Plos ONE: Izguba Protein promielocitno levkemijo želodčnega raka: Posledice za IP-10 izražanja in tumor-infiltracije Lymphocytes

Povzetek

raka želodca, je eden od najpogostejših vzrokov umrljivosti, povezane z rakom po celem svetu. Izraz zaviralnih, promielocitna levkemija (PML) beljakovin, se zmanjša ali odpravi v želodčnih karcinomov, v povezavi s povečano stopnjo limfnega invazije, razvoj visokega pTNM uprizarjanja in neugodno prognozo. Tukaj, smo raziskovali odnos med obsegom limfocitov-tumorske infiltracije in status PML beljakovin izražanja v napredovalim rakom želodca. opazili smo večje število infiltracije T-celic v želodčnih karcinoma tkivih, v kateri je PML izraz zmanjša ali odpravi, v primerjavi s tkivi pozitivnim PML. Obseg migracije celic T proti supernatante kulture, dobljenih iz interferona-gama (IFN-γ-stimuliranih celičnih linij karcinoma želodca je z ekspresijo PML dodatno prizadeta vitro
. Interferon-gama inducibilnih protein 10 (IP -10 /CXCL10) izraz je bil v želodčnih karcinomom tkivih poveča prikaz znižanih stopenj PML. Poleg tega sta PML
knockout in rasklapanje celice prikazane okrepljeno IP-10 mRNA in beljakovin izraz v prisotnosti IFN-y. PML rasklapanje povečana IFN-γ-posredovano signalov pretvornik in aktivator transkripcije-1 (STAT-1) veže na promotor IP-10, zaradi česar povišani transkripcijo gena IP-10. Nasprotno pa PML IV proteinski izraz zatreti IL-10 aktiviranje promotorja . na podlagi teh rezultatov, predlagamo, da izguba PML beljakovin izražanja v želodčnih rakavih celic, prispeva k večji IP-10 prepisu preko
izboljšanje STAT-1 aktivnostjo, ki je, po drugi strani spodbuja trgovino limfocitov v tumorskih regijah .

Navedba: Kim HJ, Song DE, Lim SY, Lee SH, Kang JL, Lee SJ, et al. (2011) Izguba Protein promielocitno levkemijo želodčnega raka: Posledice za IP-10 izražanja in Tumor-infiltracije limfocitov. PLoS ONE 6 (10): e26264. doi: 10,1371 /journal.pone.0026264

Urednik: Yoshio Yamaoka, veteranov zadeve Medical Center (111D), Združene države Amerike

Prejeto: 21. april 2011; Sprejeto: 23. september 2011; Objavljeno: 12. oktober 2011

Copyright: © 2011 Kim et al. To je odprtega dostopa članek razširja pod pogoji Creative Commons Attribution License, ki omogoča neomejeno uporabo, distribucijo in razmnoževanje v katerem koli mediju, pod pogojem, da prvotni avtor in vir knjižijo

Financiranje:. To delo je bila podprta z raziskovalnega programa osnovne Science prek nacionalnega Research Foundation Koreji (NRF), ki jih je Ministrstvo za šolstvo, znanost in tehnologijo (2010-0015506) do Y-HC financira, državni Research Foundation Koreje (NRF) financirani ki ga Korea vlade (MEST) (2010-0029353), da JLK, in RO1 NS50665 do ENB. Med financerji imel nobene vloge pri oblikovanju študije, zbiranje in analizo podatkov, sklep, da se objavi, ali pripravi rokopisa

nasprotujočimi si interesi.. Avtorji so izjavili, da ne obstajajo konkurenčni interesi

Uvod

rak želodca je eden od najpogostejših vzrokov smrti, povezanih z rakom po celem svetu. Nedavni napredki v genetiki so omogočili odkritje dogodki med želodca karcinogeneze, vključno z aktivacijo onkogenov, utišanje od zaviralnih genov in mutacije genov, vključenih v popravilu DNK [1]. Med temi genskih pojavov, je znano, da je tumor supresorski promielocitna levkemija (PML) protein izraz zmanjša ali odpravi na raka želodca, in da je to povezano z bolj obsežno limfnega invazije, višji pTNM uprizarjanja in neugodne napovedi, ki kažejo, da je izguba PML povezano z napredovanjem nastanek raka in želodčnega karcinoma [2]. Prejšnje študije vpleten PML
disfunkcija pri napredovanju različnih vrst raka, in zmanjša ali odpravi izražanja PML so poročali v prostate, raka dojke, osrednjega živčevja, debelega črevesa, pljuč in želodca raka [2] [3] .

PML
gen je bil prvotno označene z zlitjem z receptorjem retinske kisline, ki sodeluje pri t (15; 17) kromosomsko translokacijo povezana z akutno promielocitno levkemijo (APL) [4], [ ,,,0],5] [6] [7] [8]. PML je tumor supresorski protein, ki uravnava potek celičnega ciklusa, prepisovanje genov, zatiranja pretvorbe in apoptozo. PML
knockout miši so bistveno bolj občutljivi za nastanek tumorja po izpostavljenosti rakotvornim snovem, kot so nadzor divjega tipa, in PML
-deficient celice so manj verjetno, da poteče apoptoza po uporabi posebnih vrst celični stres [9]. Poleg poročil s poudarkom na vlogi zaviralnih s PML igral, so številne študije potrdile, da so beljakovinski deluje kot transkripcijski regulator, preko
povezavi z koaktivator CREB veže beljakovine; co-represorji vključno HDAC, N-OR, in mSin3A; in transkripcijske faktorje Nur77, AP-1, myc, p53 in STAT-1 a [10], [11], [12], [13], [14], [15] [16], [17].

Progressive mutacij in genetske spremembe v nekaterih zaviralnih genov spodbuja razvoj tumorja in napredovanje [18]. Poleg genetskih sprememb v tumorskih celicah, tako vnetne celice in mediatorji prispevajo k oblikovanju posebne tumorskih mikrookolje [19], [20]. Povezane s tumorjem fibroblasti (TAFs) in makrofagov (TAMs) so vključeni tudi v modulacijo mikrookolja tumorja preko
produkcijo citokinov, kemokinov, interferoni, in drugih biološko aktivnih dejavnikov [21], [22]. Cross-talk med tumorskih celic, TAFs, mutacij timidinskih analogov in limfocitov, je pomembno za razvoj in napredovanje tumorjev, ter prispeva k vzpostavitvi tumorskih mikrookolje, obogaten z izražanjem različnih biološko aktivnih dejavnikov [23] [24] [25] [26] [27].

Blagajniške naprave so ugotovili, da v korelaciji z angiogenezo in neugodno prognozo na več vrst raka, vključno z rakom želodca [22], [28]. Mast celica proizvaja veliko angiogenim dejavnike in različne citokini, in njegova gostota, so poročali, da visoko korelira z obsegom tumorja neoangiogenesis in slabo prognozo [29], [30]. CD4 ^{+ in CD8 + limfociti najdemo tudi v različnih trdnih tkiv raka. Do sedaj so natančni molekularni mehanizmi, s katerimi so urejene vrsta in število razraščati celic tumorjev so večinoma neznani. Obstaja več spornih poročil v zvezi s številom in funkcije limfocitov, tumorske infiltracije. Še posebej, CD8 + T limfocitov, medtem ko je njihova funkcija je znano, da odpravi nastajajoče transformiranih celic in prispevajo k imunski nadzor [31], je poročalo, da so CD8 +-tumorske infiltracije celice T pomanjkljiva efektor fazo delovanja ob stiku s tumorskimi celicami [32], in njihova infiltracija je povezan z neugodno prognozo z nekaterimi vrstami raka, kot so 'nemajhen' celičen pljučnega raka in nazofaringealnega karcinoma [33], [34].}

kemokini s stromalnih celic ali tumorja izločajo celice vplivajo na migracijo tumorskih celic, invazijo, širjenje, angiogenezo ter infiltracijo imunske celice v masi tumorja [35]. IFN-γ-inducibilen protein-10 (IP-10, CXCL10) je eden izmed kemokinov CXC ki ima številne vloge pri vnetnih bolezni in raka [36], [37]. Ker IP-10, prednostno spodbuja TH1 imunske odzive, ki jih odločno privabljanje NK in T celice, je bilo predlagano, kot enega od možnih mehanizmov T-celične infiltracije v tumorjih.

Ali izguba zaviralnih genov v tumorskih celicah inducira rekrutiranje limfociti in modulacijo funkcij teh celic v tumor mikrookolje je trenutno nejasna. V tej študiji, smo pregledali funkcijo PML v zvezi z zaposlovanjem limfocitov in moduliranje ekspresije tumor izvira dejavnikov. Izraz PML je obratno povezana z obsegom infiltracijo CD8 ^{+ T-celic v želodčnih karcinomov. Izguba PML je nadalje povezana s povečano ekspresijo IL-10, eden-limfocitov privabljanje CXC kemokinov, v želodčnih karcinoma celic in tkiv. PML rasklapanje napredoval IFN-γ-posredovano STAT-1 vezave na promotor IP-10, za posledico povečano transkripcijo gena IP-10. Naši podatki podpirajo idejo, da je PML sodeluje pri zaposlovanju limfocitov v tumorjev, preko
modulacijo ravni izraženosti tumor izvira dejavnikov, vključno z IP-10, ki zagotavlja dodatne dokaze, da je izguba zaviralnih genov v tumor celice aktivno sodeluje pri oblikovanju tumorskih mikrookolje.}

Rezultati

Izguba PML beljakovin, je povezana z večjim infiltracijo CD8 ^{+ T-celice v naprednih želodčnega karcinoma tkiva}

Imunohistokemijsko za PML in CD8 je bila izvedena, da razišče, ali je bil obseg limfocitov infiltracijo povezano s PML statusom ekspresije v napredovalem raku želodca. CD8-immunopositive celice so našteti, kot je opisano v Materiali in metode. Skupaj je 35 vzorcev (71,4%) je pokazala, delno do popolno izgubo PML pri jeder tumorskih celic v fazi IV naprednih želodca karcinomov. Vzorci iz 14 bolnikih z napredovalim želodca karcinomom so difuzno pozitivna za PML in vsebuje v povprečju 32,7 CD8 ^{+ T-celic na polje (slika 1A). Identificirali smo 19 primerkov napredovalim rakom želodca, ki kažejo osrednjo pozitivnost za PML, s povprečjem 47,2 CD8 + T-celic na terenu. Poleg tega je bila opažena popolna izguba PML pri 16 bolnikih z napredovalim karcinomom želodca; vzorci vsebujejo povprečno število 52,8 CD8 + T-celic na terenu. Vzorci, ki prikazujejo goriščno pozitivnosti ali popolno izgubo za PML pokazala bolj izrazito povečanje CD8 + številko T-celic kot storil vzorci kažejo razpršeno pozitivnost za PML. Reprezentativne slike so prikazane na sliki 1B. Čeprav je PML proteinski izraz zmanjša ali odpravi v tumorskih celicah, vse običajne želodčnih sluzničnih žlez, stromalnih tkiv in limfnih celic, razstavljene razpršeno zmerne do močne jedrske immunopositivity za PML.}

PML vplivi T-celične infiltracije /migracije in vitro

Zaradi izgube PML beljakovin izražanja in povečanje infiltracije CD8 ^{+ T-limfocitov v naprednih želodca karcinomom tkiv, smo predpostavili, da PML prispevala na T-celice infiltracijo /migracije pri raku želodca. Raziskati, ali je raven PML v želodčnih rakavih celicah pod vplivom T-celične migracije, pogojena medij iz celic snu-638 prehodno transfekciji bodisi s PML
siRNA ali PML IV izražanja vektor, nato obdelali z IFN-γ je bil uporabljen v transwell migracijske teste. Snu-638 želodca rakave celice izrazili visoko stopnjo PML beljakovin, v skladu s predhodnimi ugotovitvami [2], medtem ko snu-638 celic transfekciji s PML
siRNA prikazane zniža raven endogenega PML izražanja (~46-56%) , kar potrjuje imuno (slika 2A). IFN-γ povzroča skromno povečanje PML beljakovin izražanja, v soglasju s prejšnjimi rezultati [38]. Migracija Jurkat T-celice proti kondicioniranega medija z PML
snu-638 celic-siRNA transfektiramo je znatno povečala, v primerjavi s kontrolo celic siRNA transficirana po obdelavi z IFN-y (slika 2B). Po transfekcija snu-638 s PML IV ekspresijski vektor, migracije Jurkat T-celice proti kondicioniranega medija iz PML IV prekomerno celicah je bila zmanjšana v primerjavi s praznega vektorja (slika 2C). Ti rezultati kažejo, da PML uravnava raven izločevalnih molekul ki jih proizvaja in sprostijo IFN-y-stimulirane želodčne rakavih celic, pa tudi vpliva migracije T- limfocitov.}

Izguba PML povečuje IFN-y-induciranih IP-10 izraz

Kemokini, družina kemotaktične citokinov, spodbujajo migracijo obtoku levkocitov /limfocitov na mesta vnetja in poškodbe. Raziskati, ali so bile ravni kemokinskih vplivala PML
genetsko stanje, je kemokin izražanje genov preverja z zaščito ribonukleazo testom (RPA). PML
<sup>+ /+ in PML
- /- miš embrionalnih fibroblastov celice (MEF) inkubiramo v odsotnosti ali prisotnosti IFN-y za 0-24 h je bilo skupno mRNA zbirajo na različnih časih, in izpostavi RPA. V PML
- /- MEFs, IP-10 nivoji mRNA povečala za 1,5-krat na 2 uri in je postal izrazito povišane (8-krat), za 4 ure (slika 3A). Ravni RANTES mRNA je povečala 3,2-krat na 0,5 ure, in ostala visoka, vendar v manjši meri (1,3-krat), 8 h zdravljenje post-IFN-y v PML
- /- MEFs . Drugi kemokinskih geni, vključno z MIP-1, MIP-2, in MCP-1, niso bili odkriti, izražena v PML
+ /+ ali PML
- /- MEFs (podatki niso prikazani). STAT-1 izraz, se je povečala po izpostavljenosti na IFN-y pri obeh vrstah celic, vendar nobena razlika je bila očitna, ko smo primerjali vrednosti IFN-y med PML
+ /+ in PML
- /- celice. Kot je prepis gena IP-10 znatno povišano IFN-y-stimulirane PML
- /- MEFs smo merili ustrezne ravni beljakovin v supernatante kulture v PML
+ /+ in PML
- /- MEFs, z uporabo imunskim testom encimsko (ELISA). V skladu z rezultati RPA, je bilo višje stopnje IP-10 beljakovin očitno v pripravljenih mediju od zdravljeni IFN-γ PML
- /- MEFs (slika 3B). Tudi IP-10 mRNA izraz v PML
-siRNA transfektirana NIH3T3 celic bila izboljšana v primerjavi s kontrolo celic siRNA transficirana po IFN-y obdelavo (slika 3C). Zmanjšanje izražanje PML beljakovin v PML
-siRNA transfekcije NIH3T3 celic je bila potrjena z imuno.</sup>

Zmanjšana PML izraz je obratno povezana z IP-10 raven beljakovin v želodcu tkivu raka in SNU- 638 celic

Nato smo opisali odnos med OP-10 in PML beljakovin izražanja v naprednih želodca karcinoma tkiva. Rak tkiva smo imunohistokemično obarvali za PML in OP-10, in intenzivnost IP-10 immunopositivity je bila izmerjena, kot je opisano v Materiali in metode. Povprečna intenzivnost IP-10 je bila 1,2 na 14 vzorcev z razpršeno pozitivnosti (DP) za PML, 2,2 v 19 primerih osrednja pozitivnosti (FP), in 2,0 pri 16 vzorcev, v katerih je bila popolna izguba (CL) za PML izražanja ( Slika 4A, leva plošča). V vzorcih so opazili pomembno povečanje IP-10 izražanja prikazuje goriščno pozitivnost za PML ( P
= 0,034), v primerjavi s tistimi, ki prikazuje razpršeno pozitivno PML izraz. Povečanje IP-10 izražanja, so opazili, ko je bila popolna izguba PML razvidno, v primerjavi s tem, kar so opazili, ko je bil PML difuzno izražena; Vendar pa ta razlika ni dosegla statistične značilnosti. Reprezentativni primeri razlik v statusu PML proteina, ki soodvisnih z različnimi IP-10 nivojev ekspresije v tumorskih celic naprednih želodčnega karcinoma so prikazani (slika 4A, desno). Da bi še dodatno preuči razmerje med IP-10 in PML beljakovin izražanja v želodcu celičnih linij karcinoma, IP-10 količina beljakovin so bile izmerjene v supernatante kulture iz celic snu-638 prehodno transfekciji bodisi s PML
siRNA ali PML IV exression vektor. Celice smo gojili v odsotnosti ali prisotnosti IFN-y za 8 ur, zberemo supernatante in nivoji IP-10 v njej količinsko (ELISA). IFN-γ-inducirane IP-10 izločanje je znatno povečala v snu-638- PML
-siRNA transfekcije celice, v primerjavi s tisto snu-638 celic, transfektiranih s kontrolno siRNA (slika 4B). Transfekcija snu-638 s PML IV ekspresijskim vektorjem zatreti IFN-γ-inducirano izločanje IP-10 (slika 4C). Rezultati jasno kažejo, da se izločanje IP-10 iz želodca rakavih celic poveča, če se PML izraz zmanjša.

IP-10 nevtralizacijo zmanjšuje migracijo celic T

Kot snu-638- PML
celice, ki vsebujejo siRNA izražajo nižjih ravni PML beljakovin pokazala povečanje zaposlovanja T-celic in IP-10 izločanja v odgovoru na IFN-y (sliki 2 in 4), smo poleg preučila, ali povečanje IP- 10 stopenj olajšala migracijo T-celic proti pogojeno mediju od snu 638-želodčnih rakave celice, ki jih IFN-y stimulirane. Snu-638- PML
siRNA celice gojimo v odsotnosti ali prisotnosti IFN-y za 8 ur in zbrane supernatante smo obdelali z anti-IP-10 nevtralizirajočih protiteles ali nadzora nespecifičnega IgG za 1 h pred začetkom transwell testom. Nevtralizacijo protiteles ali IgG, ki vsebujejo supernatante so bili dani v nižjih komorah, in je bil analiziran migracija Jurkat celic iz zgornje nižje zbornice s preučevanjem celic pridobljenega iz spodnjih domov. Vključitev IP--10 nevtralizacijo protiteles zavirajo Jurkat migracije T-celic proti kondicioniranega medija iz snu-638- PML
siRNA celic (slika 5A). Te ugotovitve so skladne s podatki iz NIH3T3 celic; IP-10-nevtralizacijo protitelo zaviral EL-4 T-celične migracije proti pogojeno mediju od NIH3T3- PML
siRNA celice (slika 5B).

PML rasklapanje krepi IP-10 aktivacijo promotorja

Kot je IP-10 izraz v PML rasklapanje celicah povečana, smo podrobneje preučiti, ali PML protein izraz vpliva na IP-10 promotor aktivnost. Glodalski IP-10 promotor vsebuje domnevnega GAS podoben element, ki se nahaja med NTS -246 in -238 (TTN _{5aa) (slika 6a). Smo že poročali, da PML negativno ureja transkripcijske aktivnosti STAT-1 [17]. Da bi ugotovili, ali PML prizadela IFN-γ-inducirano IP-10 izražanje genov preko
mehanizmom, ki vključuje STAT-1, smo izolirali in ustvarili reporterski konstrukt, z začetkom na mestu -330 v mišje IP-10 promotorja, ki vsebuje domnevni GAS podoben element, kot je opisano v Materiali in metode. IP-10- luc
reporterski vsebuje GAS podoben element smo prehodno transfektirali v NIH3T3 celic inkubiranih z ali brez IFN-y za 24 ur, nato testiramo za luciferazno aktivnost. IFN-γ-inducirane IP-10 promotor aktivnost se je znatno povečala v celicah NIH3T3 transfekciji s PML
siRNA, v primerjavi s celicami, ki so prejemali kontrolni siRNA (slika 6B). Po transfekcija NIH3T3 celic s PML IV ekspresijskega vektorja, smo IFN-γ-inducirano IP-10 aktiviranje promotorja bistveno zatrta. Downregulation za PML izražanja z uporabo PML
siRNA in prekomerno PML s PML IV izraz vektor so bili preverjeni s imuno. Če želite ugotoviti, ali je prišlo do zaviralni učinek PML na IFN-γ-inducirane IP-10 promotorja aktivnosti v želodcu raka celičnih linij, smo izvedli podobne poskuse z snu-638 želodca rakavih celic. Vzorci povečanje in zmanjšanje luciferazne aktivnosti v snu-638 je bila podobna tisti NIH3T3 celic (slika 6C). Stopnja PML beljakovin izražanja v 638 snu celicah transfekciji s ali PML
siRNA ali PML IV izražanje vektor je preveril imuno (podatki niso prikazani).}

PML rasklapanje poveča IFN-γ- povzročene STAT-1 DNA vezavo na promotor IP-10

učinek PML na IFN-y-inducirane STAT-1 DNA veže na promotor IP-10 je bil podrobneje proučiti. PML protein prekomerno v celicah NIH3T3, po prehodno transfekciji s PML IV ekspresijskega vektorja, delno blokirana IFN-γ-inducirano STAT-1 DNA vezavo na promotor IP-10, vključno z zaporedjem pri -246 do -238 (slika 7A, primerjati progi 3 in 5). Konkurenca z uporabo 100-molarno presežek brez oznake oligonukleotid, ki kodira promotor IP-10 razveljavilo kompleksno tvorbo (proga 6). Ravni PML in STAT-1 proteina izražanja v celih celic lizatov (WCL) in obseg STAT-1 tirozin fosforilacijo v jedrski izvlečki (NE), so bili preverjeni s imuno. Uporaben NE od NIH3T3- PML
siRNA celice, pridobljeno po 0,5 h zdravljenja IFN-y, močno veže na mišje IP-10 promotorja opazili (slika 7B, top plošče, lane 5), v primerjavi z vezavo videli v siRNA celicah NIH3T3 nadzora (proga 3). Iste-jev so bili izpostavljeni STAT-1 soglasja oligonukleotida in vezavo STAT-1 DNA je bil razširjen v SV od NIH3T3- PML
siRNA celice (Slika 7B, srednja plošča, primerjati steze 3 in 5). Uporaba snu-638 želodčne rakave celice, smo ugotovili tudi vezi, ki STAT-1 DNA PML
snu-638 celic-siRNA transfekcije je bil izboljšan v primerjavi s kontrolnih celic-siRNA transfekcije, po zdravljenju z IFN-y (Slika 7C, primerjati steze 3 in 5). Ti podatki kažejo, da PML delno zavira STAT-1 vezave na promotor IP-10, in da je ta učinek povezana s povečano IFN-γ-inducirane IP-10 transkripcijo v odsotnosti PML.

Diskusija

študije Histopatološka so pokazale, da je vnetna mikrookolje tumorjev je značilna prisotnost mononuklearnih infiltratov celic, tako podpornih strome in tumorskih regij. Vendar pa natančne mehanizme, s katerimi mononuklearnih celic infiltrirajo v in potekajo kontinuirano v tumorskih tkivih trenutno ni povsem jasno. V tej študiji ponujamo dokaz, da izguba izražanja zaviralnih beljakovine, PML, prispeva k povečanju limfocitov infiltracijo v želodcu tkivo raka, z
urejanja IP-10 izražanja.

preučila smo funkcijo PML v zvezi z zaposlovanjem limfocitov uporabo želodčne vzorcev človeške rak tkiv, PML
<sup>+ /+ in PML
- /- MEFs in PML rasklapanje tako NIH3T3 in snu-638 celic. Podatki, pridobljeni od obeh testov človeških tkiv in migracije teste transwell pokazala, da je izguba PML spodbuja trgovine limfocitov; Tako smo iskali mehanizme, ki bi morda pojasnjujejo te ugotovitve. Pokazali smo, da je povišanje koncentracije v IP-10 pri rakavih celic, ki izražajo nizko stopnjo na PML prispeva k zaposlovanju limfocitov. Poleg tega so IP-10 nevtralizirajočih protiteles zaviral migracije T-celic proti kondicioniranega medija iz NIH3T3 fibroblastov in snu-638 želodčnih rakavih celic in vitro
, v skladu z rezultati številnih prejšnjih in vivo
študij , ki je pokazala, da je nevtralizacija IP-10 zatreti T-celic zaposlovanja [39], [40]. Kolikor nam je znano, je to prva študija, ki kaže, da je tumor supresorski, PML, ureja IP-10 kemokin prepis in trgovina limfocitov pri raku želodca, s spreminjanjem aktivnosti IFN-γ /STAT-1 signalne poti v.</sup>

IP-10, a-limfocitov ciljanje CXC kemokin po vrsti I in IFN II povzroča, igra pomembno vlogo pri zaposlovanju limfocitov v okviru različnih vnetnih stanj [41]. IP-10 se izloča z imunskimi celicami tumorja infiltracije, in tudi tumorskih in parenhima celic v interferon in citokinov obogateni mikrookolju. TAFs od bolnikov z rakom pljuč konstitutivno proizvajajo in izločajo IP-10 [27]. Hepatocite okuženi z virusom hepatitisa C izdelavo IP-10, in izzove migracije aktiviranih T-celic v parenhima jeter, kar kaže, da so nivoji IP-10 korelaciji s histološko resnostjo in vnetja [42]. V našem sistemu, je IP-10 izločanje opazili pri raku želodca snu-638 celic, NIH3T3 fibroblastov in MEFs v odgovoru na IFN-y, in izločanje bil povečan v odsotnosti PML beljakovin izražanja. Ker smo ugotovili, da ni bilo bistvenih razlik v stopnji STAT-1 ekspresijo in fosforilacijo v odsotnosti ali prisotnosti PML ob IFN-y (sliki 3 in 7), povečana IFN-γ-inducirano IP-10 prepisovanje v odsotnosti PML je bila predvsem posledica okrepljenega STAT-1 DNA veže na IP-10 promotorja. Predlagamo, da PML-dosežene inhibicije z STAT-1 DNA vezave vodi k zatiranju STAT-1 odvisna od IP-10 izražanja, v soglasju z našimi prejšnjimi ugotovitvami [17]. V tej študiji smo identificirati potencialno regulativno regijo za PML v promotorja IP-10, ki je domnevni STAT-1-vezavno mesto. Poleg tega smo pokazali, da PML rasklapanje poveča IFN-γ-inducirane STAT-1 DNA veže na promotor IP-10, in povečuje IP 10-ravni v odsotnosti PML.

limfociti, nevtrofilci, makrofagi, in mastociti so glavne sestavine večine tumorskih infiltratov. limfocitov-tumorske infiltracije so bile ugotovljene v različnih trdnih tkiv raka. Vendar posebne funkcije teh celic v tumorjih in natančen molekularni mehanizmi za zaposlitev limfocitov v tumorjih, še vedno sporna. Status in funkcionalno ustreznost CD8 ^{+ T-celic infiltracijo v tumorjih in združenja teh celic s prognozo bolnikov, so tudi jasno. V karcinoma ledvičnih celic, ki je infiltracija CD8 + T-celice povezane z ugodno prognozo [43]. Nasprotno pa je tako infiltracija povezana z neugodno prognozo pri bolnikih 'nemajhen' celičen pljučnega raka [33]. Tukaj smo pokazali, da je PML protein izraz v tumorskih celicah v obratni korelaciji z obsegom infiltracijo CD8 + T-celic v tumorskih tkiv. Ko je funkcija PML v limfne invazije obravnavati skupaj z združenjem med PML izražanja in neugodne napovedi [2], je razvidno, da vsa razmerja med kliničnimi značilnostmi in obsega CD8 infiltracijo + T celic pri bolnikih z rakom želodca zahteva dodatno pojasnitev.}

Jedra normalnih želodčne sluznice žlez, stromalnih tkivih in limfnih celic so difuzno immunopositive (zmerna do močna) za PML beljakovin izražanja, medtem ko so bile vrednosti PML zmanjša ali odpravi v tumorskih celicah (slika 1). Te ugotovitve podpirajo idejo, da imajo rakave celice posebnih mehanizmov degradacije za PML. Zato predlagamo, da post-translacijskih proteasoma-odvisen razpad pojasnjuje izgubo PML beljakovin. Z drugimi besedami, degradacija na transkripcijske ravni ni operativna [2], [44]. PML proteinski izraz se zmanjša ali odpravi v mnogih različnih vrst raka, vključno z prostate, dojk, CNS, debelega črevesa, pljuč in rak želodca [2] [3]. V skladu s temi rezultati, smo opazili zmanjšano ali ima zanemarljiv izražanje PML v naprednih želodčnega tkiva raka. Še več, naši rezultati kažejo, da rakave celice, ki izražajo različne stopnje PML beljakovin razlike glede sposobnosti pritegniti in obdržati limfocitov v tumorskih področjih, s čimer se zagotavlja dodatne dokaze, da take celice aktivno sodelovati pri oblikovanju vnetnih tumor mikrookolje, preko
PML-posredovano mehanizmov.

NF-κB in STAT-3 signalizacijo, naj bi služil kot glavne regulativne sisteme povezujejo vnetje raka [45]. IL-6, NF-κB odvisni vnetna rastnega faktorja, bistvena za razvoj, vnetja povezana karcinogenezo [46]. Nedavne posredni dokazi, je še okrepila zamisel, da je IL-6 /gp130 /STAT-3 signalne osi služi hkrati kot avtokrinskega in parakrin ojačevanja zanko pljučnega adenokarcinoma, multipli mielom, Ras-transformirane rakave celice, in a-kolitis povezan model, rak [47], [48], [49], [50]. PML so pokazale, da zatreti IL-6-inducirano STAT-3 aktivnosti [51], za pospeševanje apoptoze preko
postopek-TNF posredovana in senzibilizirati celice na apoptozo z zaviranjem NF-κB posredovanega preživetje pot [52]. Vendar pa je treba še ugotoviti, ali izguba zaviralnih PML v prispeva k spremembam v državi gostiteljici imunskega odziva ali mikrookolja tumorja, morda za posledico bodisi imunskega statusa ali imunskega izhod v sili, z modulacijo transkripcijskih faktorjev. Tako bi bilo zanimivo primerjati učinke izgube PML beljakovin izražanja na NF-κB /STAT-3 in STAT-1 signalizacijo, in ugotoviti, ali so ti transkripcijski faktorji delujejo na usklajen način za urejanje izražanje podskupini kemokini prispevajo k vzpostavitvi vnetnih tumorskih mikrookolje.

materiali in metode

Cells

Glavni in ovekovečena PML
<sup>+ /+ in PML
- /- MEFs so bili vzpostavljeni in vzdrževani kot je opisano zgoraj [53]. Snu-638 človeški želodčni carconoma celična linija, smo vzdrževali Jurkat T-celičnega limfoblastov podobne celične linije humanega in EL-4 mišje T-limfom celične linije, kot je prej opisano [2], [54].</sup>

želodčne karcinom tkiva

skupno 49 karcinomom želodca parafinskih blokov so bili pridobljeni od 49 bolnikov (29 moških, 20 žensk, mediana starost 64 let, območje 35-84), ki so prestali popolne ali delne vsote želodca v stadiju IV napredno želodčni karcinomi v bolnišnici Mokdong, Ewha Ženski University School of Medicine, Seulu v Koreji od leta 2001 do leta 2007.

Reagenti in protitelesa

rekombinantnega mišjega in človeškega IFN-γ (mIFN-γ in hIFN- γ) in MIP-10 in hip-10 so bile kupljene od ProSpec (Rehovot, Izrael). Protitelesa proti PML (miška monoklonska) in STAT-1 so bile kupljene od podeželju biotehnologijo, Inc. (Lake Placid, NY, ZDA) in nevtralizacijskih protiteles proti OP-10 je bila kupljena iz R & D Systems (Minneapolis, MN, ZDA). Protitelo p-Y701-STAT-1 je bila kupljena od signalizacijo med celicami tehnologijo (Beverly, MA). Protitelesa proti histona so Lamina B in PML (zajec poliklonalen) kupili od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, ZDA) in anti-tubulin protiteles je bila kupljena od Sigma-Aldrich, Co (St. Louis, MO, ZDA) .

Imunohistokemija so celic in merjenje imunološko območjih

človekove želodčnega tkiva raka obdelujejo za imunohistokemično analize, kot smo že prej opisali [2], z manjšimi spremembami. so bili uporabljeni primarni protitelesa za PML (1:200; Santa Cruz Biotechnology), CD8 (1:50; Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, ZDA) in IP-10 (D Systems 1:50; R &). Vsi preparati so jih nasprotno s hematoksilinom Mayer. Pozitivne kontrole so bili pridobljeni s pomočjo Nebnica za PML beljakovin in CD8 in nazofaringealni nediferencirani karcinom na OP-10. Negativne kontrole so bili pridobljeni z izpuščanjem primarnih protiteles iz vse diapozitive. Immunopositivity za PML proteina kategoriziran kot difuzno pozitivnosti (jedrski radioinkorporacijo v ≥ 50% tumorskih celic), kontaktni pozitivnosti (pri ≥10%, vendar < 50%), ali popolne izgube (v < 10% tumorskih celic). Število immunopositive celic CD8 v eni visoki področju energije (HPF, X40) z 0,25 mm ^{2 za pet naključno izbranih tumorskih infiltracijsko meja šteli za vsak osebek sledi izračun povprečnega števila in SD. Immunopositivity za IP-10 je bil opredeljen kot kateri koli jedrski ali citoplazemske pozitivnega izražanja v tumorskih celicah. Za določitev izraženo stopnjo vsakega diapozitiva, so digitalne slike, pridobljen z uporabo, mikroskopa vgrajena digitalni fotoaparat. Uporabi ImageJ programske opreme (http://rsb.info.nih.gov/ij~~HEAD=dobj), je vsaka slika pretvorili v 8-bitni obsega in območja z gostoto sive bilo merjeno od pik v regiji interesov; samo pik presega določeno raven (> 50 vrednost intenzivnost). bile vključene za odpravo napak v ozadju}

siRNA transfekciji

NIH3T3 celice so bile prehodno transfekcije uporabo Mirus transfekcijske reagenta (Mirus Bio LLC, Madison,

• Plos ONE: downregulation od RPL6 s siRNA zavira proliferacijo in Cell cikla napredovanje človeške želodčne rakave celične linije
• Plos ONE: MIR-29a zavira celično proliferacijo in inducira Cell Cycle prijetje prek downregulation za p42.3 v humani Rak želodca