Rabex-5, un facteur d'échange guanine-nucléotide (FEM) pour RAB-5, est impliquée dans la tumorigenèse et dans le développement de certains cancers humains. Ici, nous déclarons que Rabex-5 favorise la croissance de la tumeur et la capacité métastatique des cellules de cancer gastrique à la fois in vitro Citation:. Wang S, Lu A, Chen X, Wei L, Ding J (2014) Rabex-5 est régulée positivement et joue un rôle oncogène dans gastrique de développement du cancer par activation de la voie de signalisation du VEGF. PLoS ONE 9 (11): e113891. doi: 10.1371 /journal.pone.0113891 Editeur: Xin-Yuan Guan, l'Université de Hong Kong, la Chine Reçu: 3 Septembre 2014; Accepté le 31 Octobre 2014; Publié le 26 Novembre, 2014 Droit d'auteur: © 2014 Wang et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités Disponibilité des données:. La auteurs confirment que toutes les données sous-jacentes les résultats sont entièrement disponibles sans restriction. Toutes les données pertinentes sont dans le ses fichiers de renseignements à l'appui du papier et Financement:. Ces auteurs ont pas de soutien ou de financement pour signaler Intérêts concurrents:. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent. introduction Malgré une baisse de l'incidence mondiale dans certaines régions du monde, le cancer gastrique reste au quatrième rang de l'incidence et la deuxième de la mortalité parmi tous les cancers dans le monde [1]. Des études indiquent que les facteurs environnementaux, tels que l'infection, le tabagisme et l'alimentation exocytose et l'endocytose sont des processus clés utilisés par les cellules pour maintenir une fonction physiologique normale, et le transport vésiculaire est un noyau une partie de ce processus. Les petites GTPases jouent une fonction de commutation dans les molécules intracellulaires et un rôle très important dans l'endocytose et le transport vésiculaire, y compris la régulation de la croissance cellulaire, la transduction du signal, le renforcement de la différenciation et le cytosquelette d'actine et de nombreux aspects des autres processus cellulaires [4]. Dans la superfamille Ras, il y a plus de 50 types de GTPases, y compris Rab, qui appartient à la plus grande sous-famille [5]. Des études ont montré que la majorité des protéines Rab réglementant les transports de ciblage, la phagocytose et la vésicule amarrage à des membranes spécifiques, tandis qu'un petit nombre de protéines Rab réguler la vésicule naissante [6], [7]. La petite GTPase RAB-5, qui est distribué dans la membrane plasmique et endosomes précoces, est un maître régulateur du trafic endocytose précoce [8]. Comme d'autres petites GTPases, RAB-5 est activé par un échange de GDP lié avec GTP, catalysée par une famille de facteurs d'échange guanine-nucléotide [9]. Rabex-5 a été identifié comme étant un interacteur de Rabaptin-5 et possède une activité FEM en direction RAB-5 et GTPases connexes. De même, à la fois Rabex-5 et Rabaptin-5 sont nécessaires pour conduit RAB-5-endosome fusion in vitro Des études récentes ont indiqué que Rabex-5 expression est significativement plus élevée dans plusieurs cancers, notamment le cancer du sein [11], le cancer de la prostate [12] et le cancer colorectal [13]. Abnormal Rabex-5 expression dans les tumeurs suggère que Rabex-5 est significatif dans la pathogenèse du cancer et de la progression, et peut influer sur le comportement biologique de la tumeur. Cependant, le rôle et le mécanisme d'action de Rabex-5 dans la carcinogenèse de cancer de l'estomac et de la progression n'a pas encore été déterminée. Dans cette étude, nous avons analysé l'expression de la première Rabex-5 dans les tissus de cancer gastrique en utilisant une réaction en chaîne inverse quantitative de transcription-polymerase (qRT-PCR) et immunohistochimie. Par la suite, nous avons examiné les effets de Rabex-5 sur la fonction biologique de la tumeur in vitro Ethique Déclaration Toutes les expériences animales décrites dans cette étude ont été approuvés par le Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) à l'Université médicale de Taishan et tous les animaux ont été maintenus en conformité avec les lignes directrices du IACUC. La collecte et l'utilisation des échantillons humains ont été approuvés par le comité d'examen institutionnel de l'Université médicale Taishan et affiliée Medical Center Hospital Central Taian, après consentement éclairé par écrit de tous les patients. Un total de 110 ensembles de tumeurs gastriques et des tissus, non-tumorales adjacentes (au moins 5 cm de la marge de la tumeur) ont été obtenus chez les patients ayant subi une chirurgie curative à l'Hôpital Central Taian entre Janvier 2010 et Décembre 2013. Ces inclus 27 femmes et 83 hommes, avec un âge moyen de 59,3 ans (extrêmes: 32-80 ans). Aucun patient n'a reçu radiothérapie ou une chimiothérapie avant la chirurgie. les données clinicopathologiques ont été recueillies et la mise en scène de la tumeur pathologique a été déterminée selon le Comité américain mixte sur le cancer (AJCC) gastrique système de classification TNM du cancer. typage histologique a été réalisée par au moins deux pathologistes experts, travaillant indépendamment de manière à double insu. L'étude a été approuvée par les Institutional Review Board de l'Université médicale de Taishan et affiliée Taian Central Hospital Medical Center. Le consentement éclairé écrit a été obtenu à partir de chaque patient avant l'inscription à l'étude. Les lignées cellulaires et conditions lignes humaines gastriques de cellules cancéreuses et gastriques immortalisées, lignée de cellules épithéliales de la muqueuse, Ges-1 , ont été achetés par les Instituts des Sciences biologiques de Shanghai, Académie chinoise des sciences. Les lignées cellulaires ont été maintenues en routine dans du RPMI-1640 contenant 10% de sérum de veau, de la pénicilline (100 UI /ml) et streptomycine (100 IU /ml) dans du CO à 5% 2 atmosphérique à 37 ° C. isolement de l'ARN total et ARN total a été extrait à partir d'échantillons de tissus ou de lignées cellulaires en utilisant le réactif Trizol (Invitrogen, USA), selon les instructions du fabricant. La transcription inverse a été réalisée en utilisant 1 ug d'ARN total, conformément aux instructions du fabricant (Promega, Madison, WI, USA). PCR a été réalisée en utilisant SYBR réactif Green (Applied Biosystems, CA, USA) et les amorces de PCR suivantes; Rabex-5 Paraffine expression par rapport coupes de tissus -embedded de patients ou de souris nues ont été traitées thermiquement à 60 ° C pendant 1 h, déparaffinées dans du xylene, réhydratées dans une série d'éthanol (100 à 50%) et traité dans 0,01 mol /L de tampon citrate (pH 6,0 ) pour la récupération de l'antigène. une activité de peroxydase endogène est inhibée suite à l'incubation avec du methanol contenant 0,3% de H 2 O 2 pendant 30 minutes. Les sections ont ensuite été incubées avec des anticorps de détection Rabex-5 (1:50, Santa Cruz Biotechnology, États-Unis) ou VEGF (1:150; Ab46154, Abcam, États-Unis) à 4 ° C pendant la nuit. Le mode opératoire expérimental suivant a été mis en incubation avec l'anticorps secondaire. Des sections de tissu ont été colorées avec de l'hématoxyline de Mayer. Les lames ont été évalués indépendamment par deux pathologistes, aveuglés à toutes les données du patient. L'intensité de la coloration pour Rabex-5 a été marqué comme 0 (pas de coloration), 1 (coloration légère), 2 (coloration modérée) ou 3 (coloration intense). zone coloration a été notée comme 0 (0%), 1 (1-25%), 2 (26-50%), 3 (51-75%) ou 4 (76-100%), sur la base du pourcentage de cellules colorées positivement. Le score de coloration finale, calculée comme la somme des scores d'intensité et de vulgarisation, a été divisée en trois groupes comme suit: 0-2, expression négative; 3-4, expression faible; et 5-6, une forte expression. silençage ciblée de Rabex-5 L'interférence vecteur Rabex-5 lentiviral a été acheté à Shanghai GenePharma Co., Ltd. La séquence du Rabex-5 l'interférence de ciblage est un oligo 5 'GGATGCAAACTCGTGGGAA-3', tandis que la séquence de contrôle non homologue était 5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3 '. les cellules SGC de 7901 et NCI-N87 ont été étalées dans des plaques 6 puits (5 x 10 4 cellules /puits) cultivées à 40% de confluence et traités avec le surnageant viral titrés à une multiplicité d'infection (moi) de 10. Une analyse par transfert protéines de cellules entières occidentales ont été extraites de cellules en utilisant un tampon RIPA contenant Protease Inhibitor Cocktail (Pierce, Rockford, IL, USA). La protéine a été quantifiée en utilisant un kit BCA Protein Assay (Pierce). Des extraits cellulaires (100 ug) ont été séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 10% de sodium dodécyl sulfate, et on les transfère sur des membranes de fluorure de polyvinylidène. Les membranes ont été bloquées avec 5% de lait écrémé dans une solution saline tamponnée au Tris (TBS) et on incube avec des anticorps primaires à 4 ° C pendant une nuit. Les anticorps primaires utilisés étaient de lapin anti-Rabex-5 (1:200; Santa Cruz Biotechnology), de lapin anti-GAPDH (1:5000; Ab9485, Abcam) et de la souris anti-VEGF (1:300; Ab46154, Abcam). Les membranes ont ensuite été lavées trois fois dans une solution de TBS-Tween pendant 15 minutes et incubées avec des anticorps secondaires. Les signaux ont été détectés à l'aide d'un système de détection de chimioluminescence amplifiée (Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, USA) conformément au protocole du fabricant. La prolifération cellulaire a été mesurée en utilisant un kit de cellule de comptage -8 (CCK-8, Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japon). cellules SGC-7901 ou NCI-N87 ont été ensemencées dans des plaques à 96 puits (1,5 x 10 3 cellules /puits) et incubées pendant différents moments (24, 48, 72, 96 et 120 h). Le milieu de croissance a ensuite été éliminé et remplacé par 200 pi de milieu RPMI-1640 contenant 10% de FBS et 20 pi de la CCK-8 et les plaques ont été incubées à 37 ° C pendant 3 h. L'absorbance a été mesurée à 450 nm en utilisant un lecteur de microplaques Safire2. milieu RPMI-1640 contenant 10% de FBS et de la CCK-8 a été utilisé comme témoin. colonie de test de formation Les cellules ont été ensemencées dans des plaques 6 puits (1 x 10 3 cellules /puits) et le milieu de culture a été remplacé tous les 3-4 jours. Après que la culture de 14 jours, des colonies de cellules ont été fixées avec 4% de paraformaldehyde pendant 10 minutes, colorées avec du violet cristal à 0,1% pendant 20 min, et photographiées. Colonies avec plus de 50 cellules ont été comptées dans chaque tableau de bord. SGC-7901 /KD, les cellules NCI-N87 /KD et des cellules de contrôle ont été recueillies et cycle cellulaire et l'apoptose a été évaluée par cytométrie de flux. Pour l'analyse du cycle cellulaire, les cellules ont été fixées avec 75% d'éthanol et stockées à 4 ° C pendant une nuit. Le jour suivant, les cellules fixées ont été lavées avec du PBS, traitée avec de la RNase A (50 ug /ml) et colorées avec de l'iodure de propidium (PI) (50 pg /ml) pendant 30 min dans l'obscurité. Les cellules colorées ont été analysées par cytométrie en flux (FACSCalibur, Becton-Dickinson). Pour l'analyse de l'apoptose, un véhicule blindé V-Kit d'annexine Apoptosis Detection I (BD Pharmingen, USA) a été utilisé selon les instructions du fabricant. PI et Annexin V-APC double coloration a été effectuée et les cellules ont été analysées par cytométrie de flux (FACSCalibur, Becton-Dickinson), en utilisant le logiciel Cell Quest (Becton-Dickinson). cellules V-APC-positives et négatives PI-annexine ont été définis comme subissant une apoptose. Toutes les expériences ont été réalisées en triple et les valeurs moyennes de ces groupes ont été calculés. Pour les essais de migration, 1 × 10 5 cellules ont été suspendues en sérum libre du milieu RPMI-1640 et étalées sur des chambres qui ne sont pas recouvertes de Matrigel (Corning Costar, NY, USA). Pour le dosage de l'invasion, la chambre haute a été préalablement revêtue de Matrigel (BD Bioscience, CA, USA) selon les protocoles du fabricant, et 1 x 10 5 cellules dans un milieu RPMI-1640 sans sérum ont été ajoutés à la chambre. Pour les deux essais, un milieu contenant 10% de FBS a été ajouté à la chambre inférieure en tant que facteur chimiotactique. Après 24 h de culture, les chambres ont été colorées avec une solution de cristal violet à 0,5% pendant 15 min, et on les immerge dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pendant 10 min. Les cellules dans la chambre inférieure ont ensuite été comptées sous un microscope inversé. Les valeurs sont exprimées en nombre moyen de cellules dans cinq champs aléatoires de vue (200 ×). Les cellules ont été ensemencées dans des plaques 6 puits et cultivées jusqu'à ce qu'ils atteignent la confluence. Les plaies ont été rayées sur la monocouche de cellules en utilisant 20 pi pointes de pipette. Les plaques ont été lavées une fois avec du milieu frais pour éliminer les cellules non-adhérentes suivant la culture de cellules pour 0 ou 48 h (milieu sans sérum de veau), et photographiés. Quatre-semaine- vieux mâles BALB /C souris nues ont été achetés à l'Institut de Zoologie, Académie chinoise des sciences de Shanghai. Les animaux ont été logés dans des cages avec des litières de copeaux de bois dans une pièce à température contrôlée (68-72 ° F) avec un cycle de lumière-obscurité de 12 h et 45-55% d'humidité relative, et ont été autorisés libre accès à l'alimentation et l'eau potable. En bref, la CGT-7901 /KD ou SGC-7901 cellules /NC ont été trypsinisées et remises en suspension dans du PBS (pH 7,4) pour l'injection dans une souris, dans un volume total de 100 ul. La suspension de cellules (1 x 10 6 cellules) a été injecté dans le flanc droit de la souris. La taille des tumeurs a été mesurée à l'extérieur tous les 3 jours en utilisant un pied à coulisse, et le volume de la tumeur a été estimée à l'aide de l'équation: longueur (mm) x largeur 2 (mm) × 0,52. Pour en atténuer les souffrances des souris observées au cours de ces études expérimentales, les souris ont été euthanasiés par CO 2 inhalation le 28e jour après l'injection intrapéritonéale, et les tumeurs ont été pesés après dissection. Les échantillons sont conservés dans de l'azote liquide pour qRT-PCR ou fixées dans 4% de formol pour obtenir des coupes incluses dans la paraffine. Toutes les procédures ont été menées selon les directives d'entretien et l'utilisation des animaux approuvés par le Comité de protection des animaux de l'Université médicale de Taishan. Les données sont représentés comme la moyenne ± écart-type (SD). Les différences statistiques entre les deux groupes ont été examinés par des étudiants de t Résultats expression Rabex-5 est surexprimés dans. tissus de cancer gastrique L'expression de Rabex-5 Régulation à la baisse de Rabex-5 inhibe gastrique prolifération des cellules cancéreuses et la formation de colonies Nous avons ensuite étudié l'expression de Rabex-5 dans des lignées de cellules gastriques et la lignée cellulaire non-cancéreuse , GES-1, par analyse western blot. Rabex-5 a été exprimé dans toutes les lignées cellulaires testées, et était particulièrement élevé dans les SGC-7901 et les cellules NCI-N87 (Fig. 2A). Pour explorer les fonctions de Rabex-5 dans des lignées cellulaires de cancer gastrique, nous avons effectué knockdown de Rabex-5 ciblé dans les lignes haute expression cellulaires, SGC-7901 et NCI-N87. Rabex-5 expression était significativement diminuée dans le SGC-7901 /KD et NCI-N87 /KD cellules par rapport aux cellules témoins (Fig. 2B). Tout d'abord, nous avons examiné l'effet de la perte de Rabex-5 sur la croissance des cellules cancéreuses gastriques. Après 5 jours de culture, le taux de SGC-7901 /KD et les cellules NCI-N87 /KD croissance a été nettement plus lente que les groupes témoins (Fig. 2C). Nous avons également confirmé ces observations dans des dosages de formation de colonies. Le nombre de colonies ont été considérablement réduits dans SGC-7901 cellules /KD et les cellules NCI-N87 /KD par rapport aux cellules de contrôle (Fig. 2D), et nous avons observé que la taille des colonies était aussi plus faible dans les groupes expérimentaux par rapport aux témoins. Ces données suggèrent que la régulation négative de Rabex-5 supprime gastrique prolifération des cellules cancéreuses. Les effets observés Rabex-5 effet de choc sur la croissance cellulaire peut être due à des changements dans la progression du cycle cellulaire et l'apoptose. Nous avons donc examiné les effets de Rabex-5 silencieux sur le cycle cellulaire et l'apoptose in vitro Pour étudier l'influence de Rabex-5 sur la migration et l'invasion, nous avons ensuite effectué transwell migration et l'invasion des essais. La régulation négative de Rabex-5 migration cellulaire supprimée (SGC-7901 /groupe KD, 121,3 ± 6,1 cellules /terrain; SGC-7901 groupe /NC, 261,0 ± 10,5 cellules /terrain; NCI-N87 /groupe KD, 108,7 ± 6,1 cellules /ch& NCI-N87 /NC groupe, 241,7 ± 10,6 cellules /terrain; P Pour étudier l'effet de Rabex-5 sur la motilité.. et la cicatrisation des plaies, on a également effectué des essais de cicatrisation. Nous avons observé que la distance entre les bords des plaies de SGC-7901 /KD et les cellules NCI-N87 /KD a été nettement plus longs que ceux de la CGT-7901 /NC ou cellules NCI-N87 /NC (Fig. 4E). Conformément à ces observations, les niveaux de VEGF ont été downregulated aux niveaux d'ARNm et de protéines dans SGC-7901 /cellules KD (Fig. 4F, G). Basé sur le in vitro Discussion Bien que des études antérieures ont montré que Rabex-5 joue un rôle dans la tumorigenèse dans plusieurs types de cancer [11]. - [14], son rôle dans le cancer gastrique n'a pas été étudié. Dans la présente étude, nous avons constaté que Rabex-5 expression est significativement régulée à la hausse dans les tissus du cancer de l'estomac par rapport au tissu normal adjacent, ce qui indique que Rabex-5 peut contribuer à la tumorigenèse du cancer gastrique. En outre, l'expression de Rabex-5 était significativement associé à la taille de la tumeur et des métastases ganglionnaires. En revanche, il n'y avait pas de corrélation significative entre anormale Rabex-5 expression et le sexe, l'âge ou l'emplacement de la tumeur. Cette étude est la première à élucider la signification clinicopathologique de Rabex-5 expression chez les patients atteints de cancer gastrique. Pour étudier le rôle de Rabex-5 dans la promotion de la tumeur, nous avons ensuite réalisé une perte importante de l'analyse de la fonction dans RABEX- 5 lignées cellulaires élevées exprimant, SGC-7901 et NCI-N87. inhibition réussie de l'expression Rabex-5 a été obtenue par la technologie de l'ARNi, et effet de choc a été confirmée par Western Blot. Nos analyses ont révélé que la prolifération cellulaire a été significativement diminuée chez SGC-7901 /KD et NCI-N87 /KD cellules et des résultats similaires ont été obtenus dans des essais de formation de colonies. Fait important, in vivo Des études antérieures ont montré que Rabex-5 peut se lier spécifiquement à la forme active de RAB- 5, régulant ainsi l'amarrage et la fusion des membranes endosomales, la mobilité des endosomes et transduction du signal intracellulaire [15]. L'expression de protéines RAB-5 a été associée au développement de diverses tumeurs malignes [16] - [18] et est capable de favoriser la migration des cellules tumorales [19], [20]. Angiogénèse joue un rôle clé dans la tumorigenèse [21] et est régulée par plusieurs facteurs tels que le facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF) et le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF) [22]. Le /Akt signalisation PI3K peut être régulée à la fois par le VEGF et PDGF. Par exemple, le VEGF améliore neuroblastome en activant la prolifération PI3K /Akt de signalisation [23]. De même, des études ont montré que le PDGF peut affecter la capacité de migration des cellules par la voie PI3K /AKT [24]. Activation de la signalisation PI3K /Akt peut inhiber l'apoptose cellulaire induite par divers stimuli [25] - [29] et de favoriser la progression du cycle cellulaire [30], [31], ce qui favorise la survie et la prolifération cellulaire. Cette voie participe également à l'angiogénèse [32], [33], et joue un rôle important dans la formation de la tumeur, l'invasion et les métastases [34], [35]. Notre étude montre que Rabex-5 silençage déclenche une diminution de l'expression de VEGF. Par conséquent, nous faisons l'hypothèse que Rabex-5 favorise la croissance et l'aptitude métastatique des cellules de cancer gastrique par l'activation du VEGF et de ses voies de signalisation en aval. En conclusion, nous avons démontré que Rabex-5 favorise la prolifération, la formation de colonies, la migration et l'invasion, ce qui suggère que Rabex-5 peut être un oncogène dans le cancer gastrique, et ses effets peuvent être partiellement médiée par la modulation de l'activation du VEGF. Rabex-5 peut donc représenter un nouveau marqueur diagnostique et pronostique et une nouvelle cible thérapeutique dans le cancer gastrique. Davantage d'efforts doivent être faits pour clarifier les voies de signalisation qui sous-tendent ces phénomènes biologiques.
et in vivo
. L'expression de Rabex-5 est significativement plus élevé dans les tissus du cancer de l'estomac et est associée à la taille de la tumeur et des métastases ganglionnaires. En outre, le silençage de Rabex-5 réduit la prolifération cellulaire du cancer de l'estomac et la formation de colonies in vitro
ciblée par l'intermédiaire de l'induction d'une phase arrêt G0 /G1, et stimulé gastrique apoptose des cellules cancéreuses. Knockdown de Rabex-5 a également inhibé la cicatrisation des plaies, la migration et les capacités invasives des cellules de cancer gastrique. Les résultats de in vivo
expériences animales étaient également compatibles avec ces in vitro
conclusions. Silencing de Rabex-5 a conduit à une diminution de l'expression de VEGF. Ces résultats indiquent que Rabex-5 est régulée positivement et joue un rôle oncogène dans le développement du cancer de l'estomac en activant la voie de signalisation du VEGF
Helicobacter pylori, peuvent jouer un rôle important dans le développement du cancer gastrique [2]. cancer de l'estomac au stade précoce est généralement asymptomatique ou associée à des symptômes non spécifiques, tels que la dyspepsie, et au moment où les symptômes se produisent, il a souvent atteint un stade avancé. Malgré l'utilisation fréquente de la thérapie multimodale (chimiothérapie, la radiothérapie et la chirurgie), la survie à 5 ans des patients reste faible, à 20-40% [3]. Bien que la recherche dans le cancer gastrique a fait de grands progrès, les mécanismes moléculaires sous-jacents au développement du cancer gastrique restent incomplètement compris.
[10].
et in vivo
. Nos résultats démontrent que Rabex-5 est surexprimée et joue un rôle oncogène dans le cancer gastrique.
Matériels et méthodes
Patients et tissus spécimens
culture
qRT-PCR
(avant) 5'-TTGGACAGATGGAATTGCAA-3 'et (inverse) 5'-GTTGCAGTGGTGGAGGAAGT-3'; VEGF
(avant) 5'-CTGTACCTCCACCATGCCAAGT-3 'et (inverse) 5'-CTTCGCTGGTAGACATCCATGA-3' et GAPDH
(avant) 5'-GGACCTGACCTGCCGTCTAG-3 'et (inverse) GTAGCCCAGGATGCCCTTGA 5'-3 '. Les réactions de PCR ont été réalisées avec une dénaturation initiale à 95 ° C pendant 2 min, puis 30 cycles de 94 ° C pendant 30 s, 55 ° C pendant 30 s et 72 ° C pendant 30 s, avec une extension finale à 72 ° C, pendant 10 min. GAPDH
a été utilisé comme un contrôle interne et toutes les réactions ont été réalisées en triple. Les ratios de Rabex-5
dans chaque tumeur jumelé à un échantillon de tissu non-tumorale ont été calculées en utilisant la 2 -ΔΔCt méthode.
immunohistochimie
La prolifération cellulaire test
Analyse du cycle cellulaire et l'apoptose
migration Transwell et invasion test
Wound guérison dosage
modèle de xénogreffe
L'analyse statistique
-test. Les corrélations entre Rabex-5 expression dans les tissus de cancer gastrique et les paramètres clinicopathologiques ont été analysés par chi-carré ou test exact de Fisher. P
< 0,05 a été considérée comme significative, et P
< 0,01 a été considérée comme hautement significative
a été examiné dans le cancer gastrique et les tissus non-tumorales adjacentes par qRT-PCR. Nous avons observé l'expression significativement plus élevé de Rabex-5
ARNm dans les tissus de cancer gastrique par rapport aux tissus non tumoraux correspondant ( P
< 1A 0,01, Fig.). Ces résultats ont été confirmés au niveau de la protéine par coloration immunohistochimique (fig. 1 B, C, D, E). Rabex-5 expression est principalement localisée dans le cytoplasme des cellules cancéreuses. Rabex-5 a été régulée à la hausse dans 61,8% (68/110) des patients atteints de cancer gastrique. Nous avons ensuite étudié la relation entre Rabex-5 expression et caractéristiques clinicopathologiques de cancer gastrique. La régulation positive de Rabex-5 a été associée à la taille de la tumeur ( P
= 0,035) et métastase ganglionnaire ( P
= 0,006), mais pas avec d'autres facteurs clinicopathologiques y compris le sexe, l'âge ou l'emplacement de la tumeur (Tableau 1).
La régulation négative de Rabex-5 favorise l'apoptose des cellules cancéreuses gastriques et induit G0 /G1 arrêt du cycle cellulaire
, par cytométrie en flux. l'analyse par cytométrie en flux a révélé que la proportion de cellules dans la phase G0 /G1 en SGC-7901 /KD ou cellules NCI-N87 /KD était plus élevé que dans SGC-7901 /NC ou NCI-N87 groupes témoins /NC, tandis que le pourcentage de cellules dans la phase G2 /M a été considérablement diminué par rapport aux témoins (Fig. 3A, B). Nous avons également observé des effets significatifs sur l'apoptose dans les groupes traités différemment (Fig. 3C, D), avec la régulation négative de Rabex-5 expression conduisant à une augmentation de l'estomac l'apoptose des cellules cancéreuses.
La régulation négative de Rabex-5 inhibe la migration , l'invasion et la capacité des cellules cancéreuses gastriques cicatrisant
<. 0,05) (figure 4A, C). Des résultats similaires ont été observés dans Transwell essais d'invasion (SGC-7901 /groupe KD, 76,3 ± 6,1 cellules /terrain; SGC-7901 /groupe NC, 108,7 ± 6,0 cellules /terrain; NCI-N87 /groupe KD, 60,7 ± 6,0 cellules /ch& NCI-N87 /groupe NC, 119,0 ± 8,5 cellules /terrain; P
< 0,05) (figure 4B, D)
Silencing de Rabex-5 inhibe la croissance du cancer gastrique in vivo
résultats décrits ci-dessus, nous avons ensuite examiné l'effet de Rabex-5 silence sur la croissance tumorale in vivo en injectant
SGC7901 /KD ou SGC7901 /NC cellules sous-cutanée dans les régions de flanc droit de la souris nude. La taille des tumeurs a été suivie tous les 3 jours avec un étrier. Le volume des tumeurs a été significativement réduite chez les souris 2 semaines après l'injection de SGC-7901 cellules /KD par rapport aux cellules témoins ( P
< 0,05;. la figure 5A). Le volume tumoral des xénogreffes provenant du /groupe KD CGT-7901 était comparable à celle de la CGT-7901 /groupe CN, montrant une nette diminution du volume de la tumeur 4 semaines après l'inoculation des cellules tumorales ( P
< 0,05, Fig. 5B, C). En outre, le poids des tumeurs dérivées de cellules CGT-7901 /KD était significativement inférieure à celle des témoins ( P
< 0,05; fig. 5D). Nous avons ensuite examiné l'expression du VEGF dans les échantillons transplantation de tumeurs par qRT-PCR et immunohistochimie. Comme on le voit sur la Fig. 5E et 5F, les niveaux de VEGF ARNm et la protéine ont diminué dans le /groupe KD SGC-7901 par rapport à SGC-7901 contrôle /NC. Ces in vivo
données sont cohérentes avec nos in vitro
observations et confirment que le silençage de Rabex-5 inhibe la croissance du cancer de l'estomac et de la progression en modulant VEGF activité transcriptionnelle. En résumé, Rabex-5 joue un rôle oncogène dans le cancer gastrique
modèles de xénogreffes pris en charge ces in vitro
observations. Ce phénotype peut être provoquée par Rabex-5 régulation des gènes spécifiques et des voies de signalisation, ce qui affecte le cycle cellulaire et l'apoptose. Dans Transwell essais, moins de cellules SGC-7901 /KD et NCI-N87 /KD ont migré vers la chambre basse que les cellules de contrôle, ce qui suggère que Rabex-5 améliore la migration et l'invasion des cellules cancéreuses gastriques. La cicatrisation des plaies était également significativement diminué suite au silence de Rabex-5. Ces résultats vérifient le rôle important de Rabex-5 dans la croissance des cellules du cancer gastrique et un comportement métastatique. Cependant, le mécanisme moléculaire exact par lequel Rabex-5 exerce ces effets reste inconnue, car les études impliquant Rabex-5 sont limitées.
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dit étude La pandémie actuelle de maladie à coronavirus 2019 (COVID-19) causée par le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2) népargne ni homme ni femme. Plusieurs chercheurs o