PLoS ONE: Gubitak promijclocitnu leukemiju proteina u rak želuca: implikacije za IP-10 izražavanja i uvlače u tumor limfocita

Sažetak pregled

Rak želuca je jedan od najčešćih uzroka smrtnosti od raka povezanih širom svijeta. Izraz tumor supresor, promijelocitne leukemije (PML) proteina je smanjena ili ukinuta u želučanim karcinoma, u sprezi s povećanom razinom limfna invazija, razvoj visokog pTNM namjestiti i lošom prognozom. Ovdje, istražili smo odnos između visine tumor infiltracije limfocita i status PML ekspresije proteina u naprednom želučanog karcinoma. opazili smo veći broj infiltrirajućih T-stanica u želučanom tkivu karcinoma u kojoj PML ekspresija je smanjena ili ukinuta u usporedbi s tkivima pozitivne za PML. Stupanj T-stanične migracije prema supernatanta kulture dobivene od interferona-gama (IFN-γ-stimuliranim stanicama karcinoma želuca dodatno utječe ekspresija PML in vitro pregled. Interferon-gamma-inducibilni protein 10 (IP -10 /CXCL10) ekspresija povećana u želučanom tkivu karcinoma prikazivanje smanjene razine PML. Nadalje, i PML pregled nokautiranih i obaranje stanice prikazani poboljšane IP-10 mRNA i protein ekspresija u prisustvu IFN-gama. PML obaranje povećava IFN-γ-signal sonde i aktivatora transkripcije-1 (STAT-1), koji se veže za IP-10 promotora, što rezultira povišenim transkripciju IP-10 gena. Suprotno tome, PML IV ekspresija proteina potisnuta IP-10 aktiviranje promotora . na temelju tih rezultata, predlažemo da se gubitak PML ekspresije proteina u želučanim stanicama raka doprinosi većoj IP-10 transkripcije preko
unapređenje STAT-1 aktivnost, koja je, pak, potiče trgovinu limfocita u tumorskim regijama . pregled

Izvor: Kim HJ, Song DE, Lim SY, Lee SH, Kang JL, Lee SJ, et al. (2011) Gubitak promijclocitnu leukemiju proteina u rak želuca: implikacije za IP-10 izražavanja i uvlače u tumor limfocita. PLoS ONE 6 (10): e26264. doi: 10,1371 /journal.pone.0026264 pregled

Urednik: Yoshio Yamaoka, branitelja Medical Center (111D), United States of America pregled

Primljeno: 21. travnja 2011; Prihvaćeno: 23. rujna 2011; Objavljeno: 12. listopad 2011 pregled

Copyright: © 2011 Kim et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan

financiranja. Ovo djelo je podržan od strane Basic Science Research programa kroz Nacionalni Research Foundation Koreje (NRF) financiran od strane Ministarstva znanosti, obrazovanja i tehnologije (2010-0015506) na Y-HC, od strane Nacionalnog Research Foundation Koreje (NRF) financirala Korejska vlada (MONT) (2010 - 0.029.353) na JLK, a Ro1 NS50665 na ENB. U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

rak želuca je jedan od najčešćih uzroka smrti izazvane rakom diljem svijeta. Nedavni napredak u genetici olakšali detekciju događajima tijekom želučanog karcinogeneze, uključujući aktivaciju onkogena, silencing tumorskih supresorskih gena, a mutacija gena koji sudjeluju u popravku DNA [1]. Među tim genetskih događaja, poznato je da je izraz tumor supresor promijelocitna leukemija (PML) protein je smanjena ili ukinuta kod raka želuca, i da je to povezano s većom limfni invazije, više pTNM skele i nepovoljnom prognozom, sugerirajući da PML gubitak povezan s progresijom karcinogeneze i karcinom želuca [2]. Ranije studije impliciran PML pregled disfunkcija u napredovanje različitih vrsta raka, a smanjena ili ukinuta ekspresije PML je prijavljen u prostate, dojke, središnjeg živčanog sustava, debelog crijeva, pluća i želuca raka [2], [3] . pregled

PML pregled gen izvorno identificirani putem fuzije s receptorom retinoične kiseline koji su uključeni u t (15; 17) kromosomske translokacije povezana s akutnim promijclocitnu leukemiju (APL) [4], [ ,,,0],5], [6], [7], [8]. PML je tumor supresorski protein koji regulira progresiju staničnog ciklusa, transkripciju gena, potiskivanje transformacije i apoptozu. PML pregled knockout miševa znatno osjetljivije na formiranje tumora nakon izloženosti karcinogenim nego su kontrole divljeg tipa, i PML pregled -deficient stanice su manje vjerojatno da će u apoptozu nakon primjene pojedinih vrsta stanični stres [9]. Osim izvješća s naglaskom na suzbijanje tumora ulozi koju PML, nekoliko je studija potvrdila da je protein djeluje kao transkripcijski regulator, preko
suradnji s co-aktivator CREB-vezujući protein; korepresorima uključujući HDAC, N-Cor i mSin3A; a transkripcijski faktori Nur77, AP-1, myc, p53, i STAT-1 a [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17]. pregled

Progressive mutacija i genetskih promjena u nekoliko gena za suzbijanje tumora promicati razvoj tumora i napredovanje [18]. Osim genetske promjene unutar stanica tumora, i upalne stanice i posrednici pridonose oblikovanju, posebno, tumorske mikrookoliša [19], [20]. Tumor-povezani fibroblasti (TAFs) i makrofage (TAMs) su također uključeni u modulaciju mikrookoliša tumora preko
proizvodnjom citokina, kemokina, interferoni, i druge biološki aktivne faktore [21], [22]. Unakrsna među stanicama tumora, TAFs, TAMs, i limfocita, je značajna u razvoju tumora i progresiji, te pridonosi uspostavi tumora mikrookoliša obogatili u ekspresiji raznih biološki aktivnih čimbenika [23], [24], [25] [26], [27]. pregled

TAMs se utvrdi da je u korelaciji s angiogeneze i nepovoljnom prognozom u nekoliko vrsta raka, uključujući rak želuca [22], [28]. Mast stanica proizvodi brojne angiogenih faktora i raznih citokina, a njegova gustoća je izvijestila da visoko korelira s opsegom tumora neoangiogenezom i lošom prognozom [29], [30]. CD4 ^{+ i CD8 + limfociti također se nalaze u različitim čvrstih tkiva raka. Do sada su precizne molekularni mehanizmi kojima se uređuju vrste i broj tumorskih stanica infiltriraju se u velikoj mjeri nepoznanica. Postoji nekoliko kontroverzna izvješća s obzirom na broj i funkciju tumorom infiltracije limfocita. Posebno, CD8 + T limfociti, a njihova funkcija je poznato kako bi se uklonili usponu transformirane stanice i pridonose imunosti [31], to je izvijestio da CD8 + uvlače u tumor T stanice su neispravne u faze učinka funkciji nakon kontakta tumorskim stanicama [32], te njihove infiltracija je povezana s lošom prognozom u određenih vrsta karcinoma, kao što su karcinoma ne-malih stanica pluća i karcinoma nazofarinksa [33], [34].}

kemokina luče stromalnim stanicama ili tumora stanice utjecaj migracije tumorskih stanica, invaziju, proliferaciju, angiogeneze i infiltracije stanica imunog na tumorske mase [35]. IFN-γ inducibilni protein-10 (IP-10, CXCL10) je jedan od CXC kemokina koji igra razne načine upalne bolesti i tumor [36], [37]. Budući da su IP-10 poželjno potiče Th1 imunosnog odgovora snažno privlače NK i T-stanice, predlaže se kao jedan od mogućih mehanizama T stanične infiltracije u tumorima. Pregled

Bilo Gubitak tumorskog supresor gena u stanicama tumora potiče regrutiranje limfocita i modulaciju funkcije tih stanica u tumora mikrookoliša trenutačno nejasni. U ovom istraživanju, ispitali smo PML funkciju s obzirom na angažiranje limfocita i moduliranje ekspresije faktora tumora porijekla. Ekspresija PML obrnuto je povezana sa stupnjem infiltracije CD8 ^{+ T-stanica u želučanog karcinoma. Gubitak PML je dalje povezana s povećanom ekspresijom IP-10, jedan od limfocite privlači CXC kemokina, u karcinom želuca stanica i tkiva. PML obaranje promovira IFN-γ-posredovane STAT-1 vezanje za IP-10 promotora, što rezultira povećanom transkripcijom IP-10 gena. Naši podaci podržavaju ideju da PML je uključen u zapošljavanju limfocita u tumore, preko
modulacijom razina ekspresije tumora potječe čimbenika, uključujući IP-10, pružajući još jedan dokaz da je gubitak gena za suzbijanje tumora u tumoru stanice aktivno sudjeluje u uspostavljanju tumora mikrookoliša. pregled}

Rezultati

gubitak PML protein je povezan s povećanim infiltracijom CD8 ^{+ T-stanica u naprednim tkiva karcinoma želuca pregled}

Imunohistokemijska bojanja za PML i CD8 izvršena je istražiti da li je opseg limfocita infiltracije bio povezan s PML status ekspresije u uznapredovalim rakom želuca. CD8-imunopozitivno stanice su označene kao što je opisano u materijalima i metodama. U ukupno 35 uzoraka (71,4%) pokazali su djelomični za potpuni gubitak PML u tumorskim staničnim jezgrama u fazi IV naprednih želučanog karcinoma. Uzorci iz 14 pacijenata napredne karcinom želuca su difuzno pozitivan na PML, a sadržavala je u prosjeku 32,7 CD8 ^{+ T-stanica po vidnom polju (slika 1A). identificirali smo 19 primjeraka napredne želučanog karcinoma izlaganja žarišnu pozitivnosti za PML, s prosjekom od 47,2 CD8 + T-stanica po vidnom polju. Osim toga, potpuni gubitak PML zabilježeno je u 16 bolesnika naprednim karcinom želuca; su uzorci sadržavali prosječan broj 52,8 CD8 + T-stanica po vidnom polju. Uzorci se prikazuju žarišnu pozitivnosti ili potpuni gubitak za PML je pokazao izraženiji porast CD8 + broj T-stanica nego što su primjerci koji pokazuje difuzno pozitivnosti za PML. Reprezentativne slike prikazane su na Slici 1B. Iako PML ekspresija proteina je smanjena ili ukinuta u stanicama tumora, svi normalne želučane sluznice žlijezde, stromalnih tkiva i limfne stanice, pokazuju difuzna srednja do jaka nuklearne immunopositivity za PML. Pregled}

PML utjecaja T-stanične infiltracije /migracija In vitro

s obzirom na gubitak PML ekspresije proteina i porasta infiltracije CD8 ^{+ T-limfociti u naprednim tkiva karcinoma želuca, mi je pretpostavio da PML pridonijela T-stanične infiltracije /migracije raka želuca. Istražiti da li je razina PML u želučanim stanicama raka utječe migracija T-stanica, kondicionirani medij iz SNU-638 stanicama koje su prijelazno transficirane s bilo PML pregled siRNA ili PML IV ekspresijski vektor, te obradi s IFN-γ je korišten u bunara migracijske analize. SNU-638 želučane stanice raka izražene visoke razine PML proteina, u skladu s prethodnim nalazima [2], dok SNU-638 stanice obilježene PML pregled siRNA prikazanu smanjene razine endogenog PML izražavanja (~46-56%) , što potvrđuje i imuno (slika 2a). IFN-γ izazvana skroman porast PML ekspresije proteina, u dogovoru s prethodnim rezultatima [38]. Migracija Jurkat T-stanica prema kondicioniranom mediju iz PML pregled siRNA transfektirane SNU-638 stanica bila je značajno poboljšana u usporedbi sa onom za kontrolu siRNA transficiranih stanica nakon obrade s IFN-y (slika 2B). Nakon transfekcije SNU-638 sa PML IV ekspresijski vektor, migraciju Jurkat T-stanica prema kondicioniranom mediju iz PML IV prekomjerno stanica je smanjena u usporedbi s onim praznim vektorom (Slika 2C). Ovi rezultati ukazuju da PML regulira razine sekretornih molekula proizvedenih i otpuštaju iz IFN-y-stimuliranih želučane stanice raka, te utječe migracija T limfocita. Pregled}

Gubitak PML poboljšava IFN-y-inducirana IP-10 ekspresija pregled

kemokina, obitelj kemotaksije citokina, promicati migraciju cirkulirajućih leukocita /limfocita na mjestima upale i ozljede. Kako bi istražili da li razina kemokina su pogođeni PML pregled genetsko stanje, izraz kemokina gena ispitana je pomoću testa zaštite ribonukleaze (RPA). PML pregled <sup>+ /+ i PML pregled - /- mišjeg embrija fibroblasta (MEF) stanice su inkubirane u odsutnosti ili prisutnosti IFN-y za 0-24 h ukupna mRNA je sakupljen u različitim vremenskim razmacima, i podvrgnuti rpp. U PML pregled - /- MEFs, IP-10 razina mRNA povećana 1,5 puta po 2 sata, a postao je izrazito povišen (8 puta) po 4 sata (Slika 3A). razine RANTES mRNA je povećana 3,2 puta, na 0,5 sata, a ostao je povišen, ali u manjoj mjeri (1,3 puta), 8 h nakon IFN-gama liječenja u PML
- /- MEFs , Ostali kemokina geni, uključujući i MIP-1, MIP-2 i MCP-1, nisu bili vidno izraženo u PML pregled + /+ ili PML pregled - /- MEFs (podaci nisu prikazani). STAT-1 ekspresija je povećano nakon izlaganja IFN-y u obje vrste stanica, ali ne i razlika je bila očita kada su uspoređene razine IFN-y između PML pregled + /+ i PML
- /- stanice. Kao transkripcija IP-10 gena znatno je povišen u IFN-gama-stimulirana PML pregled - /- MEFs, izmjerili smo relevantnih razina proteina u supernatantima kulture PML pregled + /+ i PML pregled - /- MEFs, koristeći imunoenzimnim test (ELISA). U skladu s rezultatima rpp, više razine IP-10 proteina su očito u održavanoj podlozi od tretiran IFN-γ- PML pregled - /- MEFs (slika 3B). Također, IP-10 mRNA u PML pregled siRNA Transfektirane NIH3T3 stanice je povećana u usporedbi s onom za kontrolu siRNA transficiranih stanica nakon IFN-y liječenja (Slika 3C). Smanjenje izražavanja PML proteina u PML pregled siRNA-transfektiranim NIH3T3 stanica potvrđena je imunoblot. Pregled</sup>

Smanjena PML izraz je obrnuto proporcionalna s IP-10 razina proteina u rak želuca tkiva i SNU- 638 stanice

Zatim, ispitali smo odnos između IP-10 i PML ekspresiju proteina u naprednom tkivu karcinoma želuca. Raka tkiva su imunohistokemijski obojene PML i IP-10, a intenzitet IP-10 immunopositivity je mjerena kao što je opisano u materijalima i metodama. Prosječna jakost IP-10 iznosio je 1,2 u 14 uzoraka pokazuju difuznu pozitivnosti (DP) za PML, 2.2 u 19 slučajeva žarišna pozitivnosti (FP), i 2.0 u 16 uzoraka u kojima je potpuni gubitak (CL) PML izražavanja ( Slika 4A, lijevi dio). Značajan porast u IP-10 izrazu zabilježen je u uzorcima pokazuje žarišnu pozitivnost na PML ( P pregled = 0,034), u usporedbi s onima koji pokazuje difuzno pozitivan PML izraz. Povećanje IP-10 izrazu zabilježen kada potpuni gubitak PML je bila očita, u usporedbi s onim što je navedeno kada PML je difuzno izražena; Međutim, ta razlika nije statistički značajna. Reprezentativni primjeri varijacija u statusu PML proteina koji u korelaciji s različitim IP-10 razina ekspresije u stanicama tumora iz naprednih želučanog karcinoma prikazani su (Slika 4A, desno). Kako bi se dodatno ispitati odnos između IP-10 i PML ekspresiju proteina u želučanom staničnim linijama karcinoma, IP-10 razina proteina je mjereno u supernatantima kulture od SNU-638 stanice transfektirane sa obje PML
siRNA ili PML IV exression vektor. Stanice su uzgajane u prisutnosti ili odsutnosti beta-IFN-y za 8 sati, supernatanti su prikupljeni, a IP-10 razine kvantificirana u njemu (dokazano ELISA testom). IFN-γ-inducirane IP-10 izlučivanje je značajno povećana u SNU-638- PML pregled siRNA transfektirane stanice, u usporedbi s onom SNU-638 stanice transfektirane s kontrolnom siRNA (slika 4b). Transfekcija SNU-638 sa PML IV ekspresijskim vektorom potiskuje IFN-γ-inducirane IP-10 izlučivanje (slika 4c). Rezultati jasno pokazuju da izlučivanje IP-10 od želučanih stanica raka se povećava kada PML izraz je smanjen. Pregled

IP-10 neutralizacija smanjuje migraciju T-stanica pregled

Kao SNU-638- PML pregled stanice siRNA koja sadrži umnažaju smanjene razine PML proteina je pokazala povećanje zapošljavanja T-stanica i IP-10 izlučivanja kao odgovor na IFN-y (slike 2 i 4), što sljedeći put ispituje je li povećanje IP- 10 razina olakšana migraciju T-stanica prema kondicioniranog medija iz SNU-638 stanica želuca raka stimuliranih IFN-y. SNU-638- PML pregled siRNA stanice su uzgojene u prisutnosti ili odsutnosti beta-IFN-y za 8 sati, a prikupljene supernatanti su prethodno tretirani s anti-IP-10 neutraliziranja antitijela ili kontrolu nespecifičnog IgG 1 sat prije početka testa transjažice. Neutraliziranje antitijela ili IgG sadrže supernatanti su stavljeni u niže komore, a analizirana migraciju Jurkat stanica od gornje prema niže komore ispitivanjem stanica dobivenih iz donje komore. Uključivanje IP-10-neutralizirajućih antitijela inhibira Jurkat T-stanične migracije prema kondicioniranog medija iz SNU-638- PML pregled siRNA stanica (Slika 5A). Ovi rezultati su u skladu s podacima dobivenim iz NIH3T3 stanica; IP-10-neutralizirajuće protutijelo inhibiralo je EL-4 migraciju T-stanica prema kondicioniranog medija iz NIH3T3- PML pregled siRNA stanice (Slika 5B). pregled

PML obaranje poboljšava IP-10 aktiviranje promotora

Kao što je IP-10 ekspresija je povećan u PML obaranje stanica, možemo dodatno istražiti je li izraz PML proteina utječe na IP-10 aktivnost promotora. Mišji IP-10 promotor sadrži urođeni GAS-kao elementa koji leži između NTS -246 i -238 (TTN _{5aa) (slika 6a). Mi smo ranije izvijestili da je PML negativno regulira transkripcijsku aktivnost STAT-1 [17]. Da bi se ustanovilo da li PML pogođeni IFN-γ-inducirane IP-10 ekspresiju gena preko pregled mehanizma koji uključuje STAT-1, mi izoliran i generira reporterski konstrukt koji počinje na poziciji -330 mišjeg IP-10 promotora koji sadrži potencijalni GAS se element, kao što je opisano u materijalima i metodama. IP-10- luc pregled reporter sadrži GAS dijela nalik tranzijentno transficirana u NIH3T3 stanicama koje su inkubirane sa ili bez IFN-y za 24 h, a nakon toga testirane na aktivnost luciferaze. IFN-γ-inducirane IP-10 promotor aktivnost je znatno povećana u NIH3T3 stanicama transfektiranim sa PML pregled siRNA, u usporedbi sa stanicama koje primaju kontrolnu siRNA (slika 6b). Nakon transfekcije NIH3T3 stanica sa PML IV ekspresijski vektor, IFN-γ-inducirane IP-10 aktiviranje promotora značajno potisnut. Silazni PML izražavanja pomoću PML pregled siRNA i prekomjernom ekspresijom PML koju PML IV vektoru ekspresije su verificirani imunoblot. Da bi se odredilo da li je došlo do inhibitorni učinak PML na IFN-γ-inducirane IP-10 promotora u stanicama raka želuca linije, proveli smo slične eksperimente s SNU-638 stanica raka želuca. Uzorke povećanja i smanjenja aktivnosti luciferaze u SNU-638 bio je sličan onom NIH3T3 stanice (Slika 6c). Razina ekspresije proteina u PML SNU-638 stanice obilježene bilo s PML pregled siRNA ili PML IV vektor ekspresije je potvrđena pomoću imunoblotinga (podaci nisu prikazani). Pregled}

PML obaranje povećava IFN-γ- inducirana STAT-1 vezanja DNA na IP-10 promotor pregled

učinka PML na IFN-gama-inducirana STAT-1 DNA vezanja na IP-10 promotor je dodatno ispitati. PML protein prekomjerna ekspresija u NIH3T3 stanicama, nakon prijelazne transfekcije s PML IV ekspresijski vektor, djelomično blokiran IFN-γ-inducirane STAT-1 DNA vezanja IP-10 promotor, uključujući sekvencu na -246 do -238 (Slika 7A, usporediti stupci 3 i 5). Natjecanje pomoću 100-molarne suvišni nespecificirani oligonukleotid koji kodira IP-10 promotor ukinuta stvaranje kompleksa (stupac 6). Razine PML i STAT-1 ekspresije proteina u cijelih stanica lizati (WCL) i opseg STAT-1 fosforilacije tirozina u ekstrakti jezgre (NE) potvrđene su imunoblot. Koristeći NE od NIH3T3- PML pregled siRNA stanice dobivene nakon 0,5 sata IFN-gama liječenja, jak vezivanja mišjeg IP-10 promotor uočeno (slika 7b, gornja ploča, stupac 5), u odnosu na vezivanje vidjeli u NIH3T3 kontrolu siRNA stanicama (stupac 3). Isti nes bili izloženi STAT-1 konsenzusa oligonukleotida i STAT-1 vezanja DNA je poboljšana u SI iz NIH3T3- PML pregled siRNA stanice (Slika 7B, srednji panel, usporediti traka 3 i 5). Koristeći SNU-638 želučane stanice raka, također otkrili da STAT-1 DNA vezanja PML pregled siRNA transfektirane SNU-638 stanice je povećana u usporedbi s onom za kontrolu siRNA transficiranih stanica nakon obrade s IFN-gama (Slika 7C, usporediti traka 3 i 5). Ovi podaci pokazuju da PML djelomično inhibira STAT-1 koji se veže na IP-10 promotor, i da je ovaj efekt je povezana s povećanom IFN-γ-inducirane IP-10 transkripcije u odsutnosti PML. Pregled

Rasprava

Histopatološki studije su pokazale, da je upalno mikrookoliš tumora karakterizira prisutnost mononuklearnih stanica infiltrata, i popratnim strome i tumorskim regijama. Međutim, točni mehanizmi po kojima Mononuklearne stanice se infiltriraju u i zadržanog u tkivu raka su trenutno u potpunosti razumljiv. U ovom istraživanju, nudimo dokaze da je gubitak ekspresije tumor supresorski protein, PML, doprinosi poboljšanju limfocita infiltracije u želučanom tkivu karcinoma, preko
regulaciju IP-10 izražavanja. Pregled

ispitali smo funkciju PML s obzirom na limfocita pomoću uzoraka humanog želučanog raka tkiva, PML pregled ^{+ /+ i PML pregled - /- MEFs i PML obaranje u oba NIH3T3 i SNU-638 stanicama. Podaci dobiveni iz oba testa ljudskih tkiva i migracija testovima transjažična pokazali da gubitak PML promiče trgovine limfocita; dakle, tražili smo mehanizme koji možda može objasniti ova zapažanja. Pokazujemo da povećanje IP-10 u serumu u stanicama raka koje eksprimiraju niske razine PML doprinosi limfocita. Osim toga, IP-10 za neutralizaciju antitijela inhibira migraciju T-stanica prema uvjetovanog medija iz NIH3T3 fibroblasti i SNU-638 želučanih stanica raka In vitro pregled, u skladu s rezultatima nekoliko prethodnih in vivo
studija , koja je pokazala da neutralizacija IP-10 potiskuje T staničnog jačanja [39], [40]. Koliko je nama poznato, ovo je prva studija pokazuje da je tumor supresor, PML, regulira IP-10 kemokina transkripcija i limfocita trgovina karcinoma želuca, tako modulirati aktivnost na IFN-γ /STAT-1 signalnog puta.}

IP-10, limfocit-ciljanje CXC kemokina izazvana tipa i i II IFN, igra važnu ulogu u limfocita pod nekoliko upalnih stanja [41]. IP-10 izlučuje imunološkim stanicama se uvlače u tumor, a također i tumorskih stanica u parenhimu interferona i citokinima obogaćen okoline. TAFs od pacijenata oboljelih od raka pluća konstitutivno proizvode i luče IP-10 [27]. Hepatociti zaraženi virusom hepatitisa C se dobije IP-10, te induciraju migraciju T-stanica u parenhimu jetre, što ukazuje da su IP-10 razine koreliraju s težinom histološke i upale [42]. U našem se sustavu IP-10 izlučivanje je opažena kod karcinoma želuca SNU-638 stanice, NIH3T3 fibroblasti i MEFs, u odgovor na IFN-y i lučenje poboljšana u odsutnosti PML proteina. Budući da smo našli da nema značajnije razlike u razini STAT-1 ekspresije i fosforilacija u odsutnosti ili prisutnosti PML nakon IFN-y (slike 3 i 7), povećava IFN-γ-inducirane IP-10 transkripcija u odsutnosti PML je uglavnom uzrokovano pojačanom STAT-1 DNA vezanja na IP-10 promotora. Predlažemo da PML-posredovana inhibicija STAT-1 DNA obvezujuće ponude za suzbijanje STAT-1 ovisni IP-10 izražavanja, u skladu s našim prethodnim nalazima [17]. U ovom istraživanju, identificirati potencijalni regulatorne regije za PML u IP-10 promotor, koja je putativni STAT-1 vezno mjesto. Nadalje, pokazali smo da PML obaranje povećava IFN-γ-inducirane STAT-1 DNA vezanje na IP-10 promotor, te poboljšava IP-10 razine u odsutnosti PML. Pregled

limfociti, neutrofili, makrofagi i mastociti su glavne komponente većini tumorskih infiltrata. Uvlače u tumor limfociti su identificirani u raznim čvrstim tkivima raka. Međutim, specifične funkcije takvih stanica unutar tumora, te precizne molekularni mehanizmi limfocita u tumore, ostaje sporno. Status i funkcionalni značaj CD8 ^{+ T-stanične infiltracije u tumorima, a udruga takvih stanica sa prognozom za pacijenta, također su nejasni. Karcinoma bubrega, infiltracija CD8 + T stanice povezan je s povoljnim prognozu [43]. S druge strane, kao što infiltracija je povezana s lošom prognozom kod karcinoma ne-malih pacijenata stanica pluća [33]. Mi ovdje pokazuju da PML ekspresija proteina u stanicama tumora je obrnuto proporcionalna s opsegu infiltracije CD8 + T stanica u tumorskim tkivima. Kada se smatra da je funkcija PML u limfni invazije zajedno s povezanosti PML izražavanja i nepovoljnom prognozom [2], očito je da je bilo koji odnos između kliničke slike i opsegu CD8 + T-stanične infiltracije u bolesnika s rakom želuca zahtijeva daljnje rasvjetljavanje. pregled}

nukleusa normalnih želučane sluznice žlijezde, stromalnih tkiva i limfoidnih stanica su difuzno imunopozitivno (umjerena do jaka) za PML ekspresiju proteina, dok su razine PML smanjena ili ukinuta u stanicama tumora (Slika 1). Ovi rezultati podupiru ideju da stanice raka imaju specifične mehanizme razgradnje za PML. Mi bi predložiti da posttranslacijska proteasomalni ovisna degradacija objašnjava gubitak PML proteina. Drugim riječima, degradacija na razini transkripcije nije operativan [2], [44]. PML ekspresija proteina je smanjena ili ukinuta u mnogo različitih vrsta raka, uključujući rak prostate, dojke, CNS, debelog crijeva, pluća i rak želuca [2], [3]. U skladu s tim rezultatima, gledali smo smanjiti ili zanemarivo izraz PML u naprednim želučanog tkiva raka. Osim toga, naši rezultati ukazuju na to da stanice raka koje izražavaju različite razine PML proteina razlikuju po svojoj sposobnosti da privuku i zadrže limfocita u tumorskim područjima, čime se osigurava daljnji dokaz da takve stanice aktivno sudjeluje u stvaranju upalnih tumora mikrookoliša, putem
PML posredovanih mehanizama. pregled

NF-kB i STAT-3 signalni mogu poslužiti kao glavne regulacijske sustave povezuju upala raka [45]. IL-6, An NF-kB ovisi upalnih faktora rasta, je bitan za razvoj upale povezane karcinogeneze [46]. Nedavni dokazi dodatno je ojačao ideju da se IL-6 /gp130 /STAT-3 signalizacije os služi i kao autokrina i parakrinu pojačanje petlja u adenokarcinoma pluća, multipli mijelom, Ras-transformirane stanice raka, a model raka kolitis povezan s [47], [48], [49], [50]. PML je pokazalo da suprimira IL-6 inducirano STAT-3 aktivnosti [51], da potiče apostozu preko
postupak TNF posredovani, senzibilizirati stanicu u apoptozu inhibirajući preživljavanja NF-kB posredovane put [52]. Međutim, to još treba utvrditi je li gubitak Tumor supresor PML doprinosi promjenama u imuni odgovor domaćina ili mikro tumora, možda je rezultiralo u bilo imunosti ili imuni bijega, modulacijom transkripcijskih faktora. Dakle, bilo bi zanimljivo usporediti učinke gubitka PML ekspresije proteina na NF-kB /STAT-3 i STAT-1 signalizacije, a kako bi se utvrdilo jesu li ovi faktori transkripcije funkcija na koordinirani način da regulira ekspresiju podskup kemokina koji doprinose uspostavljanju upalnih tumorskih mikrookoliša. pregled

Materijali i metode pregled

Stanice pregled

Primarni i ovjekovječio PML pregled ^{+ /+ i PML pregled - /- MEFs su uspostavljeni i održavani kao što je prethodno opisano [53]. Ljudski carconoma stanična linija želučanom SNU-638, Jurkat humani T-stanica stanične linije limfoblastna nalik i EL-4 mišji T-limfoma stanične linije održavane su kao što je prethodno opisano [2], [54]. Pregled}

želučani karcinom tkiva pregled

ukupno 49 želučanog karcinoma parafinske blokove su dobivene od 49 pacijenata (29 mužjaka, 20 žena, srednja dob 64 godina; raspon 35-84) koji su prošli kroz ukupni ili SUBTOTAL gastrektomije za stadiju IV napredne želučani karcinom u Mokdong bolnice, Ewha ženska Medicinskog fakulteta Sveučilišta, Seoul, Koreja od 2001. do 2007. godine pregled

Reagensi i antitijela pregled

Rekombinantni mišji i ljudski IFN-γ (mIFN-γ i hIFN γ) i MIP-10 i hip-10 kupljeni su od prospektivno (Rehovot, Izrael). Protutijela na PML (mišjim monoklonskim) i STAT-1 su kupljena od Upstate Biotechnology, Inc. (Lake Placid, NY, USA) i neutraliziraju antitijela na IP-10 je kupljen od tvrtke R &D Systems (Minneapolis, MN, USA). Antitijela na p-Y701-STAT-1 od tvrtke Cell Signaling Technology (Beverly, MA). Protutijela na histona, lamin B i PML (zečjeg protutijela) kupljeni su od Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), i anti-tubulin antitijelo je kupljen od Sigma-Aldrich, Co. (St. Louis, MO, USA) . pregled

Imunohistokem, broj stanica i mjerenje koje su imunološki područjima

ljudska tkiva raka želuca su obrađeni za imunohistokemijske analize kao što je prethodno opisano [2] uz manje izmjene. Korišteni su primarnih protutijela za PML (1:200; Santa Cruz Biotechnology), CD8 (1:50; Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, USA), i IP-10 (D Systems 1:50; R &). Svi stakalca su obojena Mayerovim hematoksilinom. Pozitivne kontrole su dobiveni korištenjem Palatina krajnika za PML proteina i CD8 i nazofarinksa nediferenciranih karcinomi za IP-10. Negativne kontrole su dobiveni izostavljanjem osnovnih antitijela iz svih slajdova. Immunopositivity za PML protein kategoriziran difuzno pozitivnost (nuklearne imunoreaktivnosti u ≥50% tumorskih stanica), žarišna pozitivnost (u ≥10%, a < 50%), odnosno potpuni gubitak (u < 10% tumorskih stanica). Brojevi CD8 imunopozitivne stanica u jednom visokom području napajanja (HPF, X40) od 0,25 mm ^{2 za pet slučajno odabranih tumorskih inflitrativni granice su računati za svaki uzorak, nakon čega slijedi izračun srednje broju i SD. Immunopositivity za IP-10 je definirana kao bilo nuklearnog ili citoplazmatski pozitivne ekspresije u stanicama tumora. Za određivanje razine eksprimiranog svakog stakalca, digitalne slike su dobivene pomoću mikroskopa montirana digitalnu kameru. Korištenje ImageJ softvera (http://rsb.info.nih.gov/ij~~HEAD=dobj), svaka slika se pretvara u 8-bitnim sivim razmjera i područja gustoća izmjerene su od piksela u području od interesa; Samo piksela iznad određene razine (> 50 vrijednosti intenzitet), uključene su da se eliminira pozadina pogreške pregled}

siRNA transfekcija pregled

NIH3T3 stanice prolazno su transfecirane upotrebom Mirus transfekcijskog reagensa (Mirus Bio LLC, Madison,

• PLoS ONE: silazni RPL6 po siRNA inhibira proliferaciju i progresiju staničnog ciklusa ljudskog želuca Cancer Cell Lines
• PLoS ONE: Mir-29a Koči staničnu proliferaciju i inducira staničnog ciklusa kroz silazni p42.3 u ljudske želučane Cancer