PLoS ONE: Потеря белка промиелолейкозе в рака желудка: последствия для IP-10 Expression и опухолеподобных Проникновение Lymphocytes

Абстрактный

Рак желудка является одним из наиболее распространенных причин рака, связанных с смертности во всем мире. Экспрессия белка супрессоров опухолей, промиелолейкозе (PML), снижается или отменена в желудочных карцином, в сочетании с повышенным уровнем лимфатической вторжения, развитие высшего pTNM постановки и неблагоприятным прогнозом. При этом, мы исследовали взаимосвязь между степенью опухолью инфильтрации лимфоцитов и статус экспрессии белка PML в поздних стадий рака желудка. Мы наблюдали более высокие числа инфильтрации Т-клеток в желудочных тканях карциномы, в которых экспрессия PML сокращенных или ликвидированных, по сравнению с тканями положительных для PML. Степень миграции Т-клеток по отношению к супернатантов культуры, полученные из интерферона-гамма (IFN-γ-стимулированных линии карциномы желудка клеток дополнительно влияет на экспрессию PML в пробирке
. Интерферон-гамма-индуцируемый белок 10 (IP -10 /CXCL10) экспрессия увеличивалась в желудочных тканях карциномы показывая снижение уровня PML. к тому же, как <ЕМ> Pml
нокаут и нокдаун клетки имеют усиливает экспрессию IP-10 мРНК и белка в присутствии IFN-gamma. PML нокдаун увеличили ИФН-γ-опосредованный сигнал датчика и Активатор транскрипции-1 (STAT-1) связывание с промотором IP-10, что приводит к повышенной транскрипции гена IP-10. с другой стороны, экспрессия белка PML IV подавлено-10 IP-активацию промотора . на основании этих результатов, мы полагаем, что потеря экспрессии белка PML в клеток рака желудка способствует увеличению IP-10 транскрипцией <ЕМ> с помощью
усиление STAT-1 активности, что, в свою очередь, способствует обороту лимфоцита в опухолевых регионах .
<р> Образец цитирования: Ким HJ, песни DE, Лим С.Ю., Ли SH, Кан JL, Lee SJ, и др. (2011) Потеря белка промиелолейкозе в рака желудка: последствия для IP-10 и Expression Опухоль-Проникнув лимфоцитах. PLoS ONE 6 (10): e26264. DOI: 10.1371 /journal.pone.0026264
<р> Редактор: Yoshio Ямаока, делам ветеранов медицинский центр (111D), Соединенные Штаты Америки
<р> Поступила 21 апреля 2011 года; Принято: 23 сентября 2011 года; Опубликовано: 12 октября 2011
<р> Copyright: © 2011 Ким и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Эта работа Работа выполнена при поддержке программы научных исследований в области фундаментальных наук через Национальный исследовательский фонд Кореи (NRF), финансируемой Министерством образования, науки и технологии (2010-0015506) к Y-HC, Национальным исследовательским фондом Кореи (СРН), накопительная правительством Кореи (МЭПВ) (2010-0029353) к JLK, а RO1 NS50665 к ENB. Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> рак желудка является одной из наиболее частых причин смертности от онкологических заболеваний во всем мире. Последние достижения в области генетики облегчили обнаружение событий, происходящих во время рака желудка, в том числе активацию онкогенов, глушителей генов-супрессоров опухолей, и мутации генов, участвующих в репарации ДНК [1]. Среди этих генетических событий, известно, что экспрессия супрессоров опухолей промиелолейкозе (PML) белка снижается или отменена при раке желудка, и что это связано с более обширной лимфатической инвазии, более высокой pTNM стадирования и неблагоприятным прогнозом, предполагая, что потеря PML является связаны с прогрессированием канцерогенез и карциномы желудка [2]. Более ранние исследования замешан PML
дисфункции в прогрессировании различных форм рака, а также снижение или упраздненной экспрессии PML было сообщено в простаты, молочной железы, центральной нервной системы, толстой кишки, легких и рака желудка [2], [3] .
<р> PML
ген был первоначально идентифицирован путем слияния с рецептором ретиноевой кислоты, участвующих в т (15; 17) хромосомные транслокации, связанные с острой промиелолейкозе (APL) [4], [ ,,,0],5], [6], [7], [8]. PML является белок-супрессор опухолей, который регулирует ход клеточного цикла, транскрипции генов, подавление трансформации и апоптоз. Pml
нокаута мышей значительно более чувствительны к образованию опухоли после воздействия канцерогенов, чем контроль дикого типа, и Pml
дефицитных клетки реже подвергаются апоптозу после применения конкретных видов клеточный стресс [9]. Помимо докладов, посвященных роли опухолевого супрессора играет PML, несколько исследований подтвердили, что белок действует как транскрипционный регулятор, через
ассоциации с совместно активатором CREB-связывающий белок; со-репрессоры включая HDAC, N-Cor и mSin3A; и транскрипционные факторы Nur77, AP-1, Мус, P53 и STAT-1alpha [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17].
<р> Прогрессивное мутации и генетические изменения в нескольких генов-супрессоров опухолей способствуют развитию и прогрессии опухоли [18]. В дополнение к генетических изменений внутри опухолевых клеток, как воспалительные клетки и медиаторы способствуют формированию определенных опухолей микросреды [19], [20]. Ассоциированные с опухолью фибробласты (TAFs) и макрофаги (ТАМ) также участвуют в модуляции опухоли микросреды с помощью
продукции цитокинов, хемокинов, интерферонов и других биологически активных факторов [21], [22]. Перекрестные помехи между опухолевыми клетками, прогнозы TAF, Тамс и лимфоцитов, имеет важное значение в развитии и прогрессии опухоли, а также способствует созданию опухолевых микросреды, обогащенных экспрессии различных биологически активных факторов [23], [24], [25] , [26], [27].
<р> ТАМ оказываются коррелируют с ангиогенеза и неблагоприятным прогнозом в нескольких типах рака, включая рак желудка [22], [28]. Тучных клеток производит много ангиогенные факторы и множество цитокинов, и его плотность, как сообщается, сильно коррелирует со степенью неоангиогенезом опухолей и плохим прогнозом [29], [30]. CD4 ^{+ и CD8 + лимфоциты также обнаруживаются в различных солидных раковых тканей. До сих пор точные молекулярные механизмы, с помощью которых тип и число опухолевых клеток, проникающих регулируются не в значительной степени неизвестны. Есть несколько противоречивых сообщений в отношении количества и функции опухолевых лимфоцитов-инфильтрации. Тем более, CD8 + Т-лимфоцитов, в то время как их функции, как известно, чтобы устранить формирующиеся трансформированные клетки и способствуют иммунологического [31], сообщается, что CD8 + + опухолевидные инфильтрации Т-клетки дефектны в эффекторной функции фазы при контакте с опухолевыми клетками [32], а их инфильтрация связана с неблагоприятным прогнозом при некоторых видах рака, таких как немелкоклеточный рак легкого и рака носоглотки [33], [34].}

хемокинов, выделяемыми стромальных клеток или опухоли клетки влияют на миграцию опухолевых клеток, инвазию, пролиферацию, ангиогенез и инфильтрацию иммунной массы опухоли [35]. ИФН-γ-индуцируемых белок-10 (IP-10, CXCL10) является одним из хемокинов СХС, который играет различные роли в воспалительных заболеваний и рака [36], [37]. Поскольку IP-10 преимущественно способствует иммунный ответ Th1 путем робастно привлечения NK и Т-клеток, предлагается в качестве одного из возможных механизмов клеточной инфильтрацией Т к опухолям.
<Р> ли потеря генов-супрессоров опухолей в опухолевых клетках индуцирует набор лимфоциты и модуляция функций таких клеток в опухоли микросреды в настоящее время неясно. В настоящей работе мы исследовали функцию PML относительно набора лимфоцитов и модуляции экспрессии опухолевых полученных факторов. Выражение PML обратно коррелирует со степенью проникновения CD8 ^{+ Т-клеток в желудочных карцином. Потеря PML дополнительно связан с повышенной экспрессией IP-10, один из лимфоцитоподобных привлечения СХС хемокинов, в желудочном клетках карциномы и тканей. PML нокдаун способствовало ИФН-γ-опосредованное STAT-1 связывание с промотором IP-10, что приводит к увеличению транскрипции гена IP-10. Наши данные поддерживают идею о том, что PML участвует в наборе лимфоцитов в опухоли, через
модуляции уровней экспрессии опухолевых полученных факторов, включая IP-10, обеспечивая дополнительные доказательства, что потеря генов-супрессоров опухолей в опухоли клетки активно участвует в создании опухоли микросреды.}

Результаты

Потеря белка PML связано с повышенной инфильтрацией CD8 ^{+ T-клеток в продвинутой карциномы желудка ткани
<р> Иммуногистохимическое окрашивание для PML и CD8 было проведено с целью выяснить, является ли степень инфильтрацией лимфоцитами была связана со статусом PML экспрессии в поздних стадиях рака желудка. CD8-иммунопозитивные клетки подсчитывали, как описано в материалах и методах. В общей сложности 35 проб (71,4%) показали частичную к полной потере PML в ядрах клеток опухоли стадии IV передовых желудочных карцином. Образцы из 14 передовых больных раком желудка были диффузно позитивно для PML, и содержали в среднем 32,7 CD8 + Т-клеток на поле (рис 1А). Мы выявили 19 случаев поздних стадий рака желудка, проявляющие фокусного позитивности для ПМЛ, в среднем 47,2 CD8 + Т-клеток на поле. Кроме того, наблюдалась полная потеря PML в 16 передовых больных раком желудка; образцы содержали среднее число 52,8 CD8 + Т-клеток на поле. Образцы, отображающие фокусного позитивности или полная потеря для PML показали более выраженное увеличение CD8 + число Т-клеток, чем делали образцы выставляется диффузное позитивности для PML. Типичные изображения показаны на рисунке 1В. Хотя экспрессия белка PML была снижена или отменена в опухолевых клетках, все нормальные слизистой оболочки желудка желез, стромы тканей и лимфоидные клетки, выставлены диффузный от умеренной до сильной ядерной иммунопозитивность для PML.}

PML влияет на Т-клеточная инфильтрация /миграция в пробирке

<р> в связи с потерей экспрессии белка PML и увеличение инфильтрации CD8 + Т-лимфоциты в передовых желудочных тканях карциномы, мы предположили, что PML вклад к Т-клеточной инфильтрацией /миграции при раке желудка. Для того, чтобы исследовать влияние ли уровень PML в желудочном раковых клеток миграции Т-клеток, кондиционированная среда из SNU-638 клеток, трансфицированных скоротечно либо PML
миРНК или вектором экспрессии, PML IV, затем обрабатывали IFN-γ был использован в Transwell анализы миграции. СНУ-638 рака желудка клетки экспрессируют высокие уровни белка PML, в соответствии с предыдущими данными [2], в то время как SNU-638 клеток, трансфицированных Pml
миРНК отображаются в уменьшенном уровни эндогенных PML экспрессии (~46-56%) , как это было подтверждено с помощью иммуноблоттинга (фиг.2А). IFN-γ индуцирует умеренное увеличение экспрессии белка PML, в согласии с предыдущими результатами [38]. Миграция Jurkat Т-клеток к кондиционированной среде от PML
клетки миРНК-трансфецировали СНУ-638 была значительно улучшена, по сравнению с контрольными киРНК-трансфецированных клеток, после обработки IFN-gamma (Фигура 2В). После трансфекции SNU-638 с вектором экспрессии, PML IV, миграция Jurkat Т-клеток по отношению к кондиционированной среде от PML IV суперэкспрессированный клеток была снижена по сравнению с пустым вектором (фиг.2с). Эти результаты свидетельствуют о том, что PML регулирует уровни секреторных молекул, продуцируемых и освобождаемый от IFN-gamma-стимулированных клеток рака желудка, а также влияет на миграцию Т-лимфоцитов.

Потеря PML усиливает IFN-gamma-индуцированный IP-10 выражение
<р> Chemokines, семейство хемотактильными цитокинов, способствуют миграции циркулирующих лейкоцитов /лимфоцитов к местам воспаления и травмы. Для того, чтобы выяснить, является ли уровни хемокинов были затронуты Pml
генетического статуса, экспрессия гена хемокина исследовали с помощью анализа методом защиты рибонуклеазы (РПА). Pml
+ /+ и Pml
- /- мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) клетки инкубировали в отсутствие или в присутствии IFN-gamma в течение 0-24 ч , общая мРНК собирали в различные моменты времени, и подвергали RPA. В Pml
- /- MEFs, IP-10 уровней мРНК увеличилась в 1,5 раза через 2 ч, и стал заметно повышен (в 8 раз) на 4 часа (Рисунок 3А). Уровни RANTES мРНК были увеличены в 3,2 раза по 0,5 часа, и оставался повышенным, но в меньшей степени (в 1,3 раза), 8 ч после обработки IFN-gamma в PML
- /- MEFs , Другие хемокинов генов, в том числе MIP-1, MIP-2, и МСР-1, не обнаруживаемым выражены в <ЕМ> Pml
+ /+ или Pml
- /- MEFs (данные не показаны). STAT-1 выражение было увеличено после воздействия IFN-gamma в обоих типах клеток, но никакой разницы не было видно при сравнении уровней IFN-gamma между Pml
+ /+ и Pml <бр> - /- клетки. В качестве транскрипции гена IP-10 был существенно повышен в IFN-gamma-стимулированные <ЕМ> Pml
- /- MEFs, мы измерили соответствующие уровни белка в культуре супернатантах <ЕМ> Pml
+ /+ и Pml
- /- MEFs, с помощью иммуноферментного анализа (ИФА). В соответствии с результатами RPA, более высокие уровни IP-10 белка были очевидны в кондиционированной среде от IFN-γ лечение Pml
- /- MEFs (рис 3B). Кроме того, IP-10 экспрессия мРНК в <ЕМ> PML
миРНК-трансфецированные клетки NIH3T3 усиливалась, по сравнению с контрольными киРНК-трансфецированных клеток, после IFN-gamma лечения (рис 3C). Снижение экспрессии белка PML в PML
миРНК-трансфицировали клетки NIH3T3 была подтверждена с помощью иммуноблоттинга.

Снижение экспрессии PML обратно коррелирует с IP-10 уровней белка в желудочной ткани рака и SNU- 638 клеток
<р> Далее, мы исследовали взаимосвязь между ИС-10 и экспрессии белка PML в области передовых карциномы желудка ткани. Раковые ткани были иммуногистохимическое окрашивали для PML и IP-10, а интенсивность IP-10 иммунопозитивность измеряли, как описано в материалах и методах. Средняя интенсивность IP-10 1.2 в 14 образцах, показывающие диффузный положительность (DP) для ПМЛ, 2.2 в 19 случаях очагового позитивности (FP), и 2,0 в 16 образцах, в которых была полная потеря (CL) ПМЛ выражения ( Рисунок 4A, левая панель). Значительное увеличение экспрессии IP-10 были обнаружены в образцах, показывая фокусного положительность PML ( P
= 0,034), по сравнению с теми, показывая диффузное положительную PML выражение. Увеличение IP-10 экспрессии наблюдается при полной потере PML была очевидна, по сравнению с тем, что было отмечено, когда PML диффузно выражены; Однако, эта разница не достигала статистической значимости. Характерные примеры вариаций состояния белка PML, которые коррелируют с различными уровнями экспрессии IP-10 в опухолевых клетках из передовых желудочных карцином показаны (рис 4A, справа). Для дальнейшего изучения взаимосвязи между экспрессией белка IP-10 и PML в желудочном линиях карциномы, IP-10 уровней белка измеряли в супернатантах культур от SNU-638 клеток, трансфицированных скоротечно либо PML
миРНК или PML IV exression вектор. Клетки выращивали в отсутствие или в присутствии IFN-gamma в течение 8 ч, надосадочную жидкость собирали, и уровни IP-10 количественно в них (с помощью ELISA). ИФН-γ-индуцированной секреции IP-10 была значительно улучшена в СНУ-638- <ЕМ> PML
миРНК-трансфицированных клеток, по сравнению с концентрацией клеток СНУ-638, трансфецированных с контрольной миРНК (фиг.4В). Трансфекция СНУ-638 с вектором экспрессии, PML IV подавляется IFN-γ-индуцированную секрецию IP-10 (рис 4в). Результаты ясно показывают, что секреция IP-10 из клеток рака желудка увеличивается, когда PML экспрессия снижается.

IP-10 нейтрализация уменьшает миграцию Т-клеток
<р> Как СНУ-638- PML
миРНК, содержащих клетки, экспрессирующие пониженные уровни белка PML показали усиление набора Т-клеток и секрецию IP-10 в ответ на IFN-gamma (фиг.2 и 4), мы затем исследовали, могут ли увеличение IP- 10 уровней способствовали миграции Т-клеток к кондиционированной среде от SNU 638 клеток рака желудка, стимулированных IFN-gamma. СНУ-638- <ЕМ> Pml
миРНК клетки выращивали в отсутствие или в присутствии IFN-gamma в течение 8 ч, и собранные супернатанты предварительно обработанные с антителом, нейтрализующим анти-IP-10 или контролировать неспецифический IgG для 1 ч, до начала анализа Transwell. Нейтрализацию антител или IgG, содержащие супернатанты были помещены в нижних камерах, и была проанализирована миграция клеток Jurkat с верхних до нижних камер путем изучения клеток, полученных из нижних камер. Включение IP-10-нейтрализующих антител заторможенных Jurkat миграции Т-клеток к кондиционированной среде из SNU-638- PML
миРНК клетки (рис 5А). Эти результаты согласуются с данными, полученными из клеток NIH3T3; IP-10-нейтрализующих антител тормозится EL-4 миграцию Т-клеток к кондиционированной среде из NIH3T3- Pml
миРНК клетки (рис 5б).

PML нокдаун усиливает IP-10 активацию промотора

Как IP-10 экспрессия была увеличена в PML нокдаун клеток, мы исследовали влияние дальше ли экспрессия PML белка IP-10 промоторной активностью. Мышиный IP-10 содержит промотор предположительного газоподобного элемент, лежащий между НЦ -246 и -238 (ТТН <суб> 5AA) (6А). Ранее мы сообщали, что PML негативно регулирует активность транскрипции Stat-1 [17]. Для того, чтобы выяснить, влияет ли PML IFN-γ-индуцированной IP-10 экспрессию генов с помощью
механизма с участием STAT-1, мы выделили и генерироваться репортер конструкцию, начинающимся в положении -330 мышиного IP-10 промотора содержащего мнимый газоподобном элемент, как описано в разделе Материалы и методы. IP--10- <ЕМ> Luc
репортер, содержащий газоподобном элемент был трансфицированы в клетки NIH3T3, инкубированных с или без IFN-gamma в течение 24 ч, а затем анализировали на активность люциферазы. IFN-γ-индуцированной IP-10 активность промотора была значительно повышена в клетках NIH3T3, трансфицированных PML
миРНК, по сравнению с клетками, получающих управления миРНК (рис 6б). После трансфекции клеток NIH3T3 с вектором экспрессии PML IV, ИФН-γ-индуцированной IP-10 активация промотора была значительно подавлено. Подавление экспрессии PML, используя PML
миРНК и избыточная экспрессия PML по экспрессии вектора PML IV были проверены с помощью иммуноблоттинга. Для того, чтобы определить, будет ли произошло ингибирующее действие PML на ИФН-γ-индуцированной IP-10 промоторной активности в клеток рака желудка линии, мы провели аналогичные эксперименты с СНУ-638 клеток рака желудка. Узоры увеличения и уменьшения активности люциферазы в СНУ-638 были подобны тому, что клетки NIH3T3 (фиг.6С). Уровень экспрессии белка PML в SNU-638 клеток, трансфицированных либо Pml
миРНК или вектор экспрессии, PML IV была проверена с помощью иммуноблоттинга (данные не показаны).

PML нокдауна увеличивается ИФН-γ- индуцированной STAT-1 ДНК связывание с IP-10 промоутер

эффект ПМЛ на IFN-gamma-индуцированной STAT-1 связывания ДНК с промотором IP-10 был дополнительно рассмотрен. PML белок избыточная экспрессия в клетках NIH3T3, после кратковременной трансфекции с вектором экспрессии PML IV, частично блокировали ИФН-γ-индуцированной STAT-1 ДНК, связывание с промотором IP-10, в том числе последовательности при -246 до -238 (7А, сравнить полосы 3 и 5). Конкуренции с использованием 100-молярный избыток немеченного олигонуклеотид, кодирующий промотор IP-10 аннулировал образование комплекса (дорожка 6). Уровни PML и экспрессии белка STAT-1 в целом-клеточных лизатов (ВКТ) и степень STAT-1 фосфорилирования тирозина в экстрактах ядер (NE) были проверены с помощью иммуноблоттинга. Используя NE из NIH3T3- Pml
миРНК клетки, полученные после 0,5 ч лечения IFN-gamma, сильное связывание с мышиным IP-10 промотора наблюдалось (рис 7В, верхняя панель, полоса 5), по сравнению со связыванием видели в миРНК клетках NIH3T3-контроля (дорожка 3). Те же НЭ были подвергнуты консенсусной олигонуклеотида STAT-1, и связывание STAT-1 ДНК усиливается в СВ от NIH3T3- PML
миРНК клетки (рис 7В, средняя панель, сравните полосы 3 и 5). Использование СНУ-638 клеток рака желудка, мы также обнаружили, что ДНК-STAT-1 связывание PML
клетки миРНК-трансфецировали СНУ-638 была увеличена по сравнению с контрольными киРНК-трансфецированных клеток, после обработки IFN-gamma (фиг.7С, сравните полосы 3 и 5). Эти данные указывают на то, что PML частично ингибирует STAT-1 связывание с промотором IP-10, и что этот эффект коррелирует с увеличением ИФН-γ-индуцированной IP-10 транскрипции в отсутствие PML.

Обсуждение

Гистопатологические исследования показали, что воспалительный микроокружение опухоли характеризуется наличием мононуклеарных инфильтратов клеток, как в опорных стромы и опухолевых регионов. Тем не менее, точные механизмы, с помощью которых одноядерные клетки проникают внутрь и выдержаны в тканях рака в настоящее время до конца не изучен. В настоящем исследовании мы предлагаем доказательства того, что потеря экспрессии белка-супрессора, ПМЛ, способствует повышению лимфоцитарной инфильтрации в желудочной ткани рака, с помощью
регуляции экспрессии IP-10.
<Р> Мы исследовали функцию ПМЛ в отношении набора лимфоцитов с использованием образцов тканей желудка человека рак, Pml
<sup>+ /+ и Pml
- /- MEFs и PML нокдаун в обоих NIH3T3 и клетках СНУ-638. Данные, полученные из обоих испытаний тканей человека и миграции анализов Transwell показали, что потеря PML способствует обороту лимфоцитов; Таким образом, мы стремились механизмы, которые могли бы, возможно, объяснить эти наблюдения. Показано, что увеличение уровня IP-10 в раковых клетках, экспрессирующих низкие уровни ПМЛ способствует вербовке лимфоцитов. Кроме того, IP-10 нейтрализующее антитело ингибирует миграцию Т-клеток к кондиционированной среде из NIH3T3 фибробластов и SNU 638 клеток рака желудка в пробирке
, что согласуется с результатами нескольких предыдущих в естественных условиях
исследований , который показал, что нейтрализация IP-10 подавляются Т-клеток набора [39], [40]. Насколько нам известно, это первое исследование, показывающее, что супрессоров опухоли, PML, регулирует IP-10 хемокин транскрипции и незаконный оборот лимфоцитов при раке желудка, путем модуляции активности IFN-γ /STAT-1 сигнального пути.</sup>

IP-10, лимфоцит таргетирования СХС хемокин индуцируется типа I и II интерферонов, играет важную роль при приеме на работу лимфоцитов при нескольких воспалительных состояниях [41]. IP-10 секретируется опухолеподобных инфильтрации иммунных клеток, а также опухолевые и клеток паренхимы в интерферона и цитокина, обогащенный микросреды. TAFs от больных раком легких конститутивно продуцируют и секретируют IP-10 [27]. Гепатоцитов, инфицированных вирусом гепатита С производят IP-10, а также индуцируют миграцию активированных Т-клеток паренхимы печени, что указывает на уровни IP-10, коррелируют с гистологической тяжести и воспаление [42]. В нашей системе секреции IP-10 наблюдалось в рак желудка СНУ-638 клеток, NIH3T3 фибробласты, и MEFs, в ответ на IFN-gamma и секреции усиливалась в отсутствие экспрессии белка PML. Так как мы обнаружили, что не было никаких заметных различий в уровне STAT-1 экспрессии и фосфорилирования в отсутствии или в присутствии PML при IFN-gamma (3 и 7), увеличение ИФН-γ-индуцированной IP-10 транскрипции в отсутствие ПМЛ был вызван в основном повышенной STAT-1 ДНК связывания с IP-10 промотора. Мы полагаем, что PML-опосредованная ингибирование STAT-1 связывания ДНК приводит к подавлению STAT-1-зависимой экспрессии IP-10, в соответствии с нашими предыдущими результатами [17]. В настоящем исследовании мы определяем потенциальную регуляторную область для PML в ИС-10 промотора, который является предполагаемый сайт STAT-1-связывающим. Кроме того, мы покажем, что PML нокдаун увеличение IFN-γ-индуцированной STAT-1 связывания ДНК с промотором IP-10 и увеличивает IP-10 уровней в отсутствие PML.
<Р> Лимфоциты, нейтрофилы, макрофаги, и тучные клетки являются основными компонентами большинства опухолевых инфильтратов. Опухолевые-инфильтрации лимфоциты были идентифицированы в различных солидных раковых тканей. Однако специфические функции таких клеток внутри опухоли, и точные молекулярные механизмы набора лимфоцитов в опухоли, остаются спорными. Статус и функциональная значимость CD8 ^{+ Т-клеточной инфильтрации в опухоли, а объединение таких клеток с прогнозом пациента, также неясно. В почечно-клеточная карцинома, инфильтрация CD8 + Т-клеток связано с благоприятным прогнозом [43]. С другой стороны, такая инфильтрация связана с неблагоприятным прогнозом в немалыми больных раком легкого [33]. Мы здесь, показывают, что экспрессия белка PML в опухолевых клетках обратно коррелирует со степенью инфильтрацией CD8 + Т-клеток в опухолевые ткани. Когда функция PML в лимфатической вторжения рассматривается вместе с ассоциацией между PML выражения и неблагоприятным прогнозом [2], очевидно, что любые отношения между клиническими особенностями и степенью CD8 + Т-клеточной инфильтрации у больных раком желудка требует дальнейшего разъяснения.
<р> Ядра нормальных желез слизистой оболочки желудка, стромальных тканей и лимфоидных клеток были диффузно иммунопозитивные (от умеренной до сильной) для экспрессии белка PML, тогда как уровни PML были сокращены или отменены в опухолевых клетках (рис 1). Эти данные подтверждают идею, что раковые клетки имеют специфические механизмы деградации для PML. Мы предполагаем, что пост-трансляционной Протеасома-зависимой деградации объясняет потерю белка PML. Другими словами, деградация на транскрипционном уровне не действует [2], [44]. экспрессия белка PML уменьшается или отменена во многих различных видов рака, в том числе простаты, молочной железы, ЦНС, толстой кишки, легких и рака желудка [2], [3]. В соответствии с этими результатами, мы наблюдали сокращенным или незначительным экспрессия PML в передовых раковых тканей желудка. Более того, наши результаты свидетельствуют о том, что раковые клетки, экспрессирующие различные уровни белка PML различаются по своей способности привлекать и удерживать лимфоциты в опухолевых областях, обеспечивая тем самым еще одно доказательство, что такие клетки активно участвовать в создании воспалительных опухолей микросреды, с помощью <бр> PML-опосредованных механизмов.
<р> NF-kB и сигнализации STAT-3 предлагается в качестве основных регулирующих систем, связывающих воспаление к раку [45]. ИЛ-6, НФ-kB-зависимого воспалительного фактора роста, имеет важное значение для развития, ассоциированных с воспалением канцерогенезе [46]. Последние косвенные доказательства еще более усилил идею о том, что /STAT-3 сигнализации оси IL-6 /gp130 является как аутокринной и паракринной амплификации в аденокарциномы легкого, множественной миеломы, Ras-трансформированных раковые клетки, а также модель рака колита-ассоциированной [47], [48], [49], [50]. PML было показано, подавляет IL-6-индуцированную активность STAT-3 [51], чтобы способствовать апоптозу через
процесс TNF-опосредованное, и сенсибилизировать клетки к апоптозу путем ингибирования NF-kB-опосредованной выживание пути [52]. Тем не менее, это еще предстоит установить, является ли способствует потере опухолевого супрессора PML к изменениям иммунного ответа хозяина или микроокружения опухоли, может быть, в результате чего либо иммунологического или иммунного побега, путем модуляции факторов транскрипции. Таким образом, было бы интересно сравнить эффекты потери экспрессии белка PML на NF-kB /STAT-3 и STAT-1 сигнализации, а также определить, являются ли эти функции факторов транскрипции скоординированно регулировать экспрессию подмножества хемокинов, способствующие созданию воспалительных опухолей микросреды.}

материалы и методы

Клетки
<р> Первичный и увековечил Pml
<sup>+ /+ и Pml
- /- MEFs были созданы и сохранены, как описано ранее [53]. Желудка человека линии carconoma клеток СНУ-638, Jurkat Т-клеток человека лимфобластный типа клеточной линии, и EL-4 мыши линии Т-клеточные лимфомы поддерживали, как описано ранее [2], [54].</sup>

желудочный ткани карциномы
<р> в общей сложности 49 рака желудка парафиновых блоков были получены из 49 пациентов (29 мужчин, 20 женщин; средний возраст 64 года, диапазон 35-84), перенесшие тотальной или субтотальной резекции желудка на стадии IV расширенный желудочные карциномы в Mokdong больнице, Женский университет Ихва школы медицины, Сеул, Корея с 2001 по 2007 год

Реагенты и антитела
<р> Рекомбинантный мышиный и человеческий IFN-γ (mIFN-γ и hIFN- γ) и MIP-10 и HIP-10 были приобретены у ProSpec (Реховот, Израиль). Антитела к ПМЛ (мышиных моноклональных) и STAT-1 были приобретены у Upstate Biotechnology, Inc. (Лейк-Плэсид, штат Нью-Йорк, США) и нейтрализующих антител к IP-10 был приобретен у фирмы R &Amp; D Systems (Миннеаполис, Миннесота, США). Антитела к р-Y701-STAT-1 был приобретен у Cell Signaling Technology (Беверли, Массачусетс). Антитела к гистона, ламина В и ПМЛ (кроличьи поликлональные) были приобретены у Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, США), и анти-тубулина антител был приобретен у фирмы Sigma-Aldrich, Co. (Сент-Луис, штат Миссури, США) .

Immunohistochemistry, подсчет клеток, а также измерение иммунореактивного областей

желудка человека раковых тканей были обработаны для иммуногистохимического анализа, как описано ранее [2] с незначительными изменениями. были использованы первичные антитела для PML (1:200; Santa Cruz Biotechnology), CD8 (1:50; Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, USA), а также IP-10 (D Systems 1:50;, R &). Все слайды были контрастно гематоксилином Майера. Положительный контроль были получены с использованием небные миндалины для белка PML и CD8 и носоглотки недифференцированных карцином для IP-10. Отрицательные контроли были получены путем исключения первичных антител из всех слайдов. Иммунопозитивность для белка PML был отнесен к категории диффузный позитивности (ядерный иммунореактивности в ≥50% опухолевых клеток), фокусного позитивности (в ≥10%, но и ЛТ, 50%), либо к полной потере (в &л; 10% опухолевых клеток). Числа CD8 иммуноположительных клеток в одном поле высокой мощности (HPF, x40) 0,25 мм ^{2 для пяти случайно выбранных опухолей инфильтративных границ подсчитывали для каждого образца, с последующим расчетом среднего числа и SD. Иммунопозитивность для IP-10 был определен как любой ядерной или цитоплазматической положительной экспрессии в опухолевых клетках. Для определения выраженный уровень каждого слайда, цифровые изображения были получены с помощью микроскопа монтажа цифровой фотоаппарат. Использование ImageJ программного обеспечения (http://rsb.info.nih.gov/ij~~HEAD=dobj), каждое изображение было преобразовано в 8-битных оттенков серого и площади плотностей были измерены из пикселей в интересующей области; только пиксели превышающие определенный уровень (> 50 значение интенсивности). были включены, чтобы устранить ошибку фона}

миРНК трансфекция
<р> NIH3T3 клетки трансфицированы с использованием Mirus трансфекции реагента (Mirus Bio LLC, Madison,

• PLoS ONE: Подавление RPL6 по миРНК подавляет пролиферацию и клеточного цикла Прогрессирование человеческого рака …
• PLoS ONE: MIR-29a Тормозит пролиферацию клеток и индуцирует остановку клеточного цикла через подавление p42.3 в челове…