PLoS ONE: Verlust des Proteins Promyelozytenleukämie in Magenkrebs: Implikationen für die IP-10 Expression und Tumor-infiltrierende Lymphocytes

Abstrakt

Magenkrebs ist eine der häufigsten Ursachen von Krebs verursachten Todesfälle weltweit. Die Expression des Tumor-Suppressor, Promyelozytenleukämie (PML) Protein wird in Magenkarzinomen in Verbindung mit einem erhöhten Maß an lymphatische Invasion, Entwicklung höherer pTNM Inszenierung und ungünstige Prognose reduziert oder abgeschafft. Hierin untersuchten wir die Beziehung zwischen dem Ausmaß der Tumor-infiltrierenden Lymphozyten und den Status der PML-Protein-Expression in fortgeschrittenem Magenkarzinom. Wir beobachteten eine höhere Anzahl von T-Zellen in Magenkarzinom Geweben, in denen PML-Expression reduziert oder aufgehoben Infiltrieren, im Vergleich zu Geweben für positive PML. Das Ausmaß der T-Zell-Migration in Richtung Kulturüberstand, erhalten von Interferon-gamma (IFN-γ stimulierten Magenkarzinom-Zelllinien wurde zusätzlich durch Expression von PML beeinflusst in vitro
. Interferon-gamma-inducible protein 10 (IP -10 /CXCL10) Expression wurde in Magenkarzinomgewebe erhöhte Spiegel PML reduziert angezeigt wird. Außerdem sowohl Pml
knockout und Zuschlags Zellen zeigten verbesserte IP-10 mRNA und Protein-Expression in Gegenwart von IFN-γ. PML Knockdown erhöhte IFN-γ-vermittelte Signal Transducer und Activator of Transcription-1 (STAT-1) Bindung an die IP-10-Promotor, was zu einer erhöhten Transkription des IP-10-Gens. Umgekehrt PML IV-Protein-Expression unterdrückt IP-10 Promotoraktivierung . Basierend auf diesen Ergebnissen, schlagen wir vor, dass der Verlust von PML-Protein-Expression in Zellen, Magenkrebs zu erhöhten IP-10 Transkription beiträgt über
Verbesserung der STAT-1-Aktivität, die wiederum Lymphozytenhandel in Tumorregionen fördert .

Citation: Kim HJ, Song DE, Lim SY, Lee SH, Kang JL, Lee SJ, et al. (2011) Verlust des Proteins Promyelozytenleukämie in Magenkrebs: Implikationen für die IP-10 Expression und Tumor-infiltrierenden Lymphozyten. PLoS ONE 6 (10): e26264. doi: 10.1371 /journal.pone.0026264

Editor: Yoshio Yamaoka, Veterans Affairs Medical Center (111D), Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 21. April 2011; Akzeptiert: 23. September 2011; Veröffentlicht: 12. Oktober 2011

© 2011 Kim et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde durch das Ministerium für Bildung, Wissenschaft und Technologie (2010-0015506) zur Y-HC, von der National Research Foundation of Korea (NRF) gefördert gefördert von der Basic Science Research Program durch die National Research Foundation of Korea (NRF) unterstützt von der Korea Regierung (MEST) (2010-0029353) zu JLK und von RO1 NS50665 zu ENB. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs ist eine der häufigsten Ursachen von Krebs-Todesfälle weltweit. Jüngste Fortschritte in der Genetik haben die Detektion von Ereignissen im Verlauf des Magen-Karzinogenese auftritt, einschließlich der Aktivierung von Onkogenen erleichtert, Gene von Tumorsuppressor-Silencing und Mutation von Genen in der DNA-Reparatur beteiligt sind [1]. Unter diesen genetischen Ereignissen ist es bekannt, dass Tumor-Suppressor-Promyelozytenleukämie (PML) Protein-Expression reduziert oder bei Magenkrebs abgeschafft, und dass dies mit umfangreichere Lymphgefäßinvasion verbunden sind, höhere pTNM Staging und ungünstige Prognose, was darauf hindeutet, dass PML Verlust verbunden Karzinom Progression der Karzinogenese und der Magen [2]. Frühere Studien beteiligt Pml
Dysfunktion in der Progression einer Vielzahl von Krebsarten, und reduziert oder abgeschafft Ausdruck von PML wurde in Prostata, Brust, ZNS, Darm-, Lungen- und Magenkrebs [2], [3] berichtet .

Pml
Gen ursprünglich durch Fusion mit dem Retinsäure-Rezeptor beteiligt in der t identifiziert wurde (15; 17) chromosomale Translokation in Verbindung mit akuter Promyelozytenleukämie (APL) [4], [ ,,,0],5], [6], [7], [8]. PML ist ein Protein, die Tumorsuppressor-Zellzyklus-Progression, Gentranskription, Transformation Unterdrückung und Apoptose reguliert. Pml
Knockout-Mäuse sind wesentlich empfindlicher auf die Tumorbildung nach der Exposition gegenüber Karzinogenen als Wildtyp-Kontrollen sind, und Pml
defizienten Zellen sind weniger wahrscheinlich, dass die Apoptose nach der Anwendung von bestimmten Arten von zu unterziehen zellulären Stress [9]. Zusätzlich zu Berichten über die Tumorsuppressor Rolle PML, mehrere Studien gespielt Fokussierung haben bestätigt, dass das Protein wirkt als Transkriptionsregulator über
Verband mit dem Co-Aktivator CREB-Bindungsprotein; Co-Repressoren einschließlich HDAC, N-CoR und mSin3A; und die Transkriptionsfaktoren Nur77, AP-1, myc, p53 und STAT-1α [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17].

Progressive Mutation und genetische Veränderungen in verschiedenen Tumor-Suppressor-Gene fördern Tumorentstehung und Progression [18]. Zusätzlich zu genetischen Veränderungen in Tumorzellen, die sowohl Entzündungszellen und Mediatoren tragen zur Bildung von bestimmten Tumormikroumgebung [19], [20]. Tumor-assoziierte Fibroblasten (TAFs) und Makrophagen (TAM) werden auch in die Modulation des Tumormikroumgebung über
Produktion von Cytokinen, Chemokinen, Interferone und andere biologisch aktive Faktoren, [21], [22] beteiligt. Übersprechen zwischen Tumorzellen, TAFs, TAMs und Lymphozyten, ist signifikant in der Tumorentwicklung und das Fortschreiten und trägt zur Schaffung von Tumormikroumgebung angereichert Expression einer Vielzahl von biologisch aktiven Faktoren, [23], [24], [25] [26], [27].

TAMs gefunden mit Angiogenese und einer ungünstigen Prognose in mehreren Arten von Krebs zu korrelieren, einschließlich Magenkrebs [22], [28]. Mastzellen produziert viele angiogene Faktoren und eine Vielzahl von Cytokinen und ihre Dichte wurde berichtet, zu stark mit dem Ausmaß der Tumor Neoangiogenese und einer schlechten Prognose korrelieren [29], [30]. CD4 ^{+ und CD8 + Lymphozyten sind auch in einer Vielzahl von soliden Krebsgewebe gefunden. Bis heute sind die genauen molekularen Mechanismen, durch die die Art und die Anzahl der tumorinfiltrierenden Zellen reguliert werden, sind weitgehend unbekannt. Es gibt mehrere Berichte umstritten hinsichtlich der Anzahl und Funktion der tumorinfiltrierenden Lymphozyten. Insbesondere CD8 + T-Lymphozyten, während deren Funktion bekannt ist, entstehende transformierte Zellen zu eliminieren, und tragen zur Immunüberwachung [31], wird berichtet, dass CD8 + Tumor-infiltrierenden T-Zellen defekt sind, in Effektor-Phasenfunktion bei Kontakt mit Tumorzellen [32], und ihre Infiltration zu ungünstigen Prognose bei bestimmten Krebsarten, wie beispielsweise nicht-kleinzelligem Lungenkrebs und Nasopharynxkarzinom verknüpft ist [33], [34].}

Chemokine durch Stromazellen sekretiert oder Tumor Zellen beeinflussen Tumorzellmigration, Invasion, Proliferation, Angiogenese und Immunzellinfiltration in die Tumormasse [35]. IFN-γ-induzierbaren Protein-10 (IP-10, CXCL10) ist eine der CXC-Chemokine, die mehrere Rollen bei Entzündungserkrankungen und Krebs spielt [36], [37]. Da IP-10 fördert vorzugsweise Th1-Immunantworten durch NK und T-Zellen kräftig anzieht, wird es als eine der möglichen Mechanismen der T-Zell-Infiltration von Tumoren vorgeschlagen.

Ob Verlust der Tumorsuppressorgene in Tumorzellen induziert Rekrutierung Lymphozyten und Modulation der Funktionen solcher Zellen in Tumor-Mikroumgebung ist derzeit unklar. In der vorliegenden Studie untersuchten wir PML-Funktion in Bezug auf die Rekrutierung von Lymphozyten und Modulation der Expression von Tumor abgeleitete Faktoren. Expression von PML wurde umgekehrt mit dem Ausmaß der Infiltration von CD8 ^{+ T-Zellen in Magenkarzinomen korreliert. PML Verlust wurde weiter mit erhöhter Expression von IP-10 verbunden sind, eine der Lymphozytenanziehende CXC-Chemokine, bei Magenkarzinomzellen und Geweben. PML Zuschlags gefördert IFN-γ-vermittelte STAT-1-Bindung an die IP-10-Promotor, was zu einer erhöhten Transkription des IP-10-Gens. Unsere Daten unterstützen die Vorstellung, dass PML in Rekrutierung von Lymphozyten in Tumoren beteiligt ist, über
Modulation der Expression von tumor-abgeleiteten Faktoren, einschließlich IP-10, weitere Nachweise vorausgesetzt, der Verlust von Tumorsuppressorgenen in Tumor Zellen beteiligt sich aktiv an der Gründung von Tumormikromilieus.}

Ergebnisse |

der Verlust der PML-Protein ist mit einer erhöhten Infiltration von CD8 ^{+ T-Zellen in fortgeschrittenem Magenkarzinomgewebe assoziiert}

die immunhistochemische Färbung für PML und CD8 wurde durchgeführt, um zu untersuchen, ob das Ausmaß der Lymphozyten-Infiltration mit PML Expressionsstatus in fortgeschrittenem Magenkrebs in Verbindung gebracht wurde. CD8-immunpositiven Zellen wurden wie in Materialien und Methoden beschrieben aufgezählt. Insgesamt 35 Proben (71,4%) zeigten teilweise zu einem vollständigen Verlust von PML in den Tumorzellkerne von Stadium IV fortgeschrittenen Magenkarzinomen. Proben von 14 Patienten mit fortgeschrittenem Magenkarzinom waren für PML diffus positiv und enthielt im Durchschnitt 32,7 CD8 ^{+ T-Zellen pro Feld (Abbildung 1A). Wir identifizierten 19 Fälle von fortgeschrittenen fokale Positivität ausstellenden Magenkarzinom für PML, mit einem Durchschnitt von 47,2 CD8 + T-Zellen pro Feld. Darüber hinaus vollständigen Verlust der PML wurde bei 16 fortgeschrittenem Magenkarzinom-Patienten beobachtet; Die Proben enthielten eine mittlere Zahl von 52,8 CD8 + T-Zellen pro Feld. Die Proben fokale Positivität oder vollständigen Verlust für PML Anzeige zeigte einen deutlichen Anstieg der CD8 + T-Zellzahl als tat Proben diffuse Positivität für PML zeigen. Repräsentative Bilder sind in 1B gezeigt. Obwohl die Expression PML-Protein wurde in Tumorzellen reduziert oder abgeschafft, die alle normalen Magenschleimhaut Drüsen, Stroma-Gewebe, und lymphatischen Zellen zeigten diffuse moderate bis starke Kern immunopositivity für PML.}

PML Einflüsse T-Zell-Infiltration /Migration in-vitro-

im Hinblick auf den Verlust von PML-Protein-Expression und die Zunahme der Infiltration von CD8 ^{+ T-Lymphozyten in fortgeschrittenen Magenkarzinom Gewebe, wir nahmen an, dass PML beigetragen zu T-Zell-Infiltration /Migration in Magenkrebs. Um zu untersuchen, ob die PML-Ebene bei Magenkrebs-Zellen T-Zell-Migration beeinflusst, konditionierten Medien von SNU-638-Zellen transient mit entweder Pml
siRNA oder PML IV-Expressionsvektor, dann mit IFN-γ behandelt wurde, verwendet in Transwell-Migrationsassays. SNU-638 Magenkrebs-Zellen exprimiert ein hohes Maß an PML-Protein, im Einklang mit früheren Ergebnissen [2], während SNU-638-Zellen, die mit Pml
siRNA angezeigten Niveaus der endogenen PML-Expression reduziert (~46-56%) , wie durch Immunoblotting (2A) bestätigt. IFN-γ eine bescheidene Zunahme der PML-Protein-Expression, in Übereinstimmung mit früheren Ergebnissen induziert [38]. Migration von Jurkat-T-Zellen in Richtung auf konditioniertes Medium von Pml
siRNA-transfizierten wurde SNU-638-Zellen signifikant verbessert, verglichen mit der Kontroll-siRNA-transfizierten Zellen nach Behandlung mit IFN-γ (2B). Bei Transfektion von SNU-638 mit PML IV Expressionsvektor, der Migration von Jurkat-T-Zellen in Richtung auf konditioniertes Medium von PML IV überexprimiert Zellen reduziert wurde im Vergleich zu der leeren Vektor (Abbildung 2C). Diese Ergebnisse legen nahe, dass die Ebenen PML sekretorischer Molekülen reguliert, hergestellt von und freigegeben von Magenkrebszellen IFN-γ stimulierte und beeinflusst auch die Migration von T- Lymphozyten.}

Verlust von PML verbessert IFN-γ induzierte IP-10-Expression

Chemokine, eine Familie von chemotaktische Cytokine, fördern die Migration von Leukozyten /Lymphozyten zu Entzündungsherden und Verletzungen im Umlauf. Um zu untersuchen, ob Chemokin Ebenen durch folgende Faktoren beeinträchtigt wurden Pml
genetischen Status, Chemokin-Gen-Expression wurde unter Verwendung von Ribonuklease-Schutz-Assay (RPA) untersucht. Pml
<sup>+ /+ und Pml
- /- Maus embryonale Fibroblasten (MEF-Zellen) wurden in Abwesenheit oder Anwesenheit von IFN-γ für 0-24 h inkubiert , gesamt-mRNA wurde zu verschiedenen Zeitpunkten, und einer RPA gesammelt. In Pml
- /- MEFs, IP-10-mRNA-Spiegel erhöht das 1,5-fache auf 2 h und wurde deutlich erhöht (8-fach) von 4 h (3A). RANTES-mRNA-Spiegel wurden 3,2-fach bei 0,5 h erhöht und blieb erhöht, aber in geringerem Umfang (1,3-fach), 8 h post-IFN-γ-Behandlung in Pml
- /- MEFs . Andere Chemokingene, einschließlich MIP-1, MIP-2 und MCP-1 wurden nicht detektierbar ausgedrückt in Pml
+ /+ oder Pml
- /- MEFs (Daten nicht gezeigt). STAT-1-Expression wurde nach der Belichtung erhöhte IFN-γ in beiden Zelltypen, aber kein Unterschied war offensichtlich, wenn IFN-γ-Spiegel wurden im Vergleich zwischen Pml
+ /+ und Pml
- /- Zellen. Da die Transkription des Gens IP-10 im Wesentlichen erhöht wurde IFN-γ-stimulierte Pml
- /- MEFs, wir relevante Protein-Spiegel in den Kulturüberständen von Mess Pml
+ /+ und Pml
- /- MEFs, die ein Enzym-linked immunosorbent assay (ELISA) verwendet wird. Übereinstimmend mit den Ergebnissen RPA, höhere IP-10-Proteins waren evident in konditioniertem Medium von IFN-γ behandelten Pml
- /- MEFs (3B). Auch IP-10-mRNA-Expression in Pml
siRNA-transfizierten NIH3T3-Zellen verstärkt wurde, im Vergleich zu der Kontroll-siRNA-transfizierten Zellen nach IFN-γ-Behandlung (3C). Die Reduktion der Expression von PML-Protein in Pml
siRNA-transfizierten NIH3T3-Zellen wurde durch Immunoblotting bestätigt.</sup>

Reduzierte PML-Expression wird invers mit IP-10-Proteinspiegel in Magenkrebsgewebe und SNU- korreliert 638 Zellen

Als nächstes untersuchten wir die Beziehung zwischen IP-10 und PML-Protein-Expression in fortgeschrittenem Magenkarzinomgewebe. Krebsgewebe wurden immunhistochemisch gefärbt PML und IP-10, und die Intensität des IP-10 immunopositivity wurde gemessen, wie in Materialien und Methoden beschrieben. Die mittlere Intensität von IP-10 betrug 1,2 in 14 Proben zeigt diffuse Positivität (DP) für PML, 2.2 in 19 Fällen von fokalen Positivität (FP) und 2,0 in 16 Proben, in denen es vollständigen Verlust (CL) von PML Ausdruck ( 4A, linkes Feld). Ein signifikanter Anstieg der IP-10-Expression in Proben zeigt fokale Positivität von PML ( P
= 0,034), im Vergleich zu denen zeigt diffuse positive PML-Expression beobachtet. Eine Erhöhung der IP-10-Expression wurde beobachtet, als vollständiger Verlust der PML war offensichtlich, verglichen mit dem, was festgestellt wurde, als PML diffus ausgedrückt war; aber dieser Unterschied erreichte keine statistische Signifikanz. Repräsentative Beispiele von Variationen in PML-Protein-Status, die mit verschiedenen IP-10-Expressionsniveaus in Tumorzellen von fortgeschrittenen Magenkarzinomen korreliert sind gezeigt (4A, rechts). Um zu untersuchen, weiter die Beziehung zwischen IP-10 und PML-Protein-Expression in Magenkarzinomzelllinien, IP-10-Protein-Spiegel wurden in den Kulturüberständen gemessen von SNU-638-Zellen transient mit entweder Pml
siRNA oder PML IV exression Vektor. Die Zellen wurden in Abwesenheit oder Anwesenheit von IFN-γ für 8 h, Überstände gesammelt, und IP-10 Level quantifiziert darin (durch ELISA) gezüchtet. IFN-γ induzierte IP-10-Sekretion in deutlich verbessert wurde SNU-638- Pml
siRNA-transfizierten Zellen verglichen mit der SNU-638-Zellen, transfiziert mit Kontroll-siRNA (4B). Transfektion von SNU-638 mit PML IV Expressionsvektor unterdrückt IFN-γ induzierte IP-10-Sekretion (4C). Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass die Sekretion von IP-10 von Magenkrebszellen erhöht wird, wenn PML Ausdruck reduziert wird.

IP-10 neutralisiert und verringert die Migration von T-Zellen

Als SNU-638- Pml
siRNA-haltigen Zellen reduzierte Mengen an PML-Protein exprimieren zeigte Verstärkung der T-Zell-Rekrutierung und IP-10-Sekretion in Reaktion auf IFN-γ (2 und 4), untersuchten wir als nächstes, ob eine Erhöhung der IP- 10 Ebenen erleichtert T-Zell-Migration in Richtung konditioniertes Medium von SNU-638 Zellen Magenkrebs stimuliert durch IFN-γ. SNU-638- Pml
siRNA-Zellen wurden in Abwesenheit oder Anwesenheit von IFN-γ für 8 h gezüchtet, und die gesammelten Überstände wurden vorbehandelt mit einem anti-IP-10 neutralisierende Antikörper oder Kontroll unspezifischen IgG für 1 h vor Beginn des Transwell-Assay. Neutralisierende Antikörper oder IgG-haltige Überstände wurden in den unteren Kammern angeordnet ist, und die Migration von Jurkat-Zellen von der oberen zu der unteren Kammer wurde analysiert, indem die Zellen geerntet von den unteren Kammern zu untersuchen. Einbeziehung von IP-10-neutralisierenden Antikörpern inhibiert Jurkat T-Zell-Migration in Richtung konditioniertes Medium von SNU-638- Pml
siRNA-Zellen (5A). Diese Ergebnisse stehen im Einklang mit Daten aus NIH3T3-Zellen erhalten wird; ein IP-10-neutralisierenden Antikörper hemmte EL-4 T-Zell-Migration in Richtung konditioniertes Medium von NIH3T3- Pml
siRNA-Zellen (5B).

PML Knockdown verbessert IP-10 Promotoraktivierung

Als IP-10-Expression in PML-Zellen Knockdown erhöht wurde, wir weiter untersucht, ob PML-Protein-Expression IP-10 Promotoraktivität betroffen. Der murine IP-10-Promotor enthält eine putative GAS artiges Element, das zwischen -246 und -238 nts (TTN _{5AA) (6A). Wir zuvor berichtet, dass PML sich negativ auf die Transkriptionsaktivität von STAT-1 reguliert [17]. Um festzustellen, ob PML betroffen IFN-γ-induzierte IP-10 Genexpression über TÜV-Mechanismus mit STAT-1, wir isoliert und erzeugt ein Reporterkonstrukt an Position beginnend -330 des Maus-IP-10-Promotor enthält, die putative GAS förmige Element, wie in Materialien und Methoden beschrieben. Die IP-10- luc
Reporter das GAS artiges Element enthält, wurde in NIH3T3-Zellen mit oder ohne IFN-γ für 24 h inkubiert transient und anschließend auf Luciferase-Aktivität untersucht. IFN-γ induzierte IP-10-Promotor-Aktivität wurde in NIH3T3-Zellen transfiziert mit Pml
siRNA, im Vergleich zu Zellen Empfangssteuer siRNA (6B) deutlich verbessert. Bei Transfektion von NIH3T3-Zellen mit dem PML IV Expressionsvektor, IFN-γ induzierte IP-10 Promotoraktivierung signifikant unterdrückt. Das Herunterregulieren von PML Ausdruck mit Pml
siRNA und die Überexpression von PML durch PML IV Expressionsvektor wurden durch Immunblotting verifiziert. Um zu bestimmen, ob die inhibitorische Wirkung von PML auf IFN-γ induzierte IP-10 Promotoraktivität aufgetreten ist in Magenkrebs-Zelllinien, führten wir ähnliche Experimente mit SNU-638 Magenkrebszellen. Die Muster der Zunahme und Abnahme der Luciferase-Aktivität in SNU-638 waren ähnlich derjenigen von NIH3T3-Zellen (Figur 6C). Das Niveau des PML-Protein-Expression in SNU-638-Zellen transfiziert entweder mit Pml
siRNA oder PML IV Expressionsvektor durch Immunoblotting nachgewiesen wurde (Daten nicht gezeigt).}

PML Knockdown erhöht IFN-γ- induzierten STAT-1-DNA an die an die IP-10-Promotor Bindung

die Wirkung von PML auf IFN-γ-induzierten STAT-1-DNA
10-IP-Promotor Bindung wurde weiter untersucht. PML-Protein-Überexpression in NIH3T3-Zellen nach transienter Transfektion mit dem PML IV Expressionsvektor, teilblockierten IFN-γ-induzierter STAT-1-DNA-Bindung an die IP-10-Promotor, einschließlich der Sequenz bei -246 bis -238 (7A, zu vergleichen, Spuren 3 und 5). Wettbewerb eine 100-molaren Überschuss unmarkierten Oligonukleotid kodiert, die IP-10-Promotors außer Kraft gesetzt Komplexbildung (Bahn 6). Die Pegel von PML und STAT-1-Proteinexpression in Ganzzell-Lysaten (WCL) und das Ausmaß der STAT-1-Tyrosinphosphorylierung in Kernextrakten (NE) wurden durch Immunoblotting nachgewiesen. Unter Verwendung NE von NIH3T3- Pml
siRNA erhaltenen Zellen nach 0,5 h von IFN-γ-Behandlung, um eine starke Bindung der Maus-IP-10-Promotor beobachtet wurde (7B, obere Platte, Bahn 5), im Vergleich zu Bindung gesehen in NIH3T3-Kontroll-siRNA-Zellen (Spur 3). Die gleichen NEs auf die STAT-1 Konsensus-Oligonukleotid ausgesetzt waren, und STAT-1 DNA-Bindung wurde in NE von NIH3T3- Pml
siRNA Zellen verbessert (7B, Mitteltafel, vergleiche Bahnen 3 und 5). Verwendung SNU-638 Zellen, Magenkrebs, fanden wir auch, dass STAT-1 DNA Bindung von Pml
siRNA-transfizierten SNU-638-Zellen erhöht war im Vergleich zu der Kontroll-siRNA-transfizierten Zellen nach Behandlung mit IFN-γ (7C, vergleiche Spuren 3 und 5). Diese Daten zeigen, dass PML teilweise inhibiert STAT-1-Bindung an die IP-10-Promotor, und dass dieser Effekt ist mit einer erhöhten IFN-γ induzierte IP-10-Transkription in der Abwesenheit von PML korreliert.

Diskussion

Histopathologische Studien gezeigt haben, dass die entzündliche Mikroumgebung von Tumoren durch die Gegenwart einkerniger Zellinfiltrate, die beide in den Stütz Stroma und Tumorregionen charakterisiert. Allerdings sind die genauen Mechanismen, durch die mononukleären Zellen infiltrieren in und innerhalb von Krebsgewebe aufrechterhalten werden derzeit nicht vollständig verstanden. In der vorliegenden Studie, bieten wir den Beweis, dass der Verlust der Expression des Tumor-Suppressor-Protein, PML, zur Erhöhung der Lymphozyteninfiltration in Magenkrebsgewebe beiträgt, über
Regulierung der IP-10-Expression.

Wir untersuchten die Funktion von PML in Bezug auf Lymphozyten-Rekrutierung unter Verwendung von menschlichen Magenkrebsgewebeproben, Pml
<sup>+ /+ und Pml
- /- MEFs und PML Zuschlag in beide NIH3T3 und SNU-638-Zellen. Die Daten erhalten sowohl menschliche Gewebetests und die Transwell-Migrationsassays zeigten, dass der Verlust von PML-Lymphozyten Handel fördert; so suchten wir Mechanismen, die diese Beobachtungen möglicherweise erklären könnte. Wir zeigen, dass eine Erhöhung der IP-10 Level in Krebszellen exprimieren geringe Mengen an PML zu Lymphozyteneinstellungs beiträgt. Zusätzlich Migration IP-10 neutralisierende Antikörper inhibierte T-Zelle in Richtung auf konditioniertes Medium aus NIH3T3 Fibroblasten und SNU-638 Magenkrebszellen in vitro
, im Einklang mit den Ergebnissen von mehreren früheren in vivo Studien
die zeigten, dass die Neutralisation von IP-10 unterdrückt T-Zell-Rekrutierung [39], [40]. Nach bestem Wissen ist dies die erste Studie, die zeigt, dass der Tumor-Suppressor, PML, reguliert IP-10-Chemokin-Transkription und Lymphozyten Handel bei Magenkrebs, indem es die Aktivität des IFN-γ /STAT-1-Signalweg zu modulieren.</sup>

IP-10, ein Lymphozyten-Targeting-CXC-Chemokin durch Typ I und II Interferone induziert, spielt eine wichtige Rolle bei der Lymphozyten-Rekrutierung unter mehreren entzündlichen Erkrankungen [41]. IP-10 wird von tumorinfiltrierenden Immunzellen sezerniert wird, und auch von tumoralen und Parenchymzellen in einer Interferon- und Zytokin-angereicherten Mikroumgebung. TAFs von Lungenkrebspatienten konstitutiv produzieren und IP-10 [27] absondern. Hepatozyten mit dem Hepatitis-C-Virus infiziert erzeugen IP-10, und veran Migration von aktivierten T-Zellen an das Leberparenchym, was darauf hinweist, daß IP-10 Ebenen mit histologischen Schwere und Entzündung korreliert sind [42]. In unserem System wurde IP-10-Sekretion in Magenkrebs SNU-638-Zellen beobachtet, NIH3T3 Fibroblasten und MEFs, in Reaktion auf IFN-γ und Sekretion wurde in Abwesenheit von PML-Protein-Expression verstärkt. Da fanden wir, dass es in der Ebene der STAT-1-Expression und Phosphorylierung in Abwesenheit oder Gegenwart von PML auf IFN-γ (3 und 7), erhöhte IFN-γ induzierte IP-10-Transkription in Abwesenheit keine nennenswerten Unterschiede von PML wurde vor allem durch verbesserte STAT-1-DNA-Bindung an IP-10-Promotor verursacht. Wir schlagen vor, dass PML-vermittelte Hemmung der STAT-1-DNA führt zur Unterdrückung von STAT-1-abhängige IP-10-Expression Bindung, in Übereinstimmung mit unseren früheren Befunden [17]. In der vorliegenden Studie haben wir eine mögliche regulatorische Region für PML in der IP-10-Promotor, der ein mutmaßliches STAT-1-Bindungsstelle ist. Weiterhin zeigen wir, dass PML Zuschlags erhöht IFN-γ-induzierter STAT-1-DNA in die IP-10-Promotor bindet, und verbessert IP-10 Level in Abwesenheit von PML.

Lymphozyten, Neutrophilen, Makrophagen und Mastzellen sind die Hauptkomponenten der meisten Tumor Infiltrate. Tumor-infiltrierende Lymphozyten wurden in einer Vielzahl von festen Krebsgeweben identifiziert. Allerdings bleiben die spezifischen Funktionen solcher Zellen in Tumoren und die genauen molekularen Mechanismen der Lymphozyten-Rekrutierung in Tumoren, kontrovers diskutiert. Der Status und die funktionelle Relevanz von CD8 ^{+ T-Zell-Infiltration in Tumoren und die Vereinigung solcher Zellen mit der Prognose der Patienten, sind ebenfalls unklar. Bei Nierenzellkarzinom, Infiltration von CD8 + T-Zellen mit günstigen Prognose assoziiert [43]. Im Gegensatz dazu wird eine solche Infiltration ungünstige Prognose bei nicht-kleinzelligem Lungenkrebs-Patienten verbunden [33]. Wir zeigen hier, dass PML-Protein-Expression in Tumorzellen umgekehrt mit dem Ausmaß der Infiltration von CD8 + T-Zellen in Tumorgewebe korreliert. Wenn die Funktion von PML in Lymphgefäßinvasion betrachtet wird zusammen mit dem Zusammenhang zwischen der PML-Expression und ungünstige Prognose [2], ist es offensichtlich, dass eine Beziehung zwischen klinischen Merkmalen und dem Ausmaß der CD8 + T-Zell-Infiltration bei Patienten Magenkrebs bedarf weiterer Aufklärung.}

Nuclei der normalen Magenschleimhaut Drüsen, Stroma-Gewebe, und waren lymphatischen Zellen diffus immunopositive (moderate-to-starke) für PML-Protein-Expression, während Ebenen PML reduziert wurden oder in Tumorzellen abgeschafft (Abbildung 1). Diese Ergebnisse unterstützen die Idee, dass Krebszellen spezifische Abbaumechanismen für PML haben. Wir schlagen vor, dass post-translationale Proteasom-abhängigen Abbau der Verlust von PML-Protein erklärt. Mit anderen Worten, Abbau auf der Transkriptionsebene ist nicht operative [2], [44]. PML-Protein-Expression wird in vielen verschiedenen Krebsarten reduziert oder abgeschafft, einschließlich Prostata-, Brust-, ZNS, Darm-, Lungen- und Magenkrebs [2], [3]. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen haben wir beobachtet, reduzierte oder vernachlässigbare Expression von PML bei fortgeschrittenem Magenkrebs Gewebe. Zudem legen unsere Ergebnisse nahe, dass Krebszellen verschiedenen Ebenen des PML-Proteins unterscheiden sich in ihrer Fähigkeit Lymphozyten in Tumorbereichen zu gewinnen und zu halten ausdrücken, so ein weiterer Beweis, nach denen derartige Zellen aktiv an der Einrichtung von entzündlichen Tumormikroumgebung teilnehmen, über
Mechanismen-PML vermittelt.

NF-kappaB und STAT-3-Signalisierung als wichtige Regulierungssysteme dienen vorgeschlagen Verknüpfung Entzündung an Krebs [45]. IL-6, ein NF-kappaB-abhängige Faktor Entzündungswachstum, ist wesentlich für die Entwicklung von entzündungsbedingten Karzinogenese [46]. Jüngste Indizien hat die Idee weiter gestärkt, dass die IL-6 /gp130 /STAT-3-Signalisierungs Achse als beide dient eine autokrine und parakrine Verstärkung Schleife in Lungenadenokarzinom, multiples Myelom, Ras-transformierten Krebszellen und eine Colitis-assoziierten Krebsmodell [47], [48], [49], [50]. PML hat sich gezeigt, IL-6-induzierte STAT-3-Aktivität [51], zur Unterdrückung der Apoptose über
einen TNF-vermittelten Prozess zu fördern, und Zellen Apoptose zu sensibilisieren, indem die NF-kappaB vermittelte Überleben Hemmen Weg [52]. Es bleibt jedoch festgestellt werden, ob der Verlust der PML Tumorsuppressor auf Veränderungen der Immunantwort des Wirts oder der Tumor-Mikroumgebung beiträgt, möglicherweise in entweder resultierende immunosurveillance oder Immun escape, durch die Modulation der Transkriptionsfaktoren. Somit wäre es interessant, die Auswirkungen des Verlustes von PML-Protein-Expression auf NF &kgr; B /STAT-3 und STAT-1-Signalisierung, und um zu bestimmen, ob diese Transkriptionsfaktoren Funktion in koordinierter Weise zu vergleichen, um die Expression einer Untergruppe von zu regulieren Chemokine einen Beitrag zur Schaffung von entzündlichen Tumormikromilieus.

Materialien und Methoden

Zellen

Primäre und verewigt Pml
<sup>+ /+ und Pml
- /- MEFs wurden hergestellt und aufrechterhalten, wie zuvor beschrieben [53]. Die SNU-638 menschlichen Magen carconoma Zelllinie, Jurkat humanen T-Zell-Lymphoblasten-Zelllinie, und EL-4-Maus-T-Lymphom-Zelllinien beibehalten wurden, wie zuvor beschrieben [2], [54].</sup>

Magenkarzinom Gewebe

insgesamt 49 Magenkarzinom Paraffinblöcke von 49 Patienten gewonnen wurden (29 Männer; 20 Frauen, Durchschnittsalter 64 Jahre, Bereich 35-84), die insgesamt oder subtotale Gastrektomie für Stufe IV unterzogen hatte fortgeschritten Magenkarzinome bei Mokdong Hospital, Ewha Womans University School of Medicine, Seoul, Korea von 2001 bis 2007

Reagenzien und Antikörper

Recombinant murinen und humanen IFN-γ (mIFN-γ und hIFN- γ) und mip-10 und Hüft-10 wurden aus ProSpec (Rehovot, Israel gekauft). Antikörper an PML (mouse monoclonal) und STAT-1 wurden von Upstate Biotechnology, Inc. (Lake Placid, NY, USA) erworben und neutralisierende Antikörper gegen IP-10 von R &erworben wurde; D Systems (Minneapolis, MN, USA). Antikörper gegen p-Y701-STAT-1 wurde von Cell Signaling Technology (Beverly, MA) erworben. Antikörper gegen Histon, Lamin B und PML (polyklonalen Kaninchen) wurden von Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) erworben und Anti-Tubulin-Antikörper wurde von Sigma-Aldrich, Co. (St. Louis, MO, USA) gekauft .

Immunhistochemie, Zellzahl und die Messung von
immunoreaktiven Bereiche

Menschliche Gewebe Magenkrebs für immunhistochemischen Analyse verarbeitet wurden, wie zuvor beschrieben [2] mit geringfügigen Änderungen. Primäre Antikörper für PML (1:200; Santa Cruz Biotechnology), CD8 (01.50; Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, USA), und IP-10 (01.50; R & D Systems) wurden verwendet. Alle Folien wurden mit Mayers Hämatoxylin gegengefärbt. Positive Kontrollen wurden unter Verwendung von Tonsillen für PML-Protein und CD8 und Nasen-Rachen-undifferenzierte Karzinome für IP-10 erhalten. Negative Kontrollen wurden durch Weglassen primären Antikörper aus allen Folien erhalten. Immunopositivity für PML-Protein wurde als diffuse Positivität (nuclear Immunreaktivität in ≥50% der Tumorzellen), fokale Positivität (in ≥10%, aber < 50%) kategorisiert oder vollständigen Verlust (in < 10% der Tumorzellen). Die Zahl der CD8 immunopositive Zellen in einem Hochleistungsfeld (HPF, x40) von 0,25 mm ^{2 für fünf zufällig ausgewählten Tumor infiltrative Grenzen wurden für jede Probe gezählt, durch Berechnung der mittleren Anzahl und SD folgt. Immunopositivity für IP-10 wurde als kerntechnische oder Zytoplasma-positive Expression in Tumorzellen definiert. Für die ausgedrückt Ebene der einzelnen Folien zu bestimmen, digitale Bilder wurden mit einem Mikroskop montierten Digitalkamera erhalten. Verwendung ImageJ Software (http://rsb.info.nih.gov/ij), wobei jedes Bild in 8-Bit-Grauskala und Flächendichten umgewandelt wurde von den Pixeln in dem interessierenden Bereich gemessen wurden; nur Pixel ein bestimmtes Niveau überschreitet (> 50 -Wert Intensität). enthalten waren Hintergrund Fehler zu beseitigen}

siRNA-Transfektion

NIH3T3-Zellen transient wurden Mirus Transfektionsreagenz mit (Mirus Bio LLC, Madison,

• PLoS ONE: Das Herunterregulieren von RPL6 durch siRNA hemmt die Proliferation und Zellzyklus von menschlichen Magenkrebszelllinien
• PLoS ONE: miR-29a Hemmt Zellproliferation und induziert Zellzyklusarrest durch die Herabregulation von p42.3 in menschlichen Magenkrebs