PLoS ONE: perdita della proteina leucemia promielocitica in cancro gastrico: implicazioni per IP-10 Espressione e Tumor-linfociti infiltranti

Astratto

cancro gastrico è una delle cause più comuni di mortalità per cancro-correlata in tutto il mondo. L'espressione della proteina soppressore del tumore, leucemia promielocitica (PML), viene ridotta o abolita nel carcinomi gastrici, in associazione con un maggiore livello di invasione linfatica, lo sviluppo di una maggiore messa in scena pTNM, e la prognosi sfavorevole. Qui, abbiamo studiato la relazione tra il grado di linfociti infiltranti il ​​tumore e lo stato di espressione della proteina PML nel carcinoma gastrico avanzato. Abbiamo osservato un numero maggiore di infiltrarsi cellule T nei tessuti carcinoma gastrico in cui l'espressione PML è stata ridotti o soppressi, rispetto ai tessuti positivi per PML. L'estensione della migrazione delle cellule T verso sovranatanti ottenuti da linee cellulari di carcinoma gastrico interferone gamma (IFN-γ-stimolate è stato inoltre influenzato da espressione di PML in vitro
. Interferone-gamma-inducibile della proteina 10 (IP -10 /CXCL10) espressione era aumentato in tessuti di carcinoma gastrico visualizzazione ridotti livelli PML. Inoltre, sia Pml
eliminazione diretta e le cellule atterramento visualizzata aumentata espressione IP-10 mRNA e di proteine ​​in presenza di IFN-γ. PML atterramento aumento IFN-γ-mediata segnale trasduttore e attivatore di trascrizione-1 (STAT-1) legame al IP-10 promotore, con conseguente elevata trascrizione del gene IP-10. al contrario, l'espressione della proteina PML IV soppresso IP-10 attivazione del promotore . sulla base di questi risultati, proponiamo che la perdita di espressione della proteina PML in cellule di cancro gastrico contribuisce ad aumentare IP-10 trascrizione via
valorizzazione di STAT-1, che, a sua volta, promuove il traffico dei linfociti all'interno delle regioni tumorali .

Visto: Kim HJ, song DE, Lim SY, Lee SH, Kang JL, Lee SJ, et al. (2011) La perdita della proteina leucemia promielocitica in cancro gastrico: implicazioni per IP-10 Espressione e Tumor-linfociti infiltranti. PLoS ONE 6 (10): e26264. doi: 10.1371 /journal.pone.0026264

Editor: Yoshio Yamaoka, Veterans Affairs Medical Center (111D), Stati Uniti d'America

Ricevuto: 21 Aprile, 2011; Accettato: 23 settembre 2011; Pubblicato: 12 Ottobre 2011

Copyright: © 2011 Kim et al. Questo è un articolo ad accesso libero distribuito sotto i termini della Creative Commons Attribution License, che permette l'uso senza restrizioni, la distribuzione e la riproduzione con qualsiasi mezzo, a condizione che l'autore originale e la fonte sono accreditati

Finanziamento:. Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma di ricerca di scienza di base attraverso il National Research Foundation di Corea (NRF) finanziato dal Ministero dell'Istruzione, della Scienza e della Tecnologia (2010-0.015.506) per Y-HC, dalla Fondazione nazionale delle Ricerche di Corea (NRF), finanziato da parte del governo della Corea (MEST) (2010-0.029.353) per JLK, e da RO1 NS50665 a ENB. I finanziatori avevano alcun ruolo nel disegno dello studio, la raccolta e l'analisi dei dati, la decisione di pubblicare, o preparazione del manoscritto

Competere interessi:.. Gli autori hanno dichiarato che non esistono interessi in competizione

Introduzione

cancro gastrico è una delle più frequenti cause di morte per cancro in tutto il mondo. I recenti progressi nel campo della genetica hanno facilitato l'individuazione di eventi che si verificano nel corso della carcinogenesi gastrica, inclusa l'attivazione di oncogeni, mettendo a tacere di geni oncosoppressori, e la mutazione di geni coinvolti nella riparazione del DNA [1]. Tra questi eventi genetici, è noto che l'espressione soppressore del tumore proteina della leucemia promielocitica (PML) è ridotta o abolita nel cancro gastrico, e che questo è associato a più vasta invasione linfatica, una maggiore messa in scena pTNM, e la prognosi sfavorevole, il che suggerisce che la perdita di PML è legata alla progressione carcinogenesi e gastrica carcinoma [2]. Studi precedenti implicati Pml
erettile in progressione di una varietà di tumori, e di espressione ridotta o abolita di PML è stata segnalata in prostata, della mammella, del sistema nervoso centrale, del colon, del polmone, e tumori gastrici [2], [3] .

Pml
gene è stato originariamente identificato dalla fusione con il recettore dell'acido retinoico coinvolti nel t (15; 17) traslocazione cromosomica associata con leucemia promielocitica acuta (APL) [4], [ ,,,0],5], [6], [7], [8]. PML è una proteina soppressore del tumore che regola la progressione del ciclo cellulare, la trascrizione del gene, la soppressione di trasformazione, e l'apoptosi. Pml
knockout topi sono notevolmente più sensibili alla formazione del tumore dopo l'esposizione ad agenti cancerogeni che sono controlli wild-type, e Pml
-carente cellule sono meno probabilità di subire apoptosi dopo l'applicazione di particolari tipologie di stress cellulare [9]. Oltre alle relazioni incentrate sul ruolo oncosoppressore giocato da PML, diversi studi hanno confermato che gli atti di proteine ​​come un regolatore trascrizionale, via
associazione con la proteina co-attivatore CREB-binding; co-repressori tra HDAC, N-CdR, e mSin3A; e fattori di trascrizione Nur77, AP-1, myc, p53, e STAT-1α [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17].

mutazione progressiva di alterazioni genetiche e in diversi geni oncosoppressori promuovere lo sviluppo e la progressione tumorale [18]. Oltre alle alterazioni genetiche all'interno delle cellule tumorali, sia le cellule infiammatorie e mediatori contribuiscono alla formazione di particolari microambienti tumorali [19], [20]. fibroblasti associati al tumore (TAF) e macrofagi (TAMs) sono anche coinvolti nella modulazione del microambiente tumorale via
produzione di citochine, chemochine, interferoni, e altri fattori biologicamente attivi [21], [22]. Cross-talk tra cellule tumorali, TAF, TAM, e linfociti, è significativo nello sviluppo del tumore e la progressione, e contribuisce alla creazione di microambienti tumorali arricchito in espressione di una varietà di fattori biologicamente attivi [23], [24], [25] , [26], [27].

TAM sono risultate correlate con l'angiogenesi e una prognosi sfavorevole in diversi tipi di cancro, tra cui cancro gastrico [22], [28]. Mast cellule produce molti fattori angiogenetici e una varietà di citochine, e la sua densità è stato segnalato per altamente correlato con l'entità della neoangiogenesi tumorale e prognosi infausta [29], [30]. CD4 ^{+ e CD8 + linfociti si trovano anche in una varietà di tessuti tumorali solide. Fino ad ora, i meccanismi molecolari precisi con cui il tipo e il numero di cellule tumorali infiltranti sono regolate sono largamente sconosciuti. Ci sono diversi rapporti controversi per quanto riguarda il numero e la funzione di linfociti infiltranti il ​​tumore. In particolare, CD8 + T linfociti, mentre la loro funzione è noto per eliminare le cellule trasformate nascenti e contribuire alla immunosorveglianza [31], si segnala che + cellule T tumore-infiltranti CD8 sono difettosi in funzione di fase effettrice al contatto con le cellule tumorali [32], e la loro infiltrazione è legata a prognosi sfavorevole in alcuni tipi di cancro, come il cancro del polmone nonsmall cellule e carcinoma nasofaringeo [33], [34].}

Le chemochine secrete dalle cellule stromali o tumore cellule influenzano la migrazione delle cellule tumorali, l'invasione, la proliferazione, angiogenesi e infiltrazione di cellule immunitarie nella massa tumorale [35]. IFN-γ-inducibile della proteina-10 (IP-10, CXCL10) è una delle chemochine CXC che svolge molteplici ruoli nelle malattie infiammatorie e cancro [36], [37]. Poiché IP-10 promuove preferenzialmente Th1 risposte immunitarie attirando robustamente cellule NK e T, si suggerisce come uno dei possibili meccanismi di infiltrazione di cellule T a tumori.

Sia perdita di geni oncosoppressori nelle cellule tumorali induce il reclutamento di linfociti e modulazione delle funzioni di tali cellule all'interno microambienti tumorali è ancora chiaro. Nel presente studio, abbiamo esaminato la funzione PML rispetto al reclutamento dei linfociti e la modulazione dell'espressione di fattori tumore-derivato. L'espressione di PML era inversamente correlata con il grado di infiltrazione di CD8 ^{+ T-cellule in carcinomi gastrici. perdita PML è inoltre associato con aumentata espressione di IP-10, una delle chemochine CXC linfociti-attrarre, in cellule di carcinoma gastrico e tessuti. PML knockdown promosso IFN-γ-mediata STAT-1 legame al IP-10 promotore, con conseguente aumento della trascrizione del gene IP-10. I nostri dati supportano l'idea che la PML è coinvolto nel reclutamento dei linfociti nei tumori, via
modulazione dei livelli di espressione di fattori di tumore-derivato, tra cui IP-10, che fornisce un'ulteriore prova che la perdita di geni oncosoppressori nel tumore cellule partecipa attivamente alla creazione di microambienti tumorali.}

Risultati

perdita di proteine ​​PML è associato ad un aumento infiltrazione di CD8 ^{+ T-cellule in avanzato tessuto carcinoma gastrico}

la colorazione immunoistochimica per la PML e CD8 è stata eseguita per esplorare se la portata di infiltrazione linfocitaria è stato associato con lo status di espressione PML nel carcinoma gastrico avanzato. cellule CD8-immunopositive sono stati enumerati come descritto in Materiali e Metodi. In totale, 35 campioni (71,4%) hanno mostrato una perdita parziale a completa di PML nei nuclei delle cellule tumorali di fase IV avanzate carcinomi gastrici. I campioni provenienti da 14 pazienti con carcinoma gastrico avanzato sono stati diffusamente positivo per PML, e contenevano una media di 32,7 CD8 ^{+ T-cellule per campo (Figura 1A). Sono stati identificati 19 casi di carcinoma gastrico avanzato espositrici positività focale per la PML, con una media di 47,2 CD8 + T-cellule per campo. Inoltre, la perdita completa di PML è stata osservata in 16 pazienti avanzate di carcinoma gastrico; i campioni contenevano un numero medio di 52,8 CD8 + T-cellule per campo. I campioni che mostrano positività focale o la perdita completa per PML hanno mostrato un più marcato aumento dei CD8 + numero di cellule T di esemplari did esporre positività diffusa per PML. Immagini rappresentative sono mostrate nella Figura 1B. Anche se l'espressione della proteina PML è stata ridotta o abolita nelle cellule tumorali, tutti i normali ghiandole gastriche delle mucose, tessuti stromali e cellule linfoidi, esposto diffusa immunopositività nucleare moderata-forte per PML.}

influenze PML infiltrazione delle cellule T /migrazione in vitro

in considerazione della perdita di espressione della proteina PML e l'aumento di infiltrazioni di CD8 ^{+ linfociti T nei tessuti di carcinoma gastrico avanzato, abbiamo ipotizzato che PML contribuito di infiltrazione delle cellule T /migrazione nel cancro gastrico. Per esplorare se il livello di PML in cellule di cancro gastrico influenzato la migrazione delle cellule T, condizionato dal supporto SNU-638 cellule trasfettate sia con Pml
siRNA o PML IV vettore di espressione, poi trattato con IFN-γ è stato utilizzato in transwell saggi di migrazione. SNU-638 cellule di cancro gastrico espressi alti livelli di proteina PML, in linea con i risultati precedenti [2], mentre SNU-638 cellule trasfettate con Pml
siRNA visualizzati i livelli di espressione PML endogena ridotto (~46-56%) , come confermato da immunoblotting (Figura 2A). IFN-γ indotto un modesto aumento della espressione della proteina PML, in accordo con i risultati precedenti [38]. La migrazione di Jurkat cellule T verso medium condizionato da Pml
SNU-638 cellule siRNA-trasfettate è stato significativamente potenziato, rispetto a quella delle cellule siRNA-trasfettate controllo, dopo il trattamento con IFN-γ (Figura 2B). Su trasfezione di SNU-638 con PML IV vettore di espressione, la migrazione di Jurkat cellule T verso terreno condizionato dalle cellule sovraespressi PML IV si è ridotto rispetto a quello del vettore vuoto (Figura 2C). Questi risultati suggeriscono che PML regola i livelli di molecole di secrezione prodotte da e rilasciati da IFN-γ-stimolato cellule di cancro gastrico, e influenza anche la migrazione dei linfociti T.}

Perdita di PML aumenta IFN-γ-indotta IP-10 espressione

Le chemochine, una famiglia di citochine chemiotattici, promuovere la migrazione dei leucociti /linfociti circolanti ai siti di infiammazione e lesioni. Per esplorare se i livelli di chemochine sono state colpite da Pml
status genetico, l'espressione genica delle chemochine è stata esaminata mediante saggio di protezione della ribonucleasi (RPA). Pml
<sup>+ /+ e Pml
- /- topo fibroblasti embrionali (MEF) sono state incubate in assenza o in presenza di IFN-γ per 0-24 h , mRNA totale è stato raccolto a vari intervalli di tempo, e sottoposto a RPA. In Pml
- /- MEF, IP-10 livelli di mRNA sono aumentati di 1,5 volte in 2 ore e divenne marcatamente elevato (8 volte) da 4 h (Figura 3a). i livelli di mRNA RANTES sono stati aumentati 3,2 volte a 0,5 h, e sono rimasti elevati, ma in misura inferiore (1,3 volte), 8 h trattamento post-IFN-γ in Pml
- /- MEF . Altri geni delle chemochine, tra cui MIP-1, MIP-2, e MCP-1, non erano rilevabile espressi in Pml
+ /+ o Pml
- /- MEF (dati non mostrati). STAT-1 è stato aumentato dopo l'esposizione a IFN-γ in entrambi i tipi di cellule, ma nessuna differenza era evidente quando i livelli di IFN-gamma sono stati confrontati tra Pml
+ /+ e Pml
- /- cellule. Come la trascrizione del gene IP-10 è stato notevolmente elevato in IFN-γ-stimolata Pml
- /- MEF, abbiamo misurato i livelli di proteina rilevanti in sopranatanti di coltura di Pml
+ /+ e Pml
- /- MEF, con un saggio di immunoassorbimento enzimatico (ELISA). In linea con i risultati CPT, livelli più elevati di IP-10 proteine ​​erano evidenti in mezzo condizionato da IFN-γ-trattata Pml
- /- MEF (Figura 3B). Inoltre, IP-10 mRNA espressione in Pml
cellule NIH3T3 siRNA-trasfettate è stato potenziato, rispetto a quella delle cellule siRNA-trasfettate controllo, a seguito del trattamento con IFN-γ (Figura 3C). La riduzione della espressione della proteina PML in Pml
cellule siRNA-transfettate NIH3T3 è stata confermata da immunoblotting.</sup>

espressione PML ridotto è inversamente correlata con IP-10 livelli di proteine ​​nel tessuto cancro gastrico e SNU- 638 cellule

Successivamente, abbiamo esaminato la relazione tra IP-10 e l'espressione della proteina PML in avanzato tessuto carcinoma gastrico. tessuti tumorali sono stati immunoistochimica colorate per PML e IP-10, e l'intensità della IP-10 immunopositività è stata misurata come descritto in Materiali e Metodi. L'intensità media di IP-10 era 1,2 a 14 campioni che presentano positività diffusa (DP) per PML, 2.2 in 19 casi di positività focale (FP), e 2.0 in 16 campioni, in cui vi era la perdita completa (CL) di espressione PML ( Figura 4A, pannello di sinistra). Aumenti significativi nell'espressione IP-10 sono stati osservati in campioni che mostra positività focale di PML ( P
= 0.034), rispetto a quelli che mostrano diffusa espressione PML positivo. Un aumento di IP-10 espressione è stata osservata quando la perdita completa di PML era evidente, rispetto a quanto è stato notato quando PML era diffusamente espressa; tuttavia, questa differenza non ha raggiunto la significatività statistica. Esempi rappresentativi di variazioni dello stato proteina PML che correlate con diversi IP-10 livelli di espressione nelle cellule tumorali da carcinomi gastrici avanzati sono mostrati (Figura 4A, a destra). Per esaminare ulteriormente il rapporto tra l'espressione della proteina IP-10 e PML in linee cellulari di carcinoma gastrico, IP-10 livelli della proteina sono stati misurati in sovranatanti da SNU-638 cellule trasfettate sia con Pml
siRNA o PML IV Exression vettore. Le cellule sono state coltivate in assenza o presenza di IFN-γ per 8 h, surnatanti raccolti, e IP-10 livelli ivi quantificati (mediante ELISA). IFN-γ-indotta IP-10 secrezione è stata significativamente migliorata in SNU-638- Pml
cellule siRNA-trasfettate, rispetto a quello del SNU-638 cellule trasfettate con siRNA di controllo (Figura 4B). Transfection di SNU-638 con PML IV vettore di espressione soppressa IFN-γ-indotta IP-10 secrezione (Fig 4C). I risultati mostrano chiaramente che la secrezione di IP-10 da cellule di cancro gastrico è aumentata quando l'espressione PML è ridotta.

IP-10 di neutralizzazione diminuisce la migrazione delle cellule T

Come SNU-638- Pml
cellule siRNA contenenti esprimono livelli ridotti di proteina PML hanno mostrato il miglioramento del reclutamento delle cellule T e IP-10 secrezione in risposta a IFN-γ (figure 2 e 4), abbiamo poi esaminato se un aumento di IP 10 livelli facilitato la migrazione delle cellule T verso medium condizionato da SNU-638 cellule di cancro gastrico stimolata da IFN-γ. SNU-638- Pml
cellule siRNA sono state coltivate in assenza o in presenza di IFN-γ per 8 ore, e il surnatante raccolti sono stati pretrattati con un anticorpo neutralizzante anti-IP-10 o di controllo non-IgG specifiche per 1 h, prima dell'inizio del test transwell. Anticorpi neutralizzanti o IgG contenenti supernatanti sono stati collocati nelle camere inferiori, e la migrazione di cellule Jurkat da superiore a camere inferiori stata analizzata esaminando cellule raccolte dalle camere inferiori. L'inclusione di IP-10-anticorpi neutralizzanti inibiti Jurkat la migrazione delle cellule T verso medium condizionato da SNU-638- Pml
siRNA cellule (Figura 5A). Questi risultati sono coerenti con i dati ottenuti da cellule NIH3T3; un anticorpo IP-10-neutralizzare inibito EL-4 la migrazione delle cellule T verso medium condizionato da NIH3T3- Pml
cellule siRNA (Figura 5B).

atterramento PML aumenta IP-10 attivazione del promotore

Come IP-10 è stata aumentata espressione nelle cellule PML atterramento, abbiamo ulteriormente esplorato se l'espressione della proteina PML influenzato IP-10 promotore attività. Il murino IP-10 promotore contiene un elemento GAS-come putativo compresa tra NTS -246 e -238 (TTN _{5AA) (Figura 6A). Abbiamo precedentemente riportato che PML regola negativamente l'attività trascrizionale di STAT-1 [17]. Per accertare se PML influenzato IFN-γ-indotta IP-10 l'espressione del gene via
un meccanismo che coinvolge STAT-1, abbiamo isolato e ha generato un costrutto giornalista che inizia alla posizione -330 del murino IP-10 promotore contenente il putativo elemento GAS-like, come descritto nella Materiali e Metodi. L'IP-10- luc
giornalista contenente l'elemento GAS-come è stato trasfettate in cellule NIH3T3 incubate con o senza IFN-γ per 24 ore, e successivamente analizzati per l'attività luciferasi. IFN-γ-indotta IP-10 attività del promotore è stata significativamente migliorata in cellule NIH3T3 trasfettate con Pml
siRNA, rispetto alle cellule che ricevono il controllo siRNA (Figura 6B). Su trasfezione di cellule NIH3T3 con il vettore di espressione PML IV, IFN-γ-indotta IP-10 attivazione del promotore è stata significativamente repressa. L'abbassamento di espressione PML con Pml
siRNA e la sovraespressione di PML da PML IV vettore di espressione sono stati verificati mediante immunoblotting. Per determinare se si è verificato l'effetto inibitorio di PML in IFN-γ-indotta IP-10 promotore attività in gastrici linee cellule tumorali, abbiamo eseguito esperimenti simili con SNU-638 cellule di cancro gastrico. I modelli di aumento e diminuzione dell'attività della luciferasi in SNU-638 erano simili a quello delle cellule NIH3T3 (figura 6C). Il livello di espressione della proteina PML in SNU-638 cellule trasfettate sia con Pml
siRNA o PML IV vettore di espressione è stata verificata mediante immunoblotting (dati non riportati).}

aumenta knockdown PML IFN-γ- indotta STAT-1 DNA legame alla IP-10 promotore

l'effetto di PML in IFN-γ-indotta STAT-1 DNA legame alla IP-10 promotore è stata ulteriormente esaminata. PML iperespressione della proteina nelle cellule NIH3T3, dopo trasfezione transiente con il vettore di espressione PML IV, parzialmente bloccato IFN-γ-indotta STAT-1 DNA legame alla IP-10 promotore, tra cui la sequenza a -246 a -238 (figura 7A, confrontare corsie 3 e 5). Concorso con un 100-molare oligonucleotide non marcato eccesso di codifica il promotore IP-10 abrogata formazione del complesso (corsia 6). I livelli di PML e STAT-1 espressione della proteina in lisati di cellule intere (WCL) e il grado di STAT-1 fosforilazione della tirosina in estratti nucleari (NE) sono stati verificati mediante immunoblotting. Utilizzando NE da NIH3T3- Pml
cellule siRNA ottenuti dopo 0,5 ore di trattamento con IFN-γ, forte legame al murino IP-10 promotore è stato osservato (Figura 7B, pannello superiore, corsia 5), ​​rispetto al legame visto in cellule NIH3T3 siRNA di controllo (corsia 3). Gli stessi NES sono stati esposti al STAT-1 consenso oligonucleotide, e vincolante STAT-1 DNA è stato migliorato in NE da NIH3T3- Pml
cellule siRNA (Figura 7B, pannello centrale, confrontare corsie 3 e 5). Utilizzando SNU-638 cellule di cancro gastrico, abbiamo anche trovato vincolante che STAT-1 DNA di Pml
SNU-638 cellule siRNA-trasfettate è stata potenziata rispetto a quella delle cellule siRNA-trasfettate controllo, dopo il trattamento con IFN-γ (Figura 7C, confrontare corsie 3 e 5). Questi dati indicano che PML inibisce parzialmente STAT-1 legame al IP-10 promotore, e che questo effetto è correlato ad un aumento IFN-γ-indotta IP-10 trascrizione in assenza di PML.

Discussione

studi istopatologici hanno mostrato che il microambiente infiammatorio dei tumori è caratterizzato dalla presenza di infiltrati di cellule mononucleate, sia nelle regioni stroma e tumorali sostegno. Tuttavia, i meccanismi precisi con cui le cellule mononucleate infiltrano in e sono sostenuti all'interno dei tessuti tumorali sono ancora del tutto chiaro. Nel presente studio, offriamo la prova che la perdita di espressione della proteina soppressore del tumore, PML, contribuisce alla valorizzazione dei linfociti infiltrazione nel tessuto del cancro gastrico, via
regolazione di IP-10 espressione.

Abbiamo esaminato la funzione di PML rispetto al reclutamento dei linfociti utilizzando campioni di tessuto di cancro gastrico umano, Pml
<sup>+ /+ e Pml
- /- MEF, e PML atterramento in entrambi NIH3T3 e SNU-638 cellule. I dati ottenuti da entrambi i test di tessuti umani e dei saggi di migrazione transwell hanno dimostrato che la perdita di PML promuove il traffico dei linfociti; in tal modo, abbiamo cercato meccanismi che potrebbe eventualmente spiegare queste osservazioni. Abbiamo dimostrato che un aumento di IP-10 livelli nelle cellule tumorali che esprimono bassi livelli di PML contribuisce al reclutamento dei linfociti. Inoltre, IP-10 di anticorpi neutralizzanti inibisce la migrazione delle cellule T verso medium condizionato da fibroblasti NIH3T3 e-638 SNU cellule di cancro gastrico in vitro
, in linea con i risultati di diversi in vivo
studi precedenti , che ha dimostrato che la neutralizzazione di IP-10 soppresso cellule T reclutamento [39], [40]. Per quanto a nostra conoscenza, questo è il primo studio che dimostra che il soppressore del tumore, PML, regola IP-10 chemochina trascrizione e il traffico dei linfociti nel carcinoma gastrico, modulando l'attività della via di segnalazione di IFN-γ /STAT-1.</sup>

IP-10, un linfocita-targeting CXC chemochine indotta dal tipo I e II IFNs, svolge un ruolo importante nel reclutamento dei linfociti con diversi condizioni infiammatorie [41]. IP-10 è secreta dalle cellule immunitarie tumore infiltrante, e anche da parte delle cellule tumorali e del parenchima in un microambiente interferone e citochine arricchito. TAF da pazienti affetti da cancro del polmone costitutivamente producono e secernono IP-10 [27]. Gli epatociti infettati con il virus dell'epatite C producono IP-10, e inducono la migrazione delle cellule T attivate al parenchima epatico, indicando che IP-10 livelli sono correlati con la gravità istologica e l'infiammazione [42]. Nel nostro sistema, IP-10 secrezione è stata osservata nel carcinoma gastrico SNU-638 cellule, fibroblasti NIH3T3 e MEF, in risposta a IFN-γ, e la secrezione è stato migliorato in assenza di espressione della proteina PML. Dal momento che abbiamo scoperto che non c'erano differenze apprezzabili nel livello di STAT-1 espressione e la fosforilazione in assenza o la presenza di PML su IFN-γ (figure 3 e 7), aumento IFN-γ-indotta IP-10 di trascrizione in assenza di PML è stato causato principalmente da una maggiore STAT-1 DNA legame IP-10 promotore. Si suggerisce che l'inibizione di STAT-1 DNA porta legame con la soppressione di IP-10 espressione STAT-1-dipendente, PML-mediata in accordo con i nostri risultati precedenti [17]. Nel presente studio, identifichiamo un potenziale regione normativo per PML nel promotore IP-10, che è un sito STAT-1-binding putativo. Inoltre, dimostriamo che atterramento PML aumenta IFN-γ-indotta STAT-1 DNA legame alla IP-10 promotore, e migliora IP-10 livelli, in assenza di PML.

I linfociti, neutrofili, macrofagi, e mastociti sono i componenti principali della maggior parte infiltrati tumorali. linfociti infiltranti il ​​tumore sono state identificate in una varietà di tessuti tumorali solide. Tuttavia, le funzioni specifiche di tali cellule all'interno dei tumori, e le precise meccanismi molecolari di reclutamento dei linfociti nei tumori, restano controverse. Lo status e la rilevanza funzionale di CD8 infiltrazione ^{+ T-cellule in tumori, e l'associazione di tali cellule con la prognosi del paziente, sono anche poco chiaro. Nel carcinoma a cellule renali, infiltrazione di CD8 + T-cellule è associato a prognosi favorevole [43]. Al contrario, tale infiltrazione è legata alla prognosi sfavorevole nei pazienti con cancro polmonare delle cellule monari non a piccole [33]. Siamo qui dimostriamo che l'espressione della proteina PML nelle cellule tumorali è inversamente correlata con il grado di infiltrazione di CD8 + T-cellule nei tessuti tumorali. Quando la funzione di PML in invasione linfatica è considerato insieme con l'associazione tra espressione PML e la prognosi non favorevole [2], è evidente che ogni rapporto tra le caratteristiche cliniche e l'entità del CD8 infiltrazione + T-cellule in pazienti affetti da cancro gastrico richiede un ulteriore chiarimento.}

Nuclei di normali ghiandole gastriche delle mucose, tessuti stromali e cellule linfoidi erano diffusamente immunopositive (moderata-forte) per l'espressione della proteina PML, mentre i livelli di PML sono stati ridotti o aboliti nelle cellule tumorali (Figura 1). Questi risultati supportano l'idea che le cellule tumorali hanno meccanismi di degrado specifici per PML. Vorremmo proporre che il degrado post-traslazionale proteasoma-dipendente spiega la perdita di proteine ​​PML. In altre parole, la degradazione a livello trascrizionale non è operativa [2], [44]. espressione della proteina PML è ridotta o abolita in molti diversi tipi di cancro, tra cui prostata, della mammella, del sistema nervoso centrale, del colon, del polmone e cancro gastrico [2], [3]. Coerentemente con questi risultati, abbiamo osservato espressione ridotta o trascurabile di PML nei tessuti carcinoma gastrico avanzato. Inoltre, i nostri risultati suggeriscono che le cellule tumorali che esprimono diversi livelli di proteina PML variano nella loro capacità di attrarre e mantenere i linfociti nelle aree tumorali, fornendo così un'ulteriore prova del fatto che tali cellule partecipano attivamente alla creazione di microambienti tumorali infiammatorie, via
meccanismi di PML-mediata.

NF-kB e STAT-3 di segnalazione sono proposte per servire come i principali sistemi di regolamentazione che collegano l'infiammazione al cancro [45]. IL-6, un fattore di crescita infiammatorio NF-kB-dipendente, è essenziale per lo sviluppo della carcinogenesi infiammazione associata [46]. prove circostanziali recenti hanno ulteriormente rafforzato l'idea che il /STAT-3 assi segnalazione IL-6 /gp130 serve sia come un ciclo di amplificazione autocrino e paracrino in adenocarcinoma del polmone, le cellule tumorali del mieloma multiplo, Ras-trasformata, e un modello di cancro colite associata [47], [48], [49], [50]. PML ha dimostrato di sopprimere IL-6 indotta STAT-3 attività [51], per promuovere l'apoptosi via
un processo TNF-mediata, e per sensibilizzare le cellule all'apoptosi inibendo la sopravvivenza NF-kB-mediata percorso [52]. Tuttavia, resta da stabilire se la perdita del PML soppressore del tumore contribuisce ai cambiamenti nella risposta immunitaria dell'ospite o del microambiente tumorale, forse conseguente sia immunosorveglianza o la fuga immunitario, attraverso la modulazione di fattori di trascrizione. Così, sarebbe interessante confrontare gli effetti della perdita di espressione della proteina PML su NF-kB /STAT-3 e STAT-1 segnalazione, e per determinare se queste funzioni fattori di trascrizione in modo coordinato per regolare l'espressione di un sottoinsieme di chemochine che contribuiscono alla creazione di microambienti tumorali infiammatorie.

Materiali e Metodi

celle

primaria e immortalata Pml
<sup>+ /+ e Pml
- /- MEF sono stati istituiti e mantenuti precedentemente descritto [53]. La linea cellulare carconoma gastriche umane SNU-638, Jurkat cellule T linfoblastica simile linea di cellule umane, e linee cellulari T-linfoma di topo EL-4 sono stati mantenuti come descritto in precedenza [2], [54].</sup>

tessuti gastrici carcinoma

Un totale di 49 blocchi di paraffina carcinoma gastrico sono stati ottenuti da 49 pazienti (29 maschi, 20 femmine; età media 64 anni, range 35-84) che erano stati sottoposti gastrectomia totale o subtotale per la fase IV avanzate carcinomi gastrici a Mokdong Hospital, Ewha Womans University School of Medicine, Seoul, Corea dal 2001 al 2007.

Reagenti e anticorpi

murino ricombinante e IFN-γ umano (mIFN-γ e hIFN- γ) e MIP-10 e hip-10 sono stati acquistati da ProSpec (Rehovot, Israele). Gli anticorpi anti-PML (monoclonale di topo) e STAT-1 sono stati acquistati da Upstate Biotechnology, Inc. (Lake Placid, NY, USA) e anticorpi neutralizzanti a IP-10 è stato acquistato da R & D Systems (Minneapolis, MN, USA). Anticorpo di p-Y701-STAT-1 è stato acquistato da Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Gli anticorpi anti-istone, Lamin B e PML (policlonale di coniglio) sono stati acquistati da Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), e l'anticorpo anti-tubulina è stato acquistato da Sigma-Aldrich, Co. (St. Louis, MO, USA) .

immunoistochimica, conta delle cellule, e misurazione delle superfici immunoreattivi

tessuti di cancro gastrico umano sono stati elaborati per l'analisi immunoistochimica, come descritto in precedenza [2] con piccole modifiche. Gli anticorpi primari per PML (1:200; Santa Cruz Biotechnology), CD8 (1:50; Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, USA), e IP-10 (1:50; R & D Systems) sono stati utilizzati. Tutti i vetrini sono stati di contrasto con ematossilina di Mayer. I controlli positivi sono stati ottenuti utilizzando tonsille palatine per PML proteine ​​e CD8, e carcinomi indifferenziati del rinofaringe per IP-10. I controlli negativi sono stati ottenuti omettendo anticorpi primari da tutte le diapositive. Immunopositività per la proteina PML è stato classificato come diffusa positività (immunoreattività nucleare in ≥50% delle cellule tumorali), positività focale (in ≥10% ma < 50%), o la perdita completa (in < il 10% delle cellule tumorali). Il numero di cellule CD8 immunopositive in un campo ad alta potenza (HPF, X40) di 0,25 mm ^{2 per cinque tumorali selezionati in modo casuale i confini infiltrative sono stati contati per ciascun campione, seguito dal calcolo del numero medio e SD. Immunopositività per IP-10 è stato definito come qualsiasi espressione positiva nucleare o citoplasmatica nelle cellule tumorali. Per determinare il livello espresso di ogni diapositiva, le immagini digitali sono state ottenute utilizzando una macchina fotografica digitale del microscopio montato. Utilizzando il software ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij), ogni immagine è stato convertito in scala e di zona 8 bit densità di grigio sono stati misurati dai pixel nella regione di interesse; solo pixel superiore a un certo livello (> 50 valore di intensità). sono stati inclusi per eliminare l'errore di fondo}

siRNA transfection

cellule NIH3T3 sono state trasfettate con Mirus trasfezione reagente (Mirus Bio LLC, Madison,

• PLoS ONE: L'abbassamento di RPL6 da siRNA inibisce la proliferazione e la progressione del ciclo cellulare di gastrico umano Cancer Cell Lines
• PLoS ONE: Mir-29a inibisce la proliferazione cellulare e induce arresto del ciclo cellulare attraverso il Downregulation di p42.3 in Human gastrico Cancer