PLOS ONE: pérdida de la proteína de la leucemia promielocítica en el cáncer gástrico: Implicaciones para la IP-10 Expresión y linfocitos infiltrantes de tumores,

Extracto

El cáncer gástrico es una de las causas más frecuentes de mortalidad relacionada con el cáncer en todo el mundo. La expresión de la proteína supresora de tumores, leucemia promielocítica (PML), se reduce o abolida en los carcinomas gástricos, en asociación con un mayor nivel de invasión linfática, el desarrollo de una mayor puesta en escena pTNM, y el pronóstico desfavorable. En este documento, se investigó la relación entre la extensión de los linfocitos infiltrantes de tumor y el estado de expresión de la proteína PML en el carcinoma gástrico avanzado. Se observó un mayor número de infiltrarse en las células T en los tejidos de carcinoma gástrico en el que la expresión de PML fue de reducción o derogación, en comparación con los tejidos positivos para la LMP. El alcance de la migración de células T hacia sobrenadantes de los cultivos obtenidos a partir de líneas celulares de carcinoma gástrico interferón-gamma (IFN-estimulado-γ, además, fue afectada por la expresión de PML in vitro
. Proteína interferón-gamma-inducible 10 (IP -10 /CXCL10) expresión se incrementó en los tejidos de carcinoma gástrico se presentan los niveles de PML reducidos. Además, tanto Pml
expresión IP-10 ARNm y proteínas knockout y desmontables células mostradas mejorada en presencia de IFN-γ. knockdown PML aumento de IFN-γ mediada transductor de señales y activador de la transcripción-1 (STAT-1) de unión al promotor de IP-10, lo que resulta en la transcripción elevada del gen de IP-10. por el contrario, PML IV expresión de la proteína suprimida IP-10 la activación del promotor . Basándose en estos resultados, se propone que la pérdida de expresión de la proteína PML en células de cáncer gástrico contribuye a un aumento de IP-10 de transcripción vía
mejora de la actividad STAT-1, que, a su vez, promueve el tráfico de linfocitos dentro de las regiones tumorales .

Visto: Kim HJ, Song DE, Lim SY, Lee SH, Kang JL, Lee SJ, et al. (2011) La pérdida de la proteína de la leucemia promielocítica en el cáncer gástrico: Implicaciones para la IP-10 Expresión y infiltrantes de tumores, los linfocitos. PLoS ONE 6 (10): e26264. doi: 10.1371 /journal.pone.0026264

Editor: Yoshio Yamaoka, Veterans Affairs Medical Center (111D), Estados Unidos de América

Recibido: 21 Abril, 2011; Aceptado: September 23, 2011; Publicado: 12 Octubre 2011

Derechos de Autor © 2011 Kim et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Investigación de Ciencias básicas a través de la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología (2010 a 0.015.506) a y-HC, por la Fundación Nacional de Investigación de Corea (NRF), financiado por el gobierno de Corea (MEST) (2010-0029353) para JLK, y por RO1 NS50665 de ENB. Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

el cáncer gástrico es una de las causas más frecuentes de muerte por cáncer en todo el mundo. Los recientes avances en la genética han facilitado la detección de eventos que se producen durante el curso de la carcinogénesis gástrica, incluyendo la activación de oncogenes, silenciamiento de genes supresores de tumores, y la mutación de genes implicados en la reparación del ADN [1]. Entre estos eventos genéticos, se sabe que la expresión de supresor de tumores leucemia promielocítica proteína (PML) se reduce o se suprimió en el cáncer gástrico, y que esto está asociado con más extensa invasión linfática, mayor puesta en escena pTNM, y el pronóstico desfavorable, lo que sugiere que la pérdida de PML es vinculada a la progresión de la carcinogénesis y gástrica carcinoma [2]. Estudios anteriores implicado Pml
disfunción en la progresión de una variedad de cánceres, y reducido o suprimido la expresión de PML ha sido reportado en la próstata, de mama, del sistema nervioso central, colon, pulmón y cánceres gástricos [2], [3] .

el Pml
gen fue identificado originalmente por fusión con el receptor de ácido retinoico que participan en la translocación t (15; 17) translocación cromosómica asociada con la leucemia promielocítica aguda (APL) [4], [ ,,,0],5], [6], [7], [8]. PML es una proteína supresora de tumores que regula la progresión del ciclo celular, la transcripción de genes, la supresión de la transformación, y la apoptosis. Pml
ratones knockout son considerablemente más sensibles a la formación de tumores después de la exposición a agentes carcinógenos que son los controles de tipo salvaje, y Pml
deficiente en las células son menos propensas a sufrir apoptosis después de la aplicación de tipos particulares de estrés celular [9]. Además de los informes que se centran en el papel desempeñado por supresor de tumores PML, varios estudios han confirmado que la proteína actúa como un regulador transcripcional, a través de
asociación con la proteína co-activador de CREB vinculante; co-represores incluidos HDAC, N-CDR y mSin3A; y los factores de transcripción Nur77, AP-1, myc, p53, y STAT-1α [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17].

mutación progresiva de alteraciones genéticas y en varios genes supresores de tumores promueven el desarrollo y progresión del tumor [18]. Además de las alteraciones genéticas en las células tumorales, tanto en las células inflamatorias y los mediadores contribuyen a la formación de microambientes tumorales particulares [19], [20]. fibroblastos asociados a tumores (TAF) y macrófagos (TAMs) también están implicados en la modulación de la microambiente tumoral vía
producción de citocinas, quimiocinas, interferones, y otros factores biológicamente activos [21], [22]. Cross-talk entre las células tumorales, TAF, TAM, y linfocitos, es importante en el desarrollo y progresión del tumor, y contribuye al establecimiento de microambientes tumorales enriquecidos en la expresión de una variedad de factores biológicamente activos [23], [24], [25] , [26], [27].

TAM se encuentran en correlación con la angiogénesis y un pronóstico desfavorable en varios tipos de cáncer, incluyendo el cáncer gástrico [22], [28]. mastocitos produce muchos factores angiogénicos y una variedad de citoquinas, y su densidad se ha informado que se correlaciona altamente con el grado de neoangiogénesis tumoral y mal pronóstico [29], [30]. CD4 ^{+ y CD8 + linfocitos también se encuentran en una variedad de tejidos de cáncer de sólidos. Hasta ahora, son en gran parte desconocidos los mecanismos moleculares precisos por los cuales el tipo y el número de células tumorales infiltrantes son regulados. Hay varios informes controvertidos en relación con el número y la función de los linfocitos infiltrantes de tumor. Especialmente, CD8 + T linfocitos, mientras que su función se conoce para eliminar las células transformadas nacientes y contribuir a la inmunovigilancia [31], se ha informado que las células T CD8 + infiltrantes de tumor son defectuosos en función de fase efectora al entrar en contacto con células tumorales [32], y su infiltración está vinculada a pronóstico desfavorable en ciertos tipos de cáncer como el cáncer no microcítico de pulmón de células y el carcinoma nasofaríngeo [33], [34].}

Las quimiocinas secretadas por las células del estroma o tumor células influir en la migración de células tumorales, invasión, la proliferación, la angiogénesis y la infiltración de células inmunes en la masa del tumor [35]. IFN-γ-inducible proteína-10 (IP-10, CXCL10) es una de las quimiocinas CXC que desempeña múltiples funciones en enfermedades inflamatorias y cáncer [36], [37]. Desde IP-10 promueve preferentemente Th1 respuesta inmune mediante la atracción de robustamente células NK y T, se sugiere como uno de los posibles mecanismos de la infiltración de células T a los tumores.

Ya sea la pérdida de genes supresores de tumores en células tumorales induce el reclutamiento de los linfocitos y la modulación de las funciones de estas células dentro de microambientes tumor es claro en la actualidad. En el presente estudio, se examinó la función de la LMP con respecto al reclutamiento de linfocitos y la modulación de la expresión de factores derivados del tumor. La expresión de PML se correlacionó inversamente con el grado de infiltración de CD8 ^{+ células T en los carcinomas gástricos. pérdida PML se asoció más con una mayor expresión de IP-10, una de las quimiocinas CXC linfocitos atraer, en células de carcinoma gástrico y tejidos. PML knockdown promovido mediada por IFN-γ STAT-1 de unión al promotor de IP-10, lo que resulta en aumento de la transcripción del gen de la IP-10. Nuestros datos apoyan la noción de que la PML está involucrado en el reclutamiento de linfocitos en los tumores, a través de
modulación de los niveles de expresión de factores derivados del tumor, incluyendo IP-10, proporcionando una prueba más que la pérdida de genes supresores de tumores en el tumor células participa activamente en el establecimiento de microambientes tumorales.}

resultados

la pérdida de la proteína PML se asocia con aumento de la infiltración de células CD8 ^{+ T-células en tejido de carcinoma gástrico avanzado}

tinción inmunohistoquímica para PML y CD8 se realizó para explorar si el grado de infiltración de linfocitos se asoció con el estado de la expresión de PML en el cáncer gástrico avanzado. Se enumeraron las células CD8-immunopositive como se describe en Materiales y Métodos. En total, 35 muestras (71,4%) mostraron pérdida parcial a completa de LMP en los núcleos de las células del tumor de estadio IV carcinomas gástricos avanzados. Las muestras de 14 pacientes con carcinoma gástrico avanzado fueron difusamente positiva para PML, y contenían un promedio de 32,7 CD8 ^{+ T-células por campo (Figura 1A). Se identificaron 19 casos de carcinoma gástrico avanzado que presentan positividad focal para la LMP, con un promedio de 47,2 CD8 + T-células por campo. Por otra parte, se observó una pérdida completa de la LMP en 16 pacientes con carcinoma gástrico avanzado; las muestras contenían un número promedio de 52,8 CD8 + T-células por campo. Las muestras que presentan positividad focal o pérdida completa de LMP mostraron un aumento más marcado en CD8 + número de células T que lo hicieron muestras que exhiben positividad difusa para la LMP. Imágenes representativas se muestran en la Figura 1B. Aunque la expresión de proteínas PML fue reducido o suprimido en células tumorales, todas las glándulas gástricas normales de las mucosas, los tejidos del estroma y células linfoides, exhibido difusa immunopositivity nuclear moderada a fuerte para la LMP.}

influencias PML la infiltración de células T /migración in vitro

a la vista de la pérdida de la expresión de la proteína PML y el aumento de la infiltración de células CD8 ^{+ T-linfocitos en tejidos de carcinoma gástrico avanzado, la hipótesis de que la PML contribuyó a la infiltración de células T /migración en el cáncer gástrico. Para explorar si el nivel de PML en células de cáncer gástrico influenciada la migración de células T, los medios condicionados a partir de células SNU-638 transfectadas de forma transitoria con cualquiera de Pml
siRNA o PML IV vector de expresión, entonces se trató con IFN-γ se utilizó en transwell ensayos de migración. SNU-638 células de cáncer gástrico expresaron altos niveles de la proteína PML, en consonancia con los resultados anteriores [2], mientras que las células SNU-638 transfectadas con Pml
siRNA visualiza los niveles de expresión endógena PML reducida (~46-56%) , como se confirmó por inmunotransferencia (Figura 2A). IFN-γ inducida por un aumento modesto en la expresión de la proteína PML, de acuerdo con los resultados anteriores [38]. La migración de las células T Jurkat hacia medio condicionado de Pml
células SNU-638 siRNA transfectadas fue significativamente mayor, en comparación con la de las células transfectadas de control siRNA, después del tratamiento con IFN-γ (Figura 2B). Tras la transfección de SNU-638 con PML IV vector de expresión, la migración de las células T Jurkat hacia el medio acondicionado a partir de células sobreexpresados ​​PML IV se redujo en comparación con el de vector vacío (Figura 2C). Estos resultados sugieren que PML regula los niveles de moléculas secretoras producidas por y liberados de IFN-γ estimulada por células de cáncer gástrico, y también influye en la migración de linfocitos T.}

Pérdida de PML mejora IFN-γ inducida IP-10 expresión

Las quimioquinas, una familia de citoquinas quimiotácticas, promover la migración de los leucocitos circulantes /linfocitos a los sitios de inflamación y lesiones. Para explorar si los niveles de quimioquinas se vieron afectados por Pml
estado genético, la expresión génica de quimioquinas se examinó mediante ensayo de protección de ribonucleasa (RPA). Pml
<sup>+ /+ y Pml
- /- fibroblastos embrionarios de ratón de las células (MEF) se incubaron en ausencia o presencia de IFN-γ por 0-24 h , el ARNm total se recoge en varios puntos de tiempo, y se sometió a RPA. En Pml
- /- MEF, IP-10 aumentaron los niveles de ARNm de 1,5 veces a las 2 h, y se convirtió marcadamente elevados (8 veces) por 4 h (Figura 3A). los niveles de ARNm de RANTES se incrementaron 3,2 veces a 0,5 h, y se mantuvo elevada, pero en un grado menor (1,3 veces), 8 h de tratamiento post-IFN-γ en Pml
- /- MEFs . Otros genes de quimioquinas, incluyendo MIP-1, MIP-2 y MCP-1, no se expresaron de forma detectable en Pml
+ /+ o Pml
- /- MEFs (datos no mostrados). STAT-1 de expresión se incrementó después de la exposición a IFN-γ en ambos tipos de células, pero ninguna diferencia fue evidente cuando los niveles de IFN-gamma se compararon entre Pml
+ /+ y Pml
- /- las células. A medida que la transcripción del gen de la IP-10 se elevó sustancialmente en IFN-γ-estimulado Pml
- /- MEF, que mide los niveles de proteínas relevantes en sobrenadantes de cultivo de Pml
+ /+ y Pml
- /- MEF, usando un ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). Consistente con los resultados del EPR, los niveles más altos de proteína IP-10 eran evidentes en medio condicionado de tratados IFN-γ Pml
- /- MEFs (Figura 3B). También, IP-10 expresión de ARNm en Pml
células NIH3T3 siRNA transfectadas se mejoró, comparado con la de las células transfectadas de control siRNA, después del tratamiento de IFN-γ (Figura 3C). La reducción en la expresión de la proteína PML en Pml
células NIH3T3 transfectadas con siRNA-fue confirmada por inmunotransferencia.</sup>

expresión de PML Reducido está inversamente correlacionada con IP-10 niveles de proteína en el tejido de cáncer gástrico y SNU- 638 células

a continuación, se examinó la relación entre la PI-10 y la expresión de la proteína PML en tejido de carcinoma gástrico avanzado. cáncer de los tejidos se tiñeron inmunohistoquímicamente para PML y IP-10, y se midió la intensidad de IP-10 immunopositivity como se describe en Materiales y Métodos. La intensidad media de IP-10 fue de 1,2 en 14 muestras que muestran positividad difusa (DP) para la LMP, 2,2 en 19 casos de positividad focal (FP), y 2.0 en 16 muestras en las que no hubo pérdida total (CL) de la expresión de PML ( Figura 4A, panel izquierdo). Se observaron incrementos significativos en la expresión de IP-10 en muestras que muestra positividad focal de la LMP ( P = 0,034
), en comparación con aquellos que muestra la expresión de PML positiva difusa. Un aumento en la expresión de IP-10 se observó cuando la pérdida completa de la LMP fue evidente, en comparación con lo que se observó cuando la LMP fue expresada de forma difusa; Sin embargo, esta diferencia no alcanzó significación estadística. Los ejemplos representativos de las variaciones en el estado de la proteína PML que se correlacionaron con diferentes IP-10 niveles de expresión en las células tumorales de carcinomas gástricos avanzados se muestran (Figura 4A, derecha). Para examinar más a fondo la relación entre la expresión de la proteína IP-10 y PML en líneas celulares de carcinoma gástrico, IP-10 los niveles de proteína se midieron en sobrenadantes de cultivo de células SNU-638 transfectadas transitoriamente, ya sea con Pml
siRNA o PML IV exression vector. Las células se cultivaron en ausencia o presencia de IFN-γ por 8 h, los sobrenadantes recogidos, y IP-10 niveles cuantificados en la misma (por ELISA). inducida por IFN-γ secreción de IP-10 fue significativamente mayor en SNU-638- Pml
células siRNA-transfectadas, en comparación con la de SNU-638 células transfectadas con ARNsi de control (Figura 4B). La transfección de SNU-638 con PML IV vector de expresión suprimida inducida por IFN-γ IP-10 secreción (Fig 4C). Los resultados muestran claramente que la secreción de IP-10 a partir de células de cáncer gástrico aumenta cuando se reduce la expresión de PML.

IP-10 de neutralización disminuye la migración de las células T

Pml
células que contienen el siRNA que expresan niveles reducidos de la proteína PML mostraron mejora del reclutamiento de células T y la secreción de IP-10 en respuesta a IFN-γ (Figuras 2 y 4), el próximo examinó si un aumento de la IP- 10 niveles facilitan la migración de células T hacia el medio acondicionado a partir de 638 SNU-células de cáncer gástrico estimuladas por IFN-γ. SNU-638- Pml
células siRNA se cultivaron en ausencia o presencia de IFN-γ por 8 h, y los sobrenadantes recogidos se trataron previamente con un anticuerpo neutralizante anti-IP-10 o el control de IgG no específica para 1 h, antes del comienzo del ensayo transwell. sobrenadantes de anticuerpos neutralizantes o IgG que contienen se colocaron en las cámaras inferiores, y se analizó la migración de las células Jurkat de superior a las cámaras inferiores mediante el examen de las células recolectadas de las cámaras inferiores. La inclusión de IP-10-anticuerpos neutralizantes inhibió la migración de las células T Jurkat hacia medio condicionado de SNU-638- Pml
siRNA células (Figura 5A). Estos resultados son consistentes con los datos obtenidos a partir de células NIH3T3; un anticuerpo IP-10 neutralizantes inhibió EL-4 migración de células T hacia medio condicionado de NIH3T3- Pml
células siRNA (Figura 5B).

knockdown PML mejora IP-10 promotor de activación

Como IP-10 expresión se incrementó en las células PML desmontables, hemos explorado más a fondo si la expresión de proteínas PML afectada IP-10 la actividad promotora. El IP-10 promotor murino contiene un elemento GAS-como putativo que se encuentra entre -246 y -238 NTS (TTN _{5AA) (Figura 6A). Hemos informado anteriormente de que la PML regula negativamente la actividad transcripcional de STAT-1 [17]. Para determinar si la LMP afectó inducida por IFN-γ IP-10 la expresión génica a través de un mecanismo que implica
STAT-1, se aisló y se generó una construcción de reporte que comienza en la posición -330 del promotor IP-10 murino que contiene el putativo elemento similar al gas, tal como se describe en Materiales y Métodos. La IP-10 luc
reportero que contiene el elemento GAS-como se transfectó transitoriamente en células NIH3T3 se incubaron con o sin IFN-γ durante 24 h, y posteriormente se ensayó la actividad de luciferasa. inducida por IFN-γ IP-10 la actividad del promotor fue significativamente mayor en las células NIH3T3 transfectadas con Pml
siRNA, en comparación con las células que reciben el control de siRNA (Figura 6B). Tras la transfección de las células NIH3T3 con el vector de expresión LMP IV, inducida por IFN-γ IP-10 la activación del promotor fue reprimida significativamente. Regulación a la baja de la expresión de PML utilizando Pml
siRNA y la sobreexpresión de la LMP por PML IV vector de expresión fueron verificados por inmunotransferencia. Para determinar si se ha producido el efecto inhibidor de PML en inducida por IFN-γ actividad promotora IP-10 en gástricas líneas de células cancerosas, hemos realizado experimentos similares con SNU-638 células de cáncer gástrico. Los patrones de aumento y disminución de la actividad de luciferasa en SNU-638 fueron similares a la de las células NIH3T3 (Figura 6C). El nivel de expresión de la proteína PML en células SNU-638 transfectadas con cualquiera de Pml
siRNA o PML IV vector de expresión se verificó mediante inmunotransferencia (datos no mostrados).}

PML aumenta desmontables IFN-γ- se examinó inducida STAT-1 vinculante para el promotor IP-10

el efecto de la LMP en IFN-γ inducida por STAT-1 vinculante para el promotor IP-10 ADN ADN. PML sobreexpresión de la proteína en las células NIH3T3, después de la transfección transitoria con el vector de expresión LMP IV, parcialmente bloqueado IFN-γ inducida por ADN STAT-1 de unión al promotor de IP-10, que incluye la secuencia en -246 a -238 (Figura 7A, comparar carriles 3 y 5). Competencia utilizando un exceso de oligonucleótido no marcado 100-molar que codifica el promotor IP-10 abrogó la formación de complejos (carril 6). Los niveles de PML y STAT-1 expresión de la proteína en lisados ​​de células enteras (CMT) y el grado de STAT-1 fosforilación de la tirosina en extractos nucleares (NE) se verificaron mediante inmunotransferencia. Utilizando NE de NIH3T3- Pml
células siRNA obtenidos después de 0,5 h de tratamiento con IFN-γ, fuerte unión a la IP-10 promotor murino se observó (Figura 7B, panel superior, carril 5), en comparación con la unión visto en células de siRNA de control NIH3T3 (carril 3). Los mismos elementos de red se expusieron al consenso oligonucleótido STAT-1, y la unión de STAT-1 DNA se mejoró en el NE de NIH3T3- Pml
células siRNA (Figura 7B, panel central, comparar los carriles 3 y 5). Usando 638 SNU-células de cáncer gástrico, también encontramos unión que STAT-1 DNA de Pml
células SNU-638 siRNA transfectadas se mejoró en comparación con la de las células transfectadas de control siRNA, después del tratamiento con IFN-γ (Figura 7C, comparar los carriles 3 y 5). Estos datos indican que PML inhibe parcialmente STAT-1 de unión al promotor de IP-10, y que este efecto se correlaciona con la inducida por IFN-γ aumento de IP-10 de la transcripción en ausencia de PML.

Discusión

estudios histopatológicos han demostrado que el microambiente inflamatorio de los tumores se caracteriza por la presencia de infiltrados de células mononucleares, tanto en las regiones del estroma y del tumor de apoyo. Sin embargo, los mecanismos precisos por los cuales las células mononucleares se infiltran dentro y se sustentan en los tejidos de cáncer son actualmente no se comprenden totalmente. En el presente estudio, se aporta evidencia de que la pérdida de expresión de la proteína supresora de tumores, PML, contribuye a elevar la infiltración de linfocitos en el tejido de cáncer gástrico, a través de
regulación de la expresión de IP-10.

Se examinó la función de la LMP con respecto al reclutamiento de linfocitos a partir de muestras de tejido de cáncer gástrico humano, Pml
<sup>+ /+ y Pml
- /- MEF, y el PML desmontables en tanto NIH3T3 y células SNU-638. Los datos obtenidos de las dos pruebas de tejido humano y los ensayos de migración transwell mostraron que la pérdida de la LMP promueve el tráfico de linfocitos; por lo tanto, buscamos mecanismos que posiblemente podrían explicar estas observaciones. Se demuestra que un aumento en los niveles de IP-10 en las células cancerosas que expresan niveles bajos de PML contribuye a reclutamiento de linfocitos. Además, IP-10 anticuerpo neutralizante inhibe la migración de células T hacia medio condicionado de fibroblastos NIH3T3 y 638 SNU-células de cáncer gástrico in vitro
, en consonancia con los resultados de varios in vivo
estudios previos , lo que demuestra que la neutralización de IP-10 suprimió el reclutamiento de células T [39], [40]. A lo mejor de nuestro conocimiento, este es el primer estudio que muestra que el supresor de tumores, PML, regula IP-10 de transcripción de quimiocinas y el tráfico de linfocitos en el cáncer gástrico, mediante la modulación de la actividad de la vía de señalización de IFN-γ /STAT-1.</sup>

IP-10, una quimiocina CXC linfocitos inducida por la orientación tipo I y II IFNs, juega un papel importante en el reclutamiento de linfocitos en varias condiciones inflamatorias [41]. IP-10 se secreta por las células inmunes infiltrantes de tumor, y también por las células tumorales y de parénquima en un microambiente interferón y citoquina enriquecida. TAF de pacientes con cáncer de pulmón constitutivamente producen y secretan IP-10 [27]. Los hepatocitos infectados con el virus de la hepatitis C producen IP-10, e inducen la migración de células T activadas en el parénquima del hígado, lo que indica que los niveles de IP-10 se correlacionan con la gravedad histológica y la inflamación [42]. En nuestro sistema, se observó IP-10 secreción en el cáncer gástrico células SNU-638, fibroblastos NIH3T3 y MEFs, en respuesta a IFN-γ, y la secreción se mejoró en la ausencia de expresión de la proteína PML. Como hemos constatado que no hubo diferencias apreciables en el nivel de STAT-1 de expresión y la fosforilación en ausencia o presencia de PML en IFN-γ (figuras 3 y 7), el aumento inducido por IFN-γ IP-10 de la transcripción en ausencia de LMP fue causado principalmente por un aumento de STAT-1 vinculante para IP-10 promotor de ADN. Sugerimos que la inhibición de STAT-1 cables de unión a la supresión de STAT-1 dependiente de IP-10 expresión de ADN, PML-mediada de acuerdo con nuestros hallazgos anteriores [17]. En el presente estudio, identificamos una región reguladora potencial de PML en el promotor de IP-10, que es un sitio de STAT-1 de unión putativo. Además, se muestra que STAT-1 DNA PML desmontables aumenta IFN-γ inducida por la unión al promotor de IP-10, y aumenta los niveles de IP-10 en ausencia de PML.

linfocitos, neutrófilos, macrófagos, y los mastocitos son los principales componentes de la mayoría de los infiltrados tumorales. los linfocitos infiltrantes de tumor se han identificado en una variedad de tejidos de cáncer de sólidos. Sin embargo, las funciones específicas de dichas células dentro de los tumores, y los mecanismos moleculares precisos de reclutamiento de linfocitos en los tumores, siguen siendo controvertidos. La situación y la relevancia funcional de las células CD8 infiltración ^{+ de células T en los tumores, y la asociación de este tipo de células con el pronóstico del paciente, tampoco están claros. En el carcinoma de células renales, la infiltración de células CD8 + células T se asocia con un pronóstico favorable [43]. A la inversa, como la infiltración está vinculada a pronóstico desfavorable en pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas [33]. Nosotros aquí muestran que la expresión de proteínas PML en las células tumorales se correlaciona inversamente con el grado de infiltración de CD8 + células T en los tejidos tumorales. Cuando la función de LMP en la invasión linfática es considerado junto con la asociación entre la expresión de PML y pronóstico desfavorable [2], es evidente que cualquier relación entre las características clínicas y la extensión de las células CD8 infiltración + de células T en pacientes con cáncer gástrico requiere una aclaración adicional.}

Los núcleos de las glándulas mucosas gástricas normales, tejidos estromales y células linfoides fueron difusamente immunopositive (moderada a fuerte) para la expresión de la proteína PML, mientras que los niveles de PML fueron reducirse o suprimirse en las células tumorales (Figura 1). Estos hallazgos apoyan la idea de que las células cancerosas tienen mecanismos de degradación específicos de la LMP. Proponemos que la degradación posterior a la traducción proteasoma dependiente explica la pérdida de la proteína PML. En otras palabras, la degradación en el nivel transcripcional no es operativa [2], [44]. expresión de la proteína PML es reducida o suprimida en muchos tipos de cánceres, incluyendo próstata, mama, CNS, colon, pulmón y cáncer gástrico [2], [3]. De acuerdo con estos resultados, se observó una expresión reducida o insignificante de LMP en los tejidos de cáncer gástrico avanzado. Por otra parte, nuestros resultados sugieren que las células cancerosas que expresan diferentes niveles de la proteína PML varían en su capacidad de atraer y retener a los linfocitos en las zonas tumorales, lo que proporciona más evidencia de que estas células participan activamente en el establecimiento de microambientes tumorales inflamatorias, a través de
mecanismos PML-mediada.

se proponen NF-kB y la señalización de STAT-3 para servir como sistemas reguladores principales que unen la inflamación con el cáncer [45]. IL-6, un factor de crecimiento inflamatorio NF-kappa B-dependiente, es esencial para el desarrollo de la inflamación asociada a la carcinogénesis [46]. evidencia circunstancial recientes han reforzado aún más la idea de que el /STAT-3 eje de señalización de IL-6 /gp130 sirve tanto como un bucle de amplificación autocrina y paracrina en el adenocarcinoma de pulmón, células de cáncer de mieloma múltiple, Ras transformadas, y un modelo de cáncer de colitis asociada [47], [48], [49], [50]. PML se ha demostrado que suprimir inducida por IL-6 la actividad STAT-3 [51], para promover la apoptosis a través de un proceso
mediada por TNF, y para sensibilizar a las células a la apoptosis mediante la inhibición de la supervivencia mediada por NF-kB vía [52]. Sin embargo, queda por establecer si la pérdida de la PML supresor de tumor contribuye a los cambios en la respuesta inmunitaria del huésped o el microambiente tumoral, tal vez resultando en cualquiera inmunovigilancia o escape inmune, mediante la modulación de factores de transcripción. Por lo tanto, sería interesante comparar los efectos de la pérdida de expresión de la proteína PML en NF-KB /STAT-3 y STAT-1 de señalización, y para determinar si estas funciones factores de transcripción de una manera coordinada para regular la expresión de un subconjunto de quimiocinas que contribuyen a la creación de microambientes tumorales inflamatorias.

Materiales y Métodos

las células

primaria y inmortalizado Pml
<sup>+ /+ y Pml
- /- MEFs fueron creados y mantenidos tal como se describe anteriormente [53]. La línea celular carconoma gástrico humano SNU-638, se mantuvieron las células T línea celular de linfoblastos humanos-como Jurkat, y EL-4 líneas celulares de linfoma T de ratón como se describe anteriormente [2], [54].</sup>

tejidos de carcinoma gástrico

Un total de 49 bloques de parafina de carcinoma gástrico se obtuvieron de 49 pacientes (29 varones, 20 mujeres, edad media 64 años, rango 35-84) que habían sido sometidos a una gastrectomía total o subtotal para el estadio IV avanzaron los carcinomas gástricos en el hospital Mokdong, Mujeres Ewha Escuela Universitaria de Medicina, Seúl, Corea de 2001 a 2007.

Reactivos y anticuerpos

murina recombinante IFN-γ y humana (mIFN-γ y hIFN- γ) y MIP-10 y el hip-10 se adquirieron de ProSpec (Rehovot, Israel). Los anticuerpos contra PML (monoclonal de ratón) y STAT-1 se adquirieron de Upstate Biotechnology, Inc. (Lake Placid, NY, EE.UU.) y anticuerpos neutralizantes de IP-10 fue adquirido de amplificador de I + D; D Systems (Minneapolis, MN, USA). El anticuerpo para p-Y701-STAT-1 se adquirió de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Los anticuerpos frente a la histona, Lamin B y LMP (policlonal de conejo) fueron adquiridos de Santa Cruz de Biotecnología (Santa Cruz, CA, EE.UU.), y el anticuerpo anti-tubulina se adquirió de Sigma-Aldrich, Co. (St. Louis, MO, EE.UU.) .

inmunohistoquímica, los recuentos de células, y la medición de zonas inmunorreactivas

tejidos de cáncer gástrico humano se procesaron para el análisis inmunohistoquímico como se describe anteriormente [2], con modificaciones menores. Se utilizaron anticuerpos primarios para PML (1:200; Santa Cruz Biotechnology), CD8 (1:50; Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, EE.UU.), e IP-10 (D Systems 01:50;; R &). Todas las diapositivas se counterstained con hematoxilina de Mayer. Los controles positivos se obtuvieron utilizando amígdalas palatinas para la proteína PML y CD8, y carcinomas indiferenciados nasofaríngeas para IP-10. Los controles negativos fueron obtenidos por la omisión de los anticuerpos primarios a partir de todas las diapositivas. Immunopositivity para la proteína PML se clasificó como positividad difusa (inmunoreactividad nuclear en ≥50% de las células tumorales), positividad focal (en ≥10% pero < 50%), o pérdida completa (en < 10% de las células tumorales). El número de células inmunopositivas CD8 en un campo de alta potencia (HPF, x40) de 0,25 mm ^{2 para cinco bordes infiltrantes tumorales seleccionados al azar se contaron para cada muestra, seguido de cálculo de la media del número y SD. Immunopositivity para IP-10 se definió como cualquier expresión positiva nuclear o citoplásmica en las células tumorales. Para determinar el nivel expresado de cada portaobjetos, las imágenes digitales se obtuvieron utilizando una cámara digital microscopio montado. El uso de software ImageJ (http://rsb.info.nih.gov/ij), cada imagen se convirtió en escala y en la zona de las densidades de grises de 8 bits fueron medidos a partir de los píxeles de la región de interés; Sólo píxeles superior a un cierto nivel (> 50 valor de intensidad). Se incluyeron para eliminar el error de fondo}

siRNA transfección

NIH3T3 células fueron transfectadas transitoriamente utilizando el reactivo de transfección Mirus (Mirus Bio LLC, Madison,

• PLOS ONE: regulación a la baja de RPL6 de siRNA inhibe la proliferación y la progresión del ciclo celular de la célula del cáncer gástrico humano Lines
• PLOS ONE: miR-29a inhibe la proliferación celular e induce la detención del ciclo celular a través de la regulación a la baja de p42.3 en gástrico humano Cancer