 5'-CTGTACCTCCACCATGCCAAGT-3 'och (bakåt) 5'-CTTCGCTGGTAGACATCCATGA-3 "och GAPDH
(framåt) 5'-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3' och (bakåt) 5'-GTAGCCCAGGATGCCCTTGA-3 '. PCR-reaktioner utfördes med en initial denaturering vid 95 ° C under 2 min, följt av 30 cykler av 94 ° C under 30 s, 55 ° C under 30 s och 72 ° C i 30 s, med en slutlig förlängning vid 72 ° C under 10 min. GAPDH
användes som en intern kontroll och alla reaktioner utfördes i tre exemplar. De relativa uttrycksförhållanden av RABEX-5
i varje parad tumör till icke-tumörvävnadsprov beräknades med hjälp av två -ΔΔCt metod.
Immunohistokemi
cellprolifereringsanalys
Män som äter yoghurt två gånger i veckan är mindre benägna att utveckla tarmcancer
Ungt blod återställer vitalitet hos äldre
Perfectus Biomed ställer ut på IPS -konferensen i Liverpool
Tarmhöjande mat kan sätta stopp för undernäring i barndomen över hela världen
Vad kan forntida avföring berätta om utvecklingen av människans tarmmikrobiom?
Stor studie visar att SARS-CoV-2-virusbelastningen är lägst hos barn
Forskare löser mystiskt fall av auto bryggeris syndrom
Forskare i Kina har gjort en viktig upptäckt som förklarar det förvirrande fallet med en 27-årig man som hade en historia av att bli berusad utan att faktiskt dricka alkohol. De fann att ett överflö
Genetiskt justerade tarmbakterier minskar risken för kolorektal cancer hos möss, finner studie
Forskare har funnit att redigering av generna hos de bakterier som finns i tarmarna hos möss kan hjälpa till att minska inflammationen och därmed förenad risk för kolorektal cancer. Forskningen från U
Kost och näring påverkar mikrobiom i tarmslemhinnan
Kost är viktigt för att upprätthålla människors hälsa, men dess bakomliggande mekanism är ännu inte helt förstådd. Nu, ett team av forskare belyser sambandet mellan kost och hälsa, och det har något a