PLoS ONE: CCR7 Expression und intratumorale FOXP3 + regulatorischer T-Zellen sind korrelierte mit Gesamtüberlebenszeit und Lymphknotenmetastase in Magenkrebs

Abstrakt

Das Ziel dieser Studie war es, den prognostischen Wert der Chemokin-Rezeptor CCR7 Expression und intratumorale FOXP3 ^{+ regulatorischen T-Zellen (Tregs) bei Magenkrebs zu untersuchen. CCR7 + Tumorzellen und FOXP3 + Tregs wurden durch Immunhistochemie in Gewebe-Mikroarrays enthalten, Magenkrebs von 133 Patienten untersucht. Die prognostische Effekte von niedrigen oder hohen CCR7 und FOXP3 Expression wurden durch Cox-Regression und Kaplan-Meier-Analyse sowie die Korrelation zwischen CCR7 positive Punktzahl und intratumorale FOXP3 + Zellzahl in einer Längs Beurteilung bewertet. Die Analyse zeigte, daß die hohe Expressionsniveaus von CCR7 und FOXP3 wurden in 69,9% und 65,4% der Fälle festgestellt, respectively. Hohe CCR7-Expression in Magenkrebszellen war signifikant mit schlechten Gesamtüberleben (OS) ( P
= 0,010) und Lymphknotenmetastasen ( P
= 0,009) zugeordnet ist, und war ein unabhängiger Faktor für schlimmer OS ( P
= 0,023) durch multivariate Analyse. Hohe Zahlen von intratumorale FOXP3 + Treg signifikant mit kürzeren OS korreliert ( P
= 0,021) und Lymphknotenmetastasen ( P
= 0,024) und war auch ein unabhängiger Faktor für negative OS ( P
= 0,035). Darüber hinaus gab es eine signifikant positive Korrelation zwischen CCR7 positive Bewertung und intratumorale FOXP3 + Zellzahl (r = 0,949, P
< 0,001). Diese Ergebnisse zeigten, dass CCR7 Expression in Magenkrebszellen und intratumorale FOXP3 + Treg könnte als Co-Indikator für die klinische Prognose von Magenkrebs in Betracht gezogen werden}

Citation:. Zhou S, Xu S, Tao H, Zhen Z, Chen G, Zhang Z, et al. (2013) CCR7 Expression und intratumorale FOXP3 ^{+ regulatorischer T-Zellen sind korrelierte mit Gesamtüberlebenszeit und Lymphknotenmetastase in Magenkrebs. PLoS ONE 8 (9): e74430. doi: 10.1371 /journal.pone.0074430}

Editor: Udai P. Singh, University of South Carolina School of Medicine, Vereinigte Staaten von Amerika

Received: 26. April 2013 beginnen; Akzeptiert: 1. August 2013; Veröffentlicht: 5. September 2013

Copyright: © 2013 Zhou et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde von National Natural Science Foundation of China (Nr 31000527), Shanghai Health Bureau Forschungsfonds für junge Ermittler (Dr. Shuang Zhou) und Hong Kong Scholar-Programm (Nr XJ2011025) unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

CCR7 ist ein sieben-Transmembran-G-Protein-gekoppelten Chemokinrezeptor, hauptsächlich auf der Zelloberfläche von naiven T-Zellen exprimiert und dendritischen Zellen (DCs), SLC (sekundären lymphatischen Chemokin, CCL21) und ELC (EB11-Ligand-Chemokin , CCL19) sind die zwei Hochaffinitätsliganden. CCR7 ist wesentlich für die Migration von T-Zellen und DCs zum umgebenden Lymphgewebe oder der Stelle der Immunantwort durch seinen Liganden-Bindungs ​​[1]. CCR7
ist ausgedrückt nicht nur
in naive T-Zellen und DCs, aber auch in einigen Tumorzellen. Tumore mit hoher CCR7 Expression eher extrathyreoidale Erweiterung angiolymphatic invasion, Lymphknotenmetastasen, anti-apotosis und Zellproliferation [2] zeigen - [4]. CCR7 fördert Tumorwachstum und Metastasierung in Reaktion auf endogene SLC oder ELC. Viele Studien haben gezeigt, dass bösartige Zellen mit CCR7 Expression kann auf die entsprechenden Organe mit hoher Anwesenheit ihrer Liganden gerichtet werden [5] - [8]. Daher wird CCR7-vermittelten Zell-Chemotaxis nicht nur zur Einrichtung der Immunantitumormikroumgebung bezogen, sondern auch die frühzeitige Bewertung des biologischen Verhaltens von Tumoren kann helfen. CCR7 Expression in Tumorzellen ist eng mit ihren Metastasen und maligne Erkrankung korreliert [2].

Regulatorische T-Zellen (Treg) wird angenommen, dass T-Zell-Immunität zu dämpfen und das Haupthindernis Tempern Immuntherapie sein. Eine wachsende Zahl von Hinweisen deutet darauf hin, dass Tregs im Tumor-Mikroumgebung könnte eine wichtige Rolle bei der Unterdrückung der lokalen Anti-Tumor-Immunantworten [9], [10] spielen. FOXP3, ein forkhead /geflügelte Helix-Transkriptionsfaktor, ist die spezifische Markierung von Tregs und es ist möglich, Tregs strenger als CD4 ^{+ CD25 + regulatorischen T-Zellen [11] zu definieren. FOXP3 scheint für die Entwicklung und Funktion von Treg, und der Verlust von Foxp3-Expression kritisch zu sein, führt zu dem Mangel an Treg und Hyperaktivierung von CD4 + T-Zellen, was zu einer letalen Autoaggressions Lymphoproliferation, während die Überexpression von FOXP3 Ergebnisse in schweren Immunschwäche [11] - [13]. Es wird berichtet, dass FOXP3 erhöht + Tregs mit einem höheren Risiko eines erneuten Auftretens und schlechten Gesamtüberlebenszeit von Patienten mit einigen soliden Tumoren assoziiert sind [14] - [20]}

Magenkrebs die vierthäufigste ist. Krebs in der Welt, und die Gesamtüberlebenszeit der Patienten bleibt arm trotz verbesserter Diagnose- und Behandlungsstrategien, unter denen Resektion eine der ersten Prioritäten ist [21]. Weitere Untersuchungen wird empfohlen, die prognostische Bedeutung von CCR7 Expression und Tregs bei Magenkrebs zu untersuchen.

In dieser Studie untersuchten wir den prognostischen Wert von CCR7-Expression in Magenkrebszellen und intratumorale FOXP3 ^{+ Tregs und die Beziehung zwischen ihnen in Magenkrebs. Die Ergebnisse legen nahe, dass sie nicht nur mit schlechten Überlebensraten und Lymphknotenmetastasen assoziiert waren, sondern auch positiv miteinander korreliert.}

Materialien und Methoden

Ethik Statement

Diese Studie wurde von der Ethikkommission an der Tongji University School of Medicine genehmigt und eine schriftliche Einverständniserklärung wurde von allen Patienten vor der Einschreibung erhalten. Das Verfahren der menschlichen Magenkrebs Resektion Proben von Patienten zu sammeln wurde auf die Grundsätze in der Deklaration von Helsinki skizzierte angepasst.

Patienten und Follow-up

133 Patienten mit Magenkrebs, die Lymphknoten ausgedehnt unterzog Dissektion (D2 Resektion) zwischen 2001 und 2007 an der Tongji-Hospital (Shanghai, China) wurden in unserer Studie aufgenommen. Die Auswertung der Resektion Proben wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des japanischen Gastric Cancer Association (JGCA) im Jahr 1998. Keiner der Patienten erhielten eine Strahlentherapie, Chemotherapie oder anderen medizinischen Interventionen vor der Operation durchgeführt. Die Proben wurden nur auf der Basis der Verfügbarkeit geeigneter Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten Gewebeproben und vollständige clinicopathologic ausgewählt und Follow-up-Daten für die Patienten.

Follow-up am 15. November 2010 abgeschlossen wurde A mindestens 3-Jahres-Follow-up war nicht erforderlich. Das mediane Follow-up betrug 43 Monate (Bereich: 36-104 Monate). Follow-up-Verfahren bestand aus Zwischen Anamnese, körperliche Untersuchung, Tumormarker (CEA, Ca 19-9), Abdomensonographie und Röntgen alle 4-6 Monate nach der postoperativen Zeit. Bei Patienten mit einer Testergebnisse suggestive eines erneuten Auftretens, Computertomographie (CT) und Magnetresonanztomographie (MRT) für einen Beweis für einen Rückfall eingesetzt. Die Rezidive von Magenkrebs hatte durch Zytologie Biopsie oder eine Operation bestätigt werden. Das Gesamtüberleben (OS) wurde für die überlebenden Patienten als das Intervall zwischen Operation und Tod oder zwischen der Operation und der letzten Beobachtung definiert. Die Daten wurden für lebende Patienten bei der letzten Follow-up zensiert.

Gewebe Microarrays und Immunhistochemie

Tissue Microarrays konstruiert wurden, wie zuvor beschrieben [22], [23]. Alle Fälle wurden histologisch rezensiert von Hämatoxylin und Eosin-Färbung und repräsentative Tumorarealen mit kleinen runden Lymphozyten infiltrieren wurden in den Paraffinblöcken, weg von nekrotischen und hämorrhagischen Materialien vormarkiert. Duplizieren 1-mm Durchmesser Zylinder aus Tumorzentrum (als intratumorale bezeichnet) von jeweils unter Verwendung eines automatisierten Gewebe Arrayer (Shanghai Biochip Co., Ltd, Shanghai, China) zusammen mit paracancerous nonmalignant Magengewebe ausgewählt wurden als Kontrollen Reproduzierbarkeit und homogen zu gewährleisten Färbung der Objektträger. Abschnitte von 4 um Dicke wurden auf 3-Aminopropyltriethoxysilan-beschichtete Objektträger gebracht.

Die monoklonalen Maus-Antikörper verwendet wurden, waren anti-human CCR7 (eBioscience, San Diego, CA) und FOXP3 (BioLegend, San Diego, CA) . Immunhistochemie von Paraffinschnitten wurde ein Zwei-Schritt-Protokoll durchgeführt (Novolink Polymer Detection System, Novocastra, Newcastle, UK) gemäß den Anweisungen des Herstellers. Kurz gesagt, in Xylol und rehydratisierten Schnitte wurden in Ethanol entparaffiniert. Nach endogene Peroxidase-Aktivität wurde in 0,3% bei Inkubation der Objektträger blockiert H _{2 O 2, Antigen-Retrieval, indem die Abschnitte in einem elektrischen Kochtopf gefüllt mit kochendem Citratpuffer für 20 Minuten, und nicht spezifische Bindungsstellen durchgeführt wurde wurden mit Protein-Block (RE7102) blockiert. Nach Serien Inkubation mit primären Antikörpern, Post Primary-Block (RE7111) und Sekundärantikörper (RE7112) wurden die Schnitte in 3,3'-diamiobenzidine entwickelte Lösung unter einem Mikroskop und counterstained mit Hämatoxylin. Negative Steuerschieber die primäre Antikörper weggelassen wurden in allen Tests enthalten.}

Auswertung der immunhistochemischen Variablen

Die CCR7 positive Punktzahl von Tumorzellen durch die Verwendung von Bildanalyse-Software (Leica Qwin Bildverarbeitung analysiert und Die Analyse der Anwendungssoftware, Wetzlar, Deutschland). Für jede Folie, die alle intakt High-Power-Bereich (HPF) (× 400) digitale Bilder wurden durch die oben erwähnte Ausrüstung aufgenommen und dann von der Bildanalyse-Software analysiert, um die positive Bewertung von CCR7 für jedes Feld zu erwerben. Schließlich durchschnittliche Zahl für ein HPF (× 400) wurde berechnet, um die Repräsentativität und Homogenität zu gewährleisten.

Die Zahl der FOXP3 ^{+ Tregs in Microarrays gezählt wurde, wie zuvor beschrieben [14], mit computerisierten Bildanalyse System einer Kamera CCD HV-C20A Hitachi zusammengesetzt (Hitachi, Tokyo, Japan), auf einem Lichtmikroskop Leica DMLA installiert (Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland) und an einen Personal Computer angeschlossen ist. Unter × 400 Vergrößerung gab es mindestens 12 unabhängige und intakte computerisierte mikroskopische Felder für die Duplikate jeder Patientenprobe. 8 unabhängige mikroskopische Felder (x 400), die die dichteste lymphatische Infiltrate, wurden für jede Patientenprobe ausgewählt Repräsentativität und Homogenität zu gewährleisten. Die Zahlen von 12 Feldern wurden kumuliert und dann gemittelt, um die endgültige Zahl für eine computerisierte × 400 mikroskopischen Feld (0,0768 mm 2 /Feld) zu berechnen. Die Auswertung von FOXP3 + Tregs wurde von zwei unabhängigen Beobachtern in verblindet durchgeführt. Abweichungen in Aufzählung, in einem Bereich von 5%, wurden neu bewertet und ein Konsens Entscheidung wurde getroffen.}

Statistische Analyse

Actuarial OS Raten wurden von der Kaplan-Meier-Methode berechnet und analysiert durch die Log-Rank-Test. Univariate und multivariate Analysen wurden auf dem Proportional-Hazards-Regressionsmodell Cox basiert. Eine sekundäre Analyse wurde durchgeführt, um die Beziehung zwischen den Variablen und klinisch-pathologische Eigenschaften zu bewerten. Für den Vergleich der einzelnen Variablen, Chi-Quadrat-Tests und genaue Tests Fisher wurden als angemessen durchgeführt. Zweischwänziges P
< 0,05 wurde als signifikant beurteilt. Alle Analysen wurden mit SPSS 16.0 Software (SPSS, Chicago, IL) durchgeführt.

Ergebnisse

• PLoS ONE: Helicobacter-pylori-Infektion synergizes mit drei entzündungsbedingten Genetische Varianten im Gwäss Risiko von Magenkrebs in einem chinesischen Population
• PLoS ONE: rotem und verarbeitetem Fleisch-Aufnahme ist mit höheren Magenkrebsrisiko verbunden: Eine Meta-Analyse von Epidemiologische Beobachtungs Studies