Ploche ONE: Strata proteínu promyelocytovej leukémie v rakoviny žalúdka: Dôsledky pre IP-10 expresie a infiltrujúcej nádor Lymphocytes

abstraktné

rakovina žalúdka, je jednou z najčastejších príčin úmrtnosti súvisiacej s rakovinou po celom svete. Expresia nádorový supresor, promyelocytovej leukémie (PML) proteínu, znížená alebo zrušená v žalúdočných karcinómov, v spojení so zvýšeným lymfatické invázie, vývoja vyššia pTNM staging a nepriaznivou prognózou. V tomto dokumente, sme skúmali vzťah medzi rozsahom lymfocyty infiltrujúcej nádor a stavu expresie proteínu PML v pokročilom karcinómu žalúdka. Pozorovali sme vyššie počty infiltrujúcej T-bunky v tkanivách karcinómu žalúdka, v ktorom bola PML expresie zníži alebo zruší, v porovnaní s tkanivom pozitívnych na PML. Rozsah migráciu T-buniek voči kultivačných supernatantov získaných z interferónu-gamma (IFN-γ-stimulovaných bunkových línií karcinómu žalúdka bol navyše ovplyvnený expresiou PML in vitro
. Interferón-gamma-indukovatelný proteín 10 (IP -10 /CXCL10) expresie bola zvýšená v karcinómu žalúdka tkanivách zobrazovanie znížené úrovne PML. Navyše, ako PML
knockout a porazený bunky zobrazené rozšírené IP-10 mRNA a expresie proteínov za prítomnosti IFN-gama. PML porazený zvýšená IFN-γ-sprostredkované signálov snímača a aktivátor transkripcie-1 (STAT-1) viazanie na IP-10 promótor, čo má za následok zvýšené transkripcie IP-10 génu. Naopak expresia proteínu PML IV potlačená aktivácia promótorom IP-10 . na základe týchto výsledkov, navrhujeme, aby strata expresie proteínu PML v rakovinových bunkách žalúdka prispieva k zvýšeniu IP-10 transkripcie pomocou
zvýšenie STAT-1 aktivitu, ktorá na oplátku podporuje obchodovanie lymfocytov v nádorových oblastiach .

Citácia: Kim HJ, Song DE, Lim SY, Lee SH, Kang JL, Lee SJ, et al. (2011) Strata proteínu promyelocytovej leukémie v rakoviny žalúdka: Dôsledky pre IP-10 expresie a lymfocyty infiltrujúcej nádor. PLoS ONE 6 (10): e26264. doi: 10,1371 /journal.pone.0026264

Editor: Yoshio Yamaoka, záležitosti veteránov Medical Center (111d), Spojené štáty |

prijatá: 21.apríla 2011; Prijaté: 23.septembra 2011; Uverejnené: 12.10.2011

Copyright: © 2011 Kim et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Toto dielo bol podporený Basic Science Research Program prostredníctvom National Research Foundation of Korea (NRF) financovaného Ministerstvom školstva, vedy a technológie (2010-0015506) na Y-HC, u National Research Foundation of Korea (NRF) financované podľa Kórea vlády (MEST) (2010 až 0.029.353) pre JLK, a tým RO1 NS50665 do ENB. Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

Žalúdočné rakovina je jednou z najčastejších príčin úmrtí súvisiacich s rakovinou po celom svete. Nedávne pokroky v genetike umožnili detekciu udalostí, ku ktorým v priebehu žalúdku karcinogenézy, vrátane aktivácie onkogénov, umlčanie nádorových supresorových génov, a mutácie génov podieľajúcich sa na oprave DNA [1]. Z týchto genetických udalostí, je známe, že expresia tumor supresorové promyelocytovej leukémie (PML) proteínu je znížená alebo zrušená v karcinómu žalúdka, a že prevod je spojený s rozsiahlejším lymfatickou inváziu, vyššia pTNM staging a nepriaznivou prognózou, čo naznačuje, že strata PML je spojené s progresiou karcinogenézy a karcinómu žalúdka [2]. Skoršie štúdie, ktorej sa PML
dysfunkcie v progresii radu nádorových ochorení, a zníži alebo zruší expresie PML bola hlásená u prostaty, prsníka, centrálneho nervového systému, hrubého čreva, pľúc a rakoviny žalúdka [2], [3] .

PML
gén bol pôvodne identifikovaný fúziou s receptormi retinovej kyseliny sa podieľajú na t (15; 17) chromozomálnej translokácie spojené s akútnou promyelocytovou leukémie (APL), [4], [ ,,,0],5], [6], [7], [8]. PML je tumor supresorové proteín, ktorý reguluje progresiu bunkového cyklu, génovú transkripciu, potlačenie transformáciu a apoptózu. PML
knockout myši sú oveľa citlivejšie na tvorbe nádorov po expozícii karcinogénom, ako sú kontroly divokého typu, a PML
-deficient bunky sú menej pravdepodobné, že podliehajú apoptóze po aplikácii jednotlivých typov bunkový stres [9]. Okrem správ zameraných na nádorového supresor úlohe PML, niekoľko štúdií potvrdilo, že proteín pôsobí ako transkripčný regulátor, pomocou
spojenie s proteínom ko-aktivátor CREB-viažuci; korepresory vrátane HDAC, N-VR a mSin3A; a transkripčné faktory Nur77, AP-1, myc, p53 a STAT-1α [10] [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17].

Progresívny mutácie a genetické zmeny v niekoľkých nádorových supresorových génov podporu rozvoja nádoru a progresie [18]. Okrem genetických zmien v nádorových bunkách, a to ako zápalové bunky a mediátory prispievajú k tvorbe jednotlivých nádorových mikroprostredia [19], [20]. fibroblasty tumor asociované (TAF) a makrofágy (TAM), sa tiež podieľajú na moduláciu mikroprostredie nádoru pomocou
produkcie cytokínov, chemokiny, interferóny a ďalších biologicky aktívnych faktorov [21], [22]. Cross-talk medzi nádorovými bunkami, TAFs, TAM, a lymfocyty, je významný vo vývoji nádoru a progresiu, a podieľa sa na vzniku nádorových mikroprostredie obohatených expresiu rôznych biologicky aktívnych faktorov [23], [24], [25] , [26], [27].

TAM sa zistí, že koreluje s angiogenézou a nepriaznivou prognózou u niekoľkých typov rakoviny, vrátane rakoviny žalúdka [22], [28]. Mastocytov produkuje veľa angiogénnych faktorov a rad cytokínov, a jeho hustota bola označená na vysoko koreluje s rozsahom nádoru patologickej angiogenéze a zlou prognózou [29], [30]. CD4 ^{+ a CD8 + lymfocyty sú tiež nájdené v rôznych pevných rakovinových tkanív. Až doteraz presné molekulárne mechanizmy, ktorými sú druh a počet nádorových buniek infiltrujúcich regulované sú do značnej miery neznámy. Existuje niekoľko správ kontroverzné vzhľadom na počet a funkciu lymfocytov infiltrujúcej nádor. Najmä CD8 + T lymfocyty, zatiaľ čo ich funkcia je známe, že odstránenie vznikajúcich transformovaných buniek a prispievajú k imunologického [31], sa uvádza, že CD8 + infiltrujúcej nádor T bunky sú chybné v efektorové fáze funkcie po kontakte s nádorovými bunkami [32], a ich infiltrácia je spojený s nepriaznivou prognózou u určitých typov rakoviny, ako je nonsmall karcinómu pľúc a nosohltanu karcinóm [33], [34].}

chemokiny secernovaných stromálnych buniek alebo nádoru bunky ovplyvňujú migráciu nádorových buniek, inváziu, proliferáciu, angiogenézy a imunitných buniek infiltráciu do hmoty nádoru [35]. IFN-γ-indukovatelný proteín-10 (IP-10, CXCL10) je jeden z chemokiny CXC, ktorý hrá úlohu v niekoľkých zápalových ochorení a rakoviny [36], [37]. Vzhľadom k tomu, IP-10 podporuje prednostne Th1 imunitnej reakcie podľa robustne priťahuje NK a T-bunky, sa navrhuje ako jeden z možných mechanizmov T buniek infiltrácií do nádorov.

, či strata tumor supresorových génov v nádorových bunkách, indukuje nábor lymfocyty a modulácie funkcie týchto buniek v nádorové mikroprostredie je v súčasnej dobe nejasná. V tejto štúdii sme skúmali funkcie PML s ohľadom na získavanie lymfocytov a modulácie expresie faktorov, nádor odvodený. Expresia PML bola nepriamo úmerná rozsahu infiltrácie CD8 ^{+ T-buniek do žalúdka karcinómy. Strata PML bola ďalej spojená so zvýšenou expresiou IP-10, jeden z lymfocytov priťahujúca chemokiny CXC, v bunkách a tkanivách karcinómu žalúdka. PML knockdown podporoval IFN-γ-sprostredkovanú STAT-1 väzbu na IP-10 promótor, čo vedie k zvýšeniu transkripcie IP-10 génu. Naše údaje podporujú myšlienku, že PML sa podieľa na získavanie lymfocytov do nádorov, cez
moduláciu hladín expresie faktorov nádorovej odvodenej, vrátane IP-10, ktoré poskytujú ďalší dôkaz, že strata tumor supresorových génov nádoru bunky sa aktívne podieľa na vzniku nádorových mikroprostredie.}

Výsledky

Strata proteínu PML je spojená so zvýšenou infiltráciou CD8 ^{+ T-buniek do pokročilého karcinómu žalúdka tkanivo}

Imunohistochemické farbenie na PML a CD8 bolo vykonané, aby preskúmala, či je rozsah lymfocytárnej infiltrácie bola spojená s PML stavu expresie u pokročilého karcinómu žalúdka. CD8-immunopositive bunky boli vyčíslené, ako je popísané v časti Materiály a metódy. Celkom 35 vzoriek (71,4%) bolo dosiahnuté čiastočnej k úplnej strate PML v nádorových bunkových jadrách etapa IV pokročilých karcinómov žalúdka. Vzorky zo 14 pacientov s pokročilou rakovinou žalúdka boli difúzne pozitívne na PML, a obsahovala priemerne 32,7 CD8 ^{+ T-buniek v jednom poli (obrázok 1A). Identifikovali sme 19 prípadov pokročilého karcinómu žalúdka, ktoré vykazujú fokálna pozitivitu pre PML, s priemerom 47,2 CD8 + T-buniek v jednom poli. Okrem toho, úplná strata PML bola pozorovaná u 16 pacientov s pokročilou rakovinou žalúdka; Vzorky obsahovali priemerný počet 52,8 CD8 + T-buniek v jednom poli. Vzorky vykazujúce fokálnej pozitivitu alebo úplná strata pre PML vykázala výraznejší nárast CD8 + číslo T-buniek, ako tomu bolo vzorky, uvádzajúce difúzna pozitivitu na PML. Reprezentatívne obrázky sú zobrazené na obrázku 1B. Aj keď expresia proteínu PML bola znížená alebo zrušená v nádorových bunkách, všetky normálne žalúdočnej sliznice žliaz, stromálny tkaniva a lymfoidných buniek, difúzny vykazovali mierne-to-silná nukleárna immunopositivity na PML.}

PML ovplyvňuje T-buniek infiltrácie /migrácia in vitro

Vzhľadom k strate expresie PML proteínu a zvýšenie infiltrácia CD8 ^{+ T-lymfocyty do pokročilou rakovinou žalúdka tkanív, my sme predpokladali, že PML prispel na T-buniek infiltrácie /migrácie v karcinómu žalúdka. Preskúmať, či je úroveň PML do buniek karcinómu žalúdka ovplyvnený migráciu T-buniek, podmienené médiá z SNU-638 bunkách prechodne transfekciou buď PML
siRNA alebo PML IV expresného vektora, potom sa spracuje s IFN-γ bola použitá v transjamkových migračné testy. SNU-638 buniek karcinómu žalúdka vyjadrené vysokej hladiny proteínu PML, v súlade s predchádzajúcimi zisteniami [2], keďže, SNU-638 bunky transfekovány PML
siRNA zobrazené zníženej hladiny endogénneho PML výrazu (~ 46-56%) , ako bolo potvrdené imunoblotu (obrázok 2A). IFN-γ vyvolal mierne zvýšenie expresie proteínu PML, v súlade s predchádzajúcimi výsledkami [38]. Migrácia Jurka T-buniek k kondicionovaného média z PML
bunky transfekované siRNA-SNU-638 bola významne zvýšená, v porovnaní s kontrolnými bunkami siRNA transfekciou, po ošetrení IFN-y (obrázok 2B). Po transfekciu SNU-638 s PML IV expresným vektorom, migrácia Jurko T-buniek voči kondicionovaného média z PML IV nadmerne exprimovaný bunkami bola znížená v porovnaní s prázdnym vektorom (obrázok 2C). Tieto výsledky naznačujú, že PML reguluje hladiny sekrécie molekúl vyrábaných a uvoľnených z IFN-y-stimulovaných buniek karcinómu žalúdka, a tiež ovplyvňuje migráciu T-lymfocytov.}

Strata PML zvyšuje IFN-y-indukovanej IP-10 expresie

chemokiny, rodina chemotaktické cytokíny, podporujú migráciu cirkulujúcich leukocytov /lymfocytov do miest zápalu a poranenia. Preskúmať, či boli hladiny chemokiny ovplyvnené PML
genetický stav, chemokiny génová expresia bola skúmaná za použitia ochranného ribonukleázy testu (RPA). PML
<sup>+ /+ a PML
- /- myší embryonálne fibroblasty (MEF), bunky boli inkubované v neprítomnosti alebo v prítomnosti IFN-gama pre 0-24 h celková mRNA sa zhromaždia v rôznych časových bodoch, a podrobí sa RPA. V ponuke PML
- /- MEF, IP-10 mRNA zvýšili 1,5-krát za 2 hodiny, a stal sa významne zvýšila (8-násobne) do 4 hodín (obr 3A). Hladiny mRNA RANTES boli zvýšené 3,2-krát pri 0,5 h, a zostáva zvýšená, ale v menšom rozsahu (1,3-násobné), 8 h ošetrenie po IFN-y v PML
- /- MEF , Ostatné chemokínu gény, vrátane MIP-1, MIP-2 a MCP-1, neboli detekovateľné vyjadrené v PML
+ /+ alebo PML
- /- MEF (dáta nie sú ukázaná). STAT-1 expresie bola zvýšená po expozícii na IFN-y v oboch typoch buniek, ale žiadny rozdiel bol evidentný, keď boli porovnané hladiny IFN-y medzi PML
+ /+ a PML
- /- bunky. Ako prepis IP-10 génu bola podstatne zvýšená u IFN-gama-stimulovanej PML
- /- MEF sme merali príslušnej úrovne proteínu v supernatante kultúr PML
+ /+ a PML
- /- MEF, s použitím značenú imunoanalýza enzymatický (ELISA). V súlade s výsledkami RPA, vyššie hladiny IP-10 a proteínu boli zjavné v upravenom médiu z IFN-γ-ošetrené PML
- /- MEF (obrázok 3B). Tiež, IP-10 mRNA expresie v PML
siRNA transfekciou Bunky NIH3T3 boli lepšie, v porovnaní s kontrolnými bunkami siRNA transfekciou po IFN-y liečbe (obrázok 3C). Zníženie expresie proteínu PML v PML
siRNA transfekciou bunkách NIH3T3 bola potvrdená imuno-blottingom.</sup>

Znížená expresia PML je nepriamo úmerná IP-10 úrovní bielkovín v žalúdočnej tkanive rakoviny a SNU- 638 bunky

Ďalej sme skúmali vzťah medzi IP-10 a expresiu proteínu PML u pokročilého karcinómu žalúdka tkaniva. Rakovinové tkanivá boli imunohistochemicky zafarbené na PML a IP-10, a intenzita IP-10 immunopositivity bola meraná ako je popísané v časti Materiály a metódy. Priemerná intenzita IP-10 bol 1,2 do 14 vzorky vykazujúcej difúznou pozitivitu (DP) pre PML, 2,2 v 19 prípadoch fokálnej pozitivity (FP) a 2,0 v 16 vzorkách, v ktorých bola úplná strata (CI) PML výrazu ( obrázok 4A, ľavý panel). Významné zvýšenie IP-10 expresie bola pozorovaná u vzoriek s ohniskovou pozitivitu PML ( P
= 0,034), v porovnaní s tými, ukazuje difúzny pozitívny PML výraz. Zvýšenie IP-10 expresie bola pozorovaná, keď úplná strata PML bolo zrejmé, v porovnaní s tým, čo bolo uvedené, keď PML bol vyjadrený difúzne; Avšak, tento rozdiel nedosiahol štatistickú významnosť. Reprezentatívny príklady zmien v postavení proteínu PML, ktoré korelujú s rôznymi IP-10 úrovní expresie v nádorových bunkách z pokročilých karcinómov žalúdka sú zobrazené (obr 4A, vpravo). Ďalej skúmať vzťah medzi expresiou proteínu IP-10 a PML v žalúdočnej bunkových líniách karcinómu, IP-10 množstvo bielkoviny boli merané v supernatante kultúr z SNU-638 bunkách prechodne transfekciou buď PML
siRNA alebo PML IV exression vektor. Bunky boli pestované v neprítomnosti alebo v prítomnosti IFN-y po dobu 8 hodín, supernatanty odstránili a hladiny IP-10 v nej kvantifikované (ELISA). IFN-γ-indukovanej sekrécie IP-10 bola významne zvýšená v SNU-638- PML
siRNA transfekciou buniek, v porovnaní s tým SNU-638 bunkách transfekciou kontrolný siRNA (Obr 4B). Transfekcia SNU-638 s PML IV expresným vektorom potlačená IFN-γ-indukovanej IP-10 sekrécie (obr 4C). Výsledky jasne ukazujú, že sekrécia IP-10 z buniek karcinómu žalúdka sa zvyšuje, keď sa PML expresia znížená.

IP-10 neutralizačnú znižuje migráciu T-buniek

SNU-638- PML
bunky siRNA obsahujúca exprimujúce znížené hladiny proteínu PML ukázala zvýšenie T-buniek a sekréciu náboru IP-10 v reakcii na IFN-y (obrázky 2 a 4), Ďalej sme skúmali, či zvýšenie IP- 10 úrovní uľahčil migráciu T-buniek k kondicionovaného média z SNU 638 buniek karcinómu žalúdka stimulovanej IFN-gama. SNU-638- PML
siRNA bunky boli pestované v neprítomnosti alebo v prítomnosti IFN-y po dobu 8 hodín, a získané supernatanty boli vopred ošetrené s neutralizačné protilátkou anti-IP-10 alebo kontrolné nešpecifickú IgG pre 1 h, pred začatím testu transwell. Supernatanty neutralizačných protilátok alebo IgG obsahujúce boli umiestnené do spodných komôr, a bola analyzovaná migrácia buniek Jurko z hornej do dolnej komory tým, že skúma buniek získaných z dolných komôr. Začlenenie IP-10 neutralizačné protilátky inhibujú migráciu Jurko T-buniek k kondicionovaného média z SNU-638- PML
siRNA buniek (obrázok 5A). Tieto zistenia sú v súlade s údajmi získanými z NIH3T3 buniek; IP-10 neutralizačné protilátky inhibuje EL-4 migráciu T-buniek k kondicionovaného média z NIH3T3- PML
siRNA bunky (obrázok 5B).

PML porazený zvyšuje aktiváciu IP-10 promótor

Rovnako ako IP-10 expresie bola zvýšená v PML porazený bunkách, sme ďalej skúmať, či expresia PML proteín vplyv IP-10 promotorovou aktivitu. Myšou IP-10 promótor obsahuje domnelú GAS podobný prvok, ležiace medzi nc -246 a -238 (TTN _{5AA) (obrázok 6A). Máme už bolo skôr oznámené, že PML negatívne reguluje transkripčné aktivitu STAT-1 [17]. Či PML vplyv IFN-γ-indukovanej IP-10 expresie génu pomocou
mechanizmu zahŕňajúceho STAT-1, sme sa izoluje a generuje reportéri konštrukt, začínajúce o polohe -330 myšacieho IP-10 obsahujúceho promótor domnelý GAS podobný prvok, ako je popísané v časti materiály a metódy. IP-10 luc
reportér obsahujúcich plyn podobný prvok bol prechodne transfekován do buniek NIH3T3 inkubovaných s alebo bez IFN-y po dobu 24 hodín, a následne testované na aktivitu luciferázy. IFN-γ-indukovanej IP-10 aktivita promotora bola významne zvýšená v bunkách NIH3T3 transfektovaných PML
siRNA, v porovnaní s bunkami v kontrolných siRNA (obrázok 6B). Po transfekciu NIH3T3 buniek s PML IV expresného vektora, IFN-γ-indukovanú aktiváciu IP-10 promótor bol významne potlačený. Zníženie expresie PML vyjadrovania pomocou PML
siRNA a nadmerná expresia PML o PML IV expresnom vektorom boli overené imuno-blottingom. Na určenie, či inhibičný účinok na PML IFN-γ-indukovanej IP-10 promotorové aktivity sa vyskytli u karcinómu žalúdka bunkové línie, sme vykonali podobné pokusy s SNU-638 buniek karcinómu žalúdka. Vzory zvýšenie a zníženie aktivity luciferázy v SNU-638 boli podobné ako u buniek NIH3T3 (obrázok 6c). Hladina expresie proteínu PML v SNU-638 bunkách transfekciou buď PML
siRNA alebo PML IV expresný vektor bol overený imuno-blottingom (dáta nie sú uvedené).}

PML porazený zvyšuje IFN-γ- ďalej sa skúmalo indukovaný STAT-1 DNA naviazanie na IP-10 predkladateľa

vplyv PML na IFN-y-indukovanej STAT-1 viažuci DNA na IP-10 promótor. PML proteín nadmerná expresia v bunkách NIH3T3, po prechodnú transfekcia s PML IV expresného vektora, čiastočne blokovaný IFN-γ-indukovanej STAT-1 DNA viažuci sa na IP-10 promótor, vrátane sekvencie na -246 až -238 (obrázok 7A, porovnanie dráhy 3 a 5). Súťaž s použitím 100-molárneho nadbytku neznačeného oligonukleotidy kódujúceho promótor IP-10 zrušila tvorbu komplexov (dráha 6). Hladiny PML a STAT-1 expresiu proteínu v celej fragmenty buniek (SKP), a rozsah STAT-1 fosforyláciu tyrozínu v jadrových extraktov (NE) boli overené imuno-blottingom. S využitím NIE od NIH3T3- PML
siRNA bunky získané po 0,5 hodinách liečby IFN-y, silnou väzbou na myšou IP-10 promotora bola pozorovaná (Obrázok 7B, horný panel, dráha 5), ​​v porovnaní s väzba vidieť v siRNA bunkách NIH3T3-kontroly (dráha 3). Rovnaké NE sa boli vystavené konsenzuálne oligonukleotidy STAT-1, a väzba STAT-1 DNA bola vylepšená v SV z NIH3T3- PML
siRNA bunky (obrázok 7B, stredný panel, porovnanie pruhov 3 a 5). Za použitie SNU-638 buniek karcinómu žalúdka, tiež zistené, že väzba STAT-1 DNA PML
bunky transfekované siRNA-SNU-638 bola zvýšená v porovnaní s kontrolnými bunkami siRNA transfekciou, po ošetrení IFN-y (7C, porovnanie pruhov 3 a 5). Tieto údaje naznačujú, že PML čiastočne inhibuje STAT-1 väzby k IP-10 promótor, a že tento účinok je v korelácii so zvýšenou IFN-γ-indukovanej IP-10 transkripcii v neprítomnosti PML.

Diskusia

Histopatologické štúdie ukázali, že zápalové mikroprostredia nádorov je charakterizovaná prítomnosťou mononukleárnych buniek infiltrátov, a to ako v podporných strómy a nádorovým oblastí. Avšak presné mechanizmy, ktorými mononukleárny bunky preniknúť do a sa udržujú v rakovinových tkanív sú v súčasnej dobe nie je úplne známy. V tejto štúdii, ponúkame dôkaz, že strata expresie nádorového supresor proteínu PML, prispieva k zvýšeniu lymfocytárnej infiltráciou do tkaniva žalúdočné rakovina, pomocou
regulácie IP-10 expresie.

skúmali sme funkciu PML s ohľadom na lymfocytov náboru použitím ľudských vzoriek žalúdočnej rakovina tkaniva, PML
<sup>+ /+ a PML
- /- MEF, a PML porazený v oboch NIH3T3 a SNU-638 buniek. Dáta získané z oboch testov ľudských tkanív a testy migrácie transwell ukázali, že strata PML podporuje obchodovanie lymfocytov; Takto sme sa snažili mechanizmy, ktoré by prípadne mohla vysvetliť tieto pripomienky. Ukázali sme, že zvýšenie IP-10 úrovní v rakovinových bunkách exprimujúcich PML nízke hladiny lymfocytov prispieva k prijatiu. Navyše, IP-10 neutralizačné protilátky inhibuje migráciu T-buniek k kondicionovaného média z NIH3T3 fibroblasty a SNU 638 buniek karcinómu žalúdka in vitro
, v súlade s výsledkami niekoľkými predchádzajúcich in vivo štúdiách
, ktorá ukázala, že neutralizácia IP-10 potlačil T-buniek nábor [39], [40]. Podľa našich najlepších vedomostí, to je prvá štúdia ukazuje, že nádorový supresor, PML, reguluje IP-10 chemokiny transkripcie a obchodovanie lymfocytov u karcinómu žalúdka, tým, že moduluje aktivitu IFN-γ /STAT-1 signálne dráhy.</sup>

IP-10, lymfocyt cielenie CXC chemokiny vyvolané typu i a IFN II, hrá dôležitú úlohu v lymfocytov prijímaní pod niekoľkými zápalových ochorení [41]. IP-10 je vylučovaný bunkami imunitného systému infiltrujúcej nádor, a tiež tým, nádorových a parenchymálnych buniek v interferónu a cytokínov obohatené mikroprostredie. TAFs od pacientov s rakovinou pľúc konštitutívne produkujú a vylučujú IP-10 [27]. Hepatocytov infikovaných vírusom hepatitídy C produkujú IP-10, a indukuje migráciu aktivovaných T-buniek do pečeňového parenchýmu, čo ukazuje, že hladiny IP-10 sú korelované s histologicky závažnosti a zápalu [42]. V našom systéme, sekrécia IP-10 bola pozorovaná u karcinómu žalúdka SNU-638 bunky, NIH3T3 fibroblasty a MEF, ako odpoveď na IFN-y, a sekrécia bol zlepšený v neprítomnosti expresie proteínu PML. Vzhľadom k tomu, sme zistili, že neexistujú žiadne zjavné rozdiely v úrovni STAT-1 expresie a fosforylácie v neprítomnosti alebo v prítomnosti PML po IFN-y (obrázky 3 a 7), zvýšená IFN-γ-indukovanej IP-10 transkripcie v neprítomnosti PML bol spôsobený predovšetkým zvýšenou STAT-1 DNA väzby na IP-10 promótor. Odporúčame, aby PML-sprostredkovanú inhibíciu STAT-1 viažuci DNA vedie k potlačeniu STAT-1 v závislosti na IP-10 expresie, v súlade s našimi predchádzajúcimi poznatkami [17]. V tejto štúdii sme identifikovať potenciálne regulačné oblasť pre PML v IP-10 promótor, ktorý je domnelý STAT-1-väzobné miesto. Ďalej ukážeme, že PML porazený zvyšuje IFN-γ-indukovanej STAT-1 DNA väzbu na IP-10 promótor, a zvyšuje IP-10 úrovní v neprítomnosti PML.

lymfocyty, neutrofily, makrofágy, a žírne bunky sú hlavné súčasti väčšiny nádorových infiltrátov. lymfocyty infiltrujúcej nádor boli identifikované v rôznych pevných rakovinových tkanív. Avšak, špecifické funkcie týchto buniek v nádoroch, a podrobnosti o molekulárne mechanizmy lymfocytov náboru do nádorov, zostáva kontroverzný. Postavenie a funkčné význam CD8 ^{+ T-buniek infiltráciou do nádorov, a združenia týchto buniek s prognózou pacienta, je tiež nejasné. Karcinómu obličkových buniek, infiltráciu CD8 + T-buniek je spojená s priaznivou prognózou [43]. A naopak, táto infiltrácia je spojený s nepriaznivou prognózou u pacientov s rakovinou nonsmall pľúcnych buniek [33]. Sme tu ukazujú, že PML expresie proteínov v nádorových bunkách je nepriamo úmerná rozsahu infiltrácie CD8 + T-buniek do nádorového tkaniva. Ak je funkcia PML v lymfatickej invázii je považovaná za spoločne s asociáciou medzi PML prejavu a nepriaznivou prognózou [2], je zrejmé, že akýkoľvek vzťah medzi klinickými príznakmi a rozsah CD8 + T-buniek infiltrácia u pacientov s rakovinou žalúdka vyžaduje ďalšie objasnenie.}

Jadrá normálne žalúdočnej sliznice žliaz, stromálny tkaniva a lymfoidných buniek boli difúzne immunopositive (stredné až silné) pre expresiu proteínu PML, zatiaľ čo koncentrácia PML bol znížený alebo zrušený v nádorových bunkách (obr 1). Tieto nálezy podporujú myšlienku, že rakovinové bunky majú špecifické mechanizmy degradácie pre PML. Chceli by sme navrhnúť, aby post-translačný proteazómu závislé degradácie vysvetľuje stratu proteínu PML. Inými slovami, degradácia na transkripčný úrovni, nie je funkčné [2], [44]. Expresia PML proteínu znížená alebo zrušená v mnohých rôznych rakovín, zahŕňajúce rakovinu prostaty, prsníka, hrubého čreva, CNS, pľúc a rakoviny žalúdka [2], [3]. V súlade s týmito výsledkami sme pozorovali zníženú alebo len zanedbateľný expresie PML vo vyspelých rakovinou žalúdka tkanív. Navyše, naše výsledky naznačujú, že rakovinové bunky exprimujúce rôzne úrovne proteínu PML sa líšia v ich schopnosti prilákať a udržať lymfocytov v nádorových oblastiach, čím poskytuje ďalší dôkaz, že takéto bunky aktívne sa podieľať na vzniku zápalových nádorové mikroprostredie, pomocou
PML-sprostredkované mechanizmy.

NF-kB a STAT-3 signalizácia sa navrhuje, aby slúžil ako hlavný regulačné systémy, ktoré spájajú zápal s rakovinou [45]. IL-6, NF-kB v závislosti na zápalové rastový faktor, je zásadný pre vývoj zápalu spojených s karcinogenézy [46]. Nedávny nepriame dôkazy ďalej posilnila predstavu, že IL-6 /gp130 /STAT-3 signalizácia os slúži ako obaja autokrinný a parakrinný zosilnenie slučky v adenokarcinómu pľúc, mnohopočetný myelóm, Ras-transformovanej nádorové bunky, a model rakovinou kolitída spojená s [47], [48], [49], [50]. PML Ukázalo sa, že potlačenie IL-6 indukovanú STAT-3 aktivitu [51], podporovať apoptózu pomocou
proces sprostredkovaných TNF, a citlivosť buniek k apoptóze inhibíciou NF-kB sprostredkované prežitie dráhy [52]. Je však potrebné zistiť, či strata nádorového supresor PML prispieva k zmenám v imunitnej reakcie hostiteľa alebo v mikroprostredie nádoru, čo možno buď imunologického alebo imunitný úniku moduláciou transkripčných faktorov. Tak, že by bolo zaujímavé porovnať účinky strata expresie proteínu PML na NF-kB /STAT-3 a STAT-1 signalizácie, a určiť, či tieto transkripčné faktory funkcie koordinovaným spôsobom regulovať expresiu podmnožiny chemokiny, ktoré prispievajú k vzniku zápalových nádorové mikroprostredie.

materiály a metódy

Cells

Primárne a zvečnenie PML
<sup>+ /+ a PML
- /- MEF boli vytvárané a udržiavané ako bolo opísané skôr [53]. Ľudská bunková línia žalúdka carconoma SNU-638, Jurko ľudských T-buniek lymfoblasty podobné bunkové línie, a EL-4 lymfómu myší T-bunkové línie boli udržiavané ako bolo opísané skôr [2], [54].</sup>

karcinóm žalúdka tkaniva

a celkom 49 karcinóm žalúdka parafínové bloky boli získané z 49 pacientov (29 mužov, 20 žien, priemerný vek 64 rokov, rozpätie 35-84), ktorí podstúpili celkovej alebo medzisúčtu gastrektómii pre etapu IV pokročilých žalúdočné karcinómy na Mokdong nemocnice, Ewha Womans University School of Medicine, Soul, Kórea od roku 2001 do roku 2007.

Činidlá a protilátky

rekombinantný myší a ľudský IFN-γ (mIFN-γ a hIFN- γ) a MIP-10 a hip-10 boli získané od ProSpec (Rehovot, Izrael). Protilátky proti PML (myšia monoklonálna) a STAT-1 boli získané od Upstate Biotechnology, Inc. (Lake Placid, NY, USA) a neutralizačné protilátky k IP-10 bol zakúpený od R &D Systems (Minneapolis, MN, USA). Protilátka proti p-Y701-STAT-1 bol zakúpený od firmy Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Protilátky proti Histon, Lamin B a PML (králičie polyklonálne) boli zakúpené od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), a anti-tubulín protilátka bola zakúpená od Sigma-Aldrich, Co. (St. Louis, MO, USA) .

Imunohistochémia, počty buniek a meranie imunoreaktívnych oblastí

ľudských rakovinových tkanív žalúdka boli spracované na imunohistochemické analýzou, ako je opísané skôr [2], s drobnými úpravami. Primárne protilátky pre PML (1: 200; Santa Cruz Biotechnology), CD8 (1:50; Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, USA) a IP-10 (1:50, R &D Systems) boli použité. Všetky snímky boli kontrastne Mayerovým hematoxylínom. Pozitívne kontroly boli získané za použitia Palatine mandle pre PML proteínu a CD8 a nosohltanu nediferencovaných karcinómov pre IP-10. Negatívne kontroly boli získané vynechaním primárnej protilátky zo všetkých snímok. Immunopositivity k proteínu PML bola kvalifikovaná ako difúzny pozitivity (jadrovej imunoreaktivity v ≥ 50% nádorových buniek), fokálnej pozitivity (v ≥ 10%, ale teplotu nižšiu ako 50%) alebo úplnú stratu (v < 10% nádorových buniek). Počty CD8 immunopositive buniek v jednom vysokého výkonu poli (HPF, X40) 0,25 mm ^{2 po dobu piatich náhodne vybraných nádorových infiltratívny hraníc boli počítané pre každú vzorku, nasleduje výpočet priemerného počtu a SD. Immunopositivity pre IP-10 bola definovaná ako jadrového alebo cytoplazmatickej pozitívny expresie v nádorových bunkách. Pre stanovenie exprimovaného úroveň každej snímky, digitálne obrazy boli získané s použitím digitálneho fotoaparátu mikroskop montáž. Použitie ImageJ softvér (http://rsb.info.nih.gov/ij~~HEAD=dobj), každý obraz bol prevedený na 8-bitových šedi a oblastí hustôt boli merané z pixelov v oblasti záujmu; len pixely prekročení určitej úrovne (viac ako 50 hodnota intenzity). boli zahrnuté pre odstránenie chyby pozadia}

siRNA transfekcia

NIH3T3 bunky boli prechodne transfekovány za použitia transfekčního činidla MIRUS (MIRUS Bio LLC, Madison,

• Ploche ONE: znižujúce množstvo RPL6 podľa siRNA inhibuje proliferáciu a progresiu bunkového cyklu na žalúdočné rakovinu bunkových línií ľudského
• Ploche ONE: Mir-29a Inhibuje Cell proliferáciu a indukuje zastavenie bunkového cyklu cez znižujúce množstvo p42.3 v žalúdočnej rakoviny u ľudí