PLOS ONE: Förlust av promyelocytisk leukemi Protein i Gastric Cancer: Inblandning för IP-10 Expression och tumörinfiltrerande Lymphocytes

Abstrakt

Gastric cancer är en av de vanligaste orsakerna till cancerrelaterad dödlighet i hela världen. Expression av tumörsuppressor, promyelocytisk leukemi (PML) protein, sänks eller avskaffas i gastriska karcinom, i samband med en ökad nivå av lymfatisk invasion, utveckling av högre pTNM iscensättning och ogynnsam prognos. Häri undersökte vi förhållandet mellan omfattningen av tumörinfiltrerande lymfocyter och status för PML proteinuttryck i avancerad magsäckscancer. Vi observerade högre antal infiltrerande T-celler i magcancer vävnader i vilka PML uttryck reduceras eller avskaffas, jämfört med vävnader positivt för PML. Omfattningen av T-cellmigrering mot odlingssupernatanter erhållna från interferon-gamma (IFN-γ-stimulerade magkarcinom cellinjer påverkas ytterligare av uttryck av PML in vitro
. Interferon-gamma-inducerbar protein 10 (IP -10 /CXCL10) uttryck ökade i gastriska karcinomvävnader uppvisar reducerade PML nivåer. Dessutom har både Pml
knockout och knockdown celler uppvisade förbättrad IP-10-mRNA och proteinuttryck i närvaro av IFN-γ. PML knockdown ökad IFN-γ-medierad signalomvandlare och aktivator av transkription-1 (STAT-1) bindning till IP-10-promotorn, vilket resulterar i förhöjd transkription av IP-10-genen. Omvänt, PML IV proteinuttryck tryckt IP-10 promotoraktivering . Baserat på dessa resultat, föreslår vi att förlusten av PML proteinuttryck i gastric cancerceller bidrar till ökad IP-10 transkription via
förbättring av STAT-1-aktivitet, vilket i sin tur främjar lymfocyter människohandel inom tumörregioner .

Citation: Kim HJ, Song DE, Lim SY, Lee SH, Kang JL, Lee SJ, et al. (2011) Förlust av promyelocytisk leukemi Protein i Gastric Cancer: Inblandning för IP-10 Expression och tumörinfiltrerande lymfocyter. PLoS ONE 6 (10): e26264. doi: 10.1371 /journal.pone.0026264

Redaktör: Yoshio Yamaoka, Veterans Affairs Medical Center (111D), Amerikas förenta stater

Mottagna: 21 april, 2011. Accepteras: 23 september 2011. Publicerad: 12 oktober 2011

Copyright: © 2011 Kim et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

Finansiering:. Detta arbete stöddes av Basic Science Research Program genom National Research Foundation of Korea (NRF) som finansieras av ministeriet för utbildning, vetenskap och teknik (från 2010 till 0.015.506) till Y-HC, av National Research Foundation of Korea (NRF) finansierade av Korea regeringen (MEST) (2010 till 0.029.353) till JLK, och RO1 NS50665 till ENB. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

Gastric cancer är en av de vanligaste orsakerna till cancerrelaterade dödsfall i världen. De senaste framstegen inom genetiken har underlättat detektering av händelser som inträffar under loppet av gastric cancer, inklusive aktivering av onkogener, tysta av tumörsuppressorgener, och mutation av gener involverade i DNA-reparation [1]. Bland dessa genetiska händelser, är det känt att tumörsuppressor promyelocytisk leukemi (PML) proteinuttryck sänks eller avskaffas i magcancer, och att detta är förenat med mer omfattande lymfatiska invasion, högre pTNM iscensättning och ogynnsam prognos, vilket tyder på att PML förlust är kopplad till cancer och magcancer progression [2]. Tidigare studier inblandade Pml
dysfunktion i utvecklingen av en rad olika cancerformer, och sänks eller avskaffas uttryck av PML har rapporterats i prostata, bröst, CNS, kolon, lunga och mag cancer [2], [3] .

Pml
genen identifierades ursprungligen genom fusion med retinsyrareceptor inblandad i t (15; 17) kromosomtranslokation i samband med akut promyelocytisk leukemi (APL) [4], [ ,,,0],5], [6], [7], [8]. PML är en tumörsuppressor protein som reglerar cellcykelns framskridande, gentranskription, transformation förtryck, och apoptos. Pml
knockout möss är betydligt mer känsliga för tumörbildning efter exponering för carcinogener än är av vild typ kontroller, och Pml
med brist celler är mindre benägna att undergå apoptos efter applicering av särskilda typer av cellulär stress [9]. Förutom rapporter med inriktning på tumörhämmande roll PML, har flera studier bekräftat att proteinet fungerar som en transkriptionsregulator, via
samband med co-aktivator CREB-bindande protein; co-repressorer inklusive HDAC, N-CoR och mSin3A; och transkriptionsfaktorer Nur77, AP-1, myc, p53, och STAT-1α [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17].

Progressiv mutation och genetiska förändringar i flera tumörsuppressorgener främja tumörutveckling och progression [18]. Förutom genetiska förändringar inom tumörceller, både inflammatoriska celler och mediatorer bidra till bildandet av särskilda tumörmikromiljöer [19], [20]. Tumörassocierade fibroblaster (TAFs) och makrofager (TAMs) är också involverade i moduleringen av tumören mikro via
produktion av cytokiner, kemokiner, interferoner, och andra biologiskt aktiva faktorer [21], [22]. Överhörning mellan tumörceller, TAFs, TAM, och lymfocyter, är betydande i tumörutveckling och progression, och bidrar till etableringen av tumörmikromiljöer anrikade i uttryck av ett flertal biologiskt aktiva faktorer [23], [24], [25] [26], [27].

TAMs påträffas korrelera med angiogenes och en ogynnsam prognos i flera typer av cancer, inklusive magcancer [22], [28]. Mastceller producerar många angiogena faktorer och en mängd olika cytokiner, och dess densitet har rapporterats mycket korrelerar med omfattningen av tumör neoangiogenesen och dålig prognos [29], [30]. CD4 ^{+ och CD8 + lymfocyter finns också i en mängd olika solida cancervävnader. Fram till nu, de exakta molekylära mekanismer genom vilka typen och antalet tumörinfiltrerande celler regleras till stor del är okända. Det finns flera kontroversiella rapporter när det gäller antal och funktion av tumörinfiltrerande lymfocyter. Speciellt CD8 + T-lymfocyter, medan deras funktion är känd för att eliminera begynnande transformerade celler och bidra till immunosurveillance [31], är det rapporterats att CD8 + tumörinfiltrerande T-celler är defekta i effektor fas funktion vid kontakt med tumörceller [32], och deras infiltration är kopplad till ogynnsam prognos i vissa typer av cancer, såsom icke-småcellig lungcancer och nasofarynxcancer [33], [34].}

Kemokiner utsöndras av stromaceller eller tumör celler påverkar tumörcellmigrering, invasion, proliferation, angiogenes och immuncellinfiltration i tumörmassan [35]. IFN-γ-inducerbart protein-10 (IP-10, CXCL10) är en av de CXC-kemokiner som spelar flera roller vid inflammatoriska sjukdomar och cancer [36], [37]. Eftersom IP-10 främjar preferentiellt Th1 immunsvar genom att kraftigt dra till NK- och T-celler, föreslås som en av möjliga mekanismer för T-cellinfiltration till tumörer.

Huruvida förlust av tumörsuppressorgener i tumörceller inducerar rekryteringen av lymfocyter och modulering av funktionerna hos sådana celler i tumörmikromiljöer är för närvarande oklart. I föreliggande studie undersökte vi PML funktion med avseende på rekryteringen av lymfocyter och modulering av expressionen av tumörhärledda faktorer. Uttryck av PML var omvänt korrelerad med graden av infiltration av CD8 ^{+ T-celler i mag karcinom. PML förlust ytterligare i samband med ökad expression av IP-10, en av de lymfocyt-locka CXC-kemokiner, i magcancer celler och vävnader. PML knockdown främjas IFN-γ-medierad STAT-1-bindning till IP-10-promotom, vilket resulterar i ökad transkription av IP-10-genen. Våra data stöder uppfattningen att PML är involverad i rekrytering av lymfocyter till tumörer, via
modulering av de expressionsnivåer av tumörhärrörande faktorer inkluderande IP-10, som ger ytterligare bevis på att förlusten av tumörsuppressorgener i tumör celler deltar aktivt i fastställandet av tumörmikromiljöer.}

Resultat

Förlust av PML protein associerad med ökad infiltration av CD8 ^{+ T-celler i avancerad magsäckscancer vävnad}

Immunhistokemisk färgning för PML och CD8 utfördes för att undersöka om omfattningen av lymfocyter infiltration var associerad med PML uttryck status i avancerad magsäckscancer. CD8-immunpositiva celler räknades såsom beskrivits i material och metoder. Sammanlagt 35 prover (71,4%) visade partiell till total förlust av PML i tumörcellkärnorna i steg IV avancerad magsäckscancer. Prover från 14 avancerade magkarcinom patienter diffust positiv för PML, och innehöll i genomsnitt 32,7 CD8 ^{+ T-celler per fält (Figur 1A). Vi identifierade 19 fall av avancerad magsäckscancer uppvisar fokal positivitet för PML, med ett genomsnitt på 47,2 CD8 + T-celler per fält. Dessutom var fullständig förlust av PML observerades i 16 avancerade magkarcinom patienter; proverna innehöll ett genomsnittligt antal 52,8 CD8 + T-celler per fält. Prover visar fokal positivitet eller fullständig förlust för PML visade en mer markant ökning i CD8 + T-cellantal än gjorde exemplar uppvisar diffus positivitet för PML. Bilderna visas i figur 1B. Även PML-proteinuttryck minskades eller avskaffades i tumörceller, alla normala magslemhinnan körtlar, stromala vävnader och lymfoidceller, uppvisade diffus måttlig till stark kärn immunopositivity för PML.}

PML influenser T-cellinfiltration /migration in vitro

med tanke på förlusten av PML proteinuttryck och den ökade infiltrationen av CD8 ^{+ T-lymfocyter till avancerad magsäcks karcinomvävnader, vi hypotesen att PML bidrog T-cell infiltration /migration i magcancer. För att undersöka om PML nivå gastric cancerceller påverkas T-cellmigration, konditionerat medium från SNU-638-celler transient transfekterade med antingen Pml
siRNA eller PML IV expressionsvektor, behandlades sedan med IFN-γ användes i Transwell migrationsanalyser. SNU-638 gastric cancerceller uttryckte höga nivåer av PML-protein, i överensstämmelse med tidigare fynd [2], medan SNU-638-celler transfekterade med Pml
siRNA som visas reducerade nivåer av endogent PML uttryck (~46-56%) , vilket bekräftas av immunoblotting (figur 2A). IFN-γ inducerade en modest ökning av PML proteinuttryck, i överensstämmelse med tidigare resultat [38]. Migration av Jurkat T-celler mot konditionerat medium från PML
siRNA-transfekterade SNU-638 celler var signifikant förbättrad jämfört med den för kontroll siRNA-transfekterade celler, efter behandling med IFN-γ (Figur 2B). Vid transfektion av SNU-638 med PML IV expressionsvektor, migration av Jurkat T-celler mot konditionerat medium från PML IV överuttryckta celler minskades jämfört med den för tom vektor (figur 2C). Dessa resultat tyder på att PML reglerar nivåerna av sekretoriska molekyler som produceras av och frigörs från IFN-γ-stimulerade gastriska cancerceller, och påverkar även migration av T-lymfocyter.}

Förlust av PML förhöjer IFN-γ-inducerad IP-10-uttryck

Chemokiner, en familj av kemotaktiska cytokiner, främja migrering av cirkulerande leukocyter /lymfocyter till inflammationsställen och skada. För att undersöka huruvida kemokin nivåerna påverkades av Pml
genetiska status, var kemokin genuttryck undersöktes med hjälp av ribonukleas-skyddsanalys (RPA). Pml
<sup>+ /+ och Pml
- /- mus embryonala fibroblaster (MEF) celler odlades i närvaro eller frånvaro av IFN-γ för 0-24 timmar framställdes totalt mRNA uppsamlades vid olika tidpunkter, och utsattes för RPA. I Pml
- /- MEF, IP-10-mRNA-nivåer ökade 1,5-faldigt på två timmar, och blev markant förhöjda (8-faldig) med 4 h (figur 3a). RANTES mRNA-nivåer ökades 3,2-faldigt vid 0,5 h, och förblev förhöjda, men till en lägre grad (1,3-faldig), 8 timmar efter IFN-γ behandling i PML
- /- MEF . Andra kemokinreceptorer gener, inklusive MIP-1, MIP-2 och MCP-1, var inte detekterbart uttryck i Pml
+ /+ eller Pml
- /- MEF (data visas ej). STAT-1 uttryck ökade efter exponering för IFN-γ i båda celltyperna, men ingen skillnad var uppenbar när IFN-y-nivåer jämfördes mellan Pml
+ /+ och Pml
- /- celler. Som transkription av IP-10-genen kraftigt förhöjd i IFN-γ-stimulerade Pml
- /- MEF, mätte vi relevanta proteinnivåer i odlingssupernatanter av Pml
+ /+ och Pml
- /- MEF, med användning av en enzymkopplad immunabsorberande analys (ELISA). I överensstämmelse med de RPA resultaten, var uppenbara i konditionerat medium högre nivåer av IP-10-protein från IFN-γ-behandlade Pml
- /- MEF (figur 3B). Också, IP-10-mRNA-uttryck i PML
siRNA-transfekterade NIH3T3-celler förhöjdes, jämfört med den för kontroll siRNA-transfekterade celler, efter IFN-γ-behandling (figur 3C). Minskningen i uttryck av PML-protein i PML
siRNA-transfekterade NIH3T3-celler bekräftades genom immunoblotting.</sup>

Minskad PML uttryck omvänt korrelerad med IP-10-proteinnivåer i gastric cancervävnad och SNU- 638 celler

Nästa vi granskat förhållandet mellan IP-10 och PML proteinuttryck i avancerad magsäckscancer vävnad. Cancer vävnader immunhistokemiskt färgas för PML och IP-10, och intensiteten av IP-10 immunopositivity mättes såsom beskrivits i material och metoder. Den genomsnittliga intensiteten av IP-10 var 1,2 i 14 prover som inte uppvisar diffus positivitet (DP) för PML, 2,2 i 19 fall av bränn positivitet (FP), och 2,0 i 16 prover där det var fullständig förlust (CL) av PML uttryck ( Figur 4A, vänstra panelen). Betydande ökningar i IP-10-uttryck observerades i prover som visar fokal positivitet av PML ( P
= 0,034), jämfört med dem som visar diffusa positiv PML uttryck. En ökning av IP-10-uttryck observerades när total förlust av PML var uppenbar, jämfört med vad som noterades när PML var diffust uttryckt; Men denna skillnad inte statistisk signifikans. Representativa exempel på variationer i PML protein status som korrelerade med olika IP-10 expressionsnivåer i tumörceller från avancerad magsäckscancer visas (Figur 4A, höger). För att ytterligare undersöka förhållandet mellan IP-10 och PML proteinuttryck i magcancer-cellinjer, IP-10 proteinnivåer mättes i odlingssupernatanter från SNU-638-celler transient transfekterade med antingen Pml
siRNA eller PML IV exression vektor. Celler odlades i frånvaro eller närvaro av IFN-γ under 8 h, supernatanterna uppsamlades, och IP-10 nivåer kvantifierades däri (med ELISA). IFN-γ-inducerad IP-10-utsöndring var signifikant förhöjt i SNU-638- PML
siRNA-transfekterade celler, jämfört med den för SNU-638-celler transfekterade med kontroll siRNA (Figur 4B). Transfektion av SNU-638 med PML IV expressionsvektryckte IFN-γ-inducerad IP-10 sekretion (Fig 4C). Resultaten visar tydligt att sekretion av IP-10 från gastriska cancerceller ökar när PML expression reduceras.

IP-10 neutralisation minskar migration av T-celler

Som SNU-638- PML
siRNA-innehållande celler som uttrycker reducerade nivåer av PML-protein uppvisade förstärkning av T-cellrekrytering och IP-10 sekretion i respons till IFN-γ (fig 2 och 4), undersökte vi därefter huruvida en ökning av IP- 10 nivåer underlättas T-cellmigrering mot konditionerat medium från SNU-638 gastric cancerceller stimulerade av IFN-γ. SNU-638- Pml
siRNA-celler odlades i frånvaro eller närvaro av IFN-γ i 8 h, och de uppsamlade supernatanterna förbehandlades med en anti-IP-10 neutraliserande antikropp eller kontroll-icke-specifikt IgG för 1 h före början av den transwell assay. Neutraliserande antikropp eller IgG-innehållande supernatanter placerades i de nedre kamrarna, och migrering av Jurkat-celler från övre till nedre kamrarna analyserades genom att undersöka celler skördade från de nedre kamrarna. Inkludering av IP-10-neutraliserande antikroppar inhiberade Jurkat T-cellmigrering mot konditionerat medium från SNU-638- Pml
siRNA-celler (figur 5A). Dessa resultat överensstämmer med data som erhållits från NIH3T3-celler; en IP-10-neutraliserande antikropp inhiberade EL-4 T-cellmigrering mot konditionerat medium från NIH3T3- Pml
siRNA-celler (Figur 5B).

PML knockdown förbättrar IP-10-promotoraktivering

Som IP-10-uttryck ökades i PML knockdown celler, vi utforskas ytterligare om PML proteinuttryck påverkade IP-10 promotoraktivitet. Den murina IP-10-promotorn innehåller en förmodad GAS liknande element som ligger mellan NTS -246 och -238 (TTN _{5AA) (Figur 6A). Vi rapporterade tidigare att PML reglerar transkriptionsaktiviteten för STAT-1 [17] negativt. För att fastställa huruvida PML påverkade IFN-γ-inducerad IP-10 genuttryck via
en mekanism som involverar STAT-1, vi isolerat och genererade en reporterkonstruktion som börjar vid position -330 i murina IP-10-promotorn innehållande förmodade GAS-liknande element, såsom beskrivs i Material och Metoder. IP-10- luc
reporter innehållande GAS-liknande elementet transfekterades transient in i NIH3T3-celler inkuberade med eller utan IFN-γ i 24 h, och därefter analyserades med avseende på luciferasaktivitet. IFN-γ-inducerad IP-10 promotoraktivitet var betydligt bättre i NIH3T3-celler transfekterade med Pml
siRNA, jämfört med celler som fick kontroll siRNA (Figur 6B). Vid transfektion av NIH3T3-celler med PML IV expressionsvek, var IFN-γ-inducerad IP-10 promotoraktivering avsevärt undertryckt. Nedreglering av PML uttryck med hjälp av Pml
siRNA och överuttryck av PML av PML IV expressionsvek verifierades genom immunoblotting. För att avgöra om den hämmande effekten av PML på IFN-γ-inducerad IP-10 promotoraktivitet är inträffat i magcancer cellinjer utförde vi liknande experiment med SNU-638 gastric cancerceller. Mönstren av ökning och minskning i luciferasaktivitet i SNU-638 liknade den i NIH3T3-celler (Figur 6C). Nivån av PML proteinuttryck i SNU-638-celler transfekterade med antingen Pml
siRNA eller PML IV expressionsvektor verifierades genom immunblotting (data ej visade).}

PML knockdown ökar IFN-γ- inducerad STAT-1 DNA-bindning till IP-10-promotorn

effekten av PML på IFN-γ-inducerad STAT-1 DNA-bindning till IP-10-promotorn undersöktes ytterligare. PML proteinuttryck i NIH3T3-celler, efter övergående transfektion med PML IV expressionsvektom delvis blockerad IFN-γ-inducerad STAT-1 DNA-bindning till IP-10-promotorn, däribland sekvensen vid -246 till -238 (figur 7A, jämför spår 3 och 5). Konkurrens med hjälp av en 100-molar överskott av omärkt oligonukleotid som kodar för IP-10-promotorn upphävde komplexbildning (spår 6). Nivåerna av PML och STAT-1 proteinuttryck i hel-cellysat (WCL) och omfattningen av STAT-1 tyrosinfosforylering i nukleära extrakt (NE) verifierades genom immunoblotting. Utnyttjande NE från NIH3T3- Pml
siRNA celler erhölls efter 0,5 h av IFN-γ behandling, stark bindning till den murina IP-10-promotorn observerades (figur 7B, övre panelen, bana 5), ​​jämfört med bindning sett i NIH3T3-kontroll siRNA celler (spår 3). Samma NE utsattes för STAT-1 konsensus oligonukleotid, och STAT-1 DNA-bindande förstärktes i NE från NIH3T3- Pml
siRNA celler (figur 7B, mellersta panel, jämför spår 3 och 5). Med användning av SNU-638 gastric cancerceller, fann vi även att STAT-1-DNA-bindning av PML
siRNA-transfekterade SNU-638 celler förhöjdes jämfört med den för kontroll siRNA-transfekterade celler, efter behandling med IFN-γ (Figur 7C, jämför spår 3 och 5). Dessa data indikerar att PML inhiberar partiellt STAT-1-bindning till IP-10-promotorn, och att denna effekt är korrelerad med ökad IFN-γ-inducerad IP-10 transkription i frånvaro av PML.

Diskussion

Histopatologiska studier har visat att den inflammatoriska mikromiljön av tumörer kännetecknas av närvaron av mononukleära cellinfiltrat, såväl i de stödjande stroma och tumörregioner. Men de exakta mekanismerna genom vilka mononukleära celler infiltrerar in och ihållande inom cancervävnader är för närvarande inte helt klarlagda. I den aktuella studien, erbjuder vi bevis på att förlust av uttryck av tumörsuppressorproteinet, PML, bidrar till att förbättra lymfocyter infiltration i magcancer vävnad, via
reglering av IP-10-uttryck.

Vi undersökte funktion PML med avseende på lymfocyter rekrytering med hjälp av magcancer vävnadsprover mänskliga, Pml
<sup>+ /+ och Pml
- /- MEF, och PML knockdown i både NIH3T3- och SNU-638 celler. Data som erhållits från både mänskliga test vävnad och Transwell migrationsanalyser visade att förlusten av PML främjar lymfocyter handel, därför sökte vi mekanismer som möjligen kan förklara dessa observationer. Vi visar att en ökning av IP-10 nivåer i cancerceller som uttrycker låga nivåer av PML bidrar till lymfocyter rekrytering. Dessutom hämmade IP-10 neutraliserande antikropp T-cellmigrering mot konditionerat medium från NIH3T3 fibroblaster och SNU-638 gastric cancerceller In vitro
, i överensstämmelse med resultaten av flera tidigare In vivo
studier , vilket visade att neutraliseringen av IP-10 undertryckte T-cellrekrytering [39], [40]. Så vitt vi vet är detta den första studien som visar att tumörhämmande, PML, reglerar IP-10 kemokin transkription och lymfocyter handel med magcancer, genom att modulera aktiviteten hos IFN-γ /STAT-1 signalväg.</sup>

IP-10, en lymfocyt inriktning CXC-kemokin induceras av typ i och II IFN spelar en viktig roll i lymfocyter rekrytering under flera inflammatoriska tillstånd [41]. IP-10 utsöndras av tumörinfiltrerande immunceller, och även av tumorala och parenkymceller i en interferon och cytokin-berikat mikromiljö. TAFs från cancerpatienter lung konstitutivt producera och utsöndra IP-10 [27]. Hepatocyter infekterade med hepatit C-virus producerar IP-10, och inducerar migration av aktiverade T-celler till levern parenkymet, vilket indikerar att IP-10 nivåer är korrelerade med histologisk svårighetsgrad och inflammation [42]. I vårt system, var IP-10 sekre observerats i magcancer SNU-638-celler, NIH3T3 fibroblaster, och MEF, som svar på IFN-γ, och utsöndring ökades i frånvaro av PML-proteinuttryck. Eftersom vi funnit att det inte fanns några väsentliga skillnader i nivån av STAT-1-expression och fosforylering i frånvaro eller närvaro av PML på IFN-γ (figurerna 3 och 7), ökade IFN-γ-inducerad IP-10 transkription i frånvaro av PML orsakades främst av förbättrad STAT-1 DNA-bindning till IP-10-promotorn. Vi föreslår att PML-medierad hämning av STAT-1 DNA-bindande leder till undertryckande av STAT-1-beroende IP-10 expression, i överensstämmelse med våra tidigare fynd [17]. I föreliggande studie, vi identifierar en potentiell regulatorisk region för PML i IP-10-promotorn, som är en förmodad STAT-1-bindningsställe. Vidare visar vi att PML knockdown ökar IFN-γ-inducerad STAT-1-DNA-bindning till IP-10-promotorn, och förbättrar IP-10 nivåer i frånvaro av PML.

Lymfocyter, neutrofiler, makrofager, och mastceller är de viktigaste komponenterna i de flesta tumör infiltrat. Tumörinfiltrerande lymfocyter har identifierats i ett antal olika solida cancervävnader. De specifika funktioner av sådana celler i tumörer, och de exakta molekylära mekanismer av lymfocyter rekrytering till tumörer, förblir kontroversiell. Status och funktionella betydelsen av CD8 ^{+ T-cellinfiltration i tumörer, och föreningen av sådana celler med patient prognos, är också oklart. I njurcellscancer, är infiltration av CD8 + T-celler i samband med god prognos [43]. Omvänt är sådan infiltration kopplad till ogynnsam prognos i nonsmall patienter cell lungcancer [33]. Vi här visar att PML proteinuttryck i tumörceller är omvänt korrelerad med graden av infiltration av CD8 + T-celler i tumörvävnad. När funktionen för PML i lymfatisk invasion anses tillsammans med sambandet mellan PML uttryck och ogynnsam prognos [2], är det uppenbart att något samband mellan kliniska funktioner och omfattningen av CD8 + T-cellinfiltration i mag cancerpatienter kräver ytterligare belysning.}

Kärnor normala magslemhinnan körtlar, stromala vävnader och lymfoidceller var diffust immunpositiva (måttlig till stark) för PML proteinuttryck, medan PML nivåerna sänks eller avskaffas i tumörceller (Figur 1). Dessa upptäckter stöder idén att cancerceller har specifika skademekanismer för PML. Vi föreslår att posttranslationell proteasom-beroende nedbrytning förklarar förlusten av PML-protein. Med andra ord, är nedbrytning på transkriptionsnivå inte operativ [2], [44]. PML-proteinuttryck sänks eller avskaffas i många olika cancerformer, inklusive prostata, bröst, CNS, kolon, lunga och magcancer [2], [3]. I överensstämmelse med dessa resultat, observerade vi reducerad eller försumbar uttryck av PML i avancerad magsäckscancer vävnader. Dessutom är våra resultat tyder på att cancerceller som uttrycker olika nivåer av PML-protein varierar i deras förmåga att attrahera och behålla lymfocyter i tumörområden, vilket ger ytterligare belägg för att sådana celler deltar aktivt i fastställandet av inflammatoriska tumörmikromiljöer, via
PML-medierade mekanismer.

NF-kB och STAT-3-signalering föreslås att fungera som stora regelsystem som förbinder inflammation cancer [45]. IL-6, en NF-KB-beroende inflammatorisk tillväxtfaktor, är en förutsättning för utveckling av inflammationsassocierad karcinogenes [46]. Senaste indicier har ytterligare stärkt idén att IL-6 /gp130 /STAT-3 signal axel fungerar som både en autokrin och parakrin förstärkningsslinga i lungadenokarcinom, multipelt myelom, Ras-transformerade cancerceller, och en kolit-associerad cancer modell [47], [48], [49], [50]. PML har visat sig undertrycka IL-6-inducerad STAT-3-aktivitet [51], för att främja apoptos via
en TNF-medierad process, och att sensibilisera celler för apoptos genom att hämma NF-kB-medierad överlevnad väg [52]. Det återstår dock att fastställa huruvida förlust av tumörundertryck PML bidrar till förändringar i värdens immunsvar eller tumören mikro, kanske resulterar i antingen immunosurveillance eller immun flykt, genom modulering av transkriptionsfaktorer. Således skulle det vara intressant att jämföra effekterna av förlust av PML proteinuttryck på NF-kB /STAT-3 och STAT-1-signalering, och för att avgöra om dessa transkriptionsfaktorer fungerar på ett samordnat sätt för att reglera uttrycket av en delmängd av kemokiner som bidrar till upprättandet av inflammatoriska tumörmikromiljöer.

Material och metoder

Celler

Primär och odödlig Pml
<sup>+ /+ och Pml
- /- MEF fastställdes och underhållas som beskrivits tidigare [53]. Den SNU-638 human gastrisk carconoma cellinje, var Jurkat human T-cell-lymfoblast-liknande cellinje, och EL-4 från mus-T-lymfomcellinjer upprätthålls såsom tidigare beskrivits [2], [54].</sup>

gastric karcinomvävnader

totalt 49 magcancer paraffinblock erhölls från 49 patienter (29 män, 20 kvinnor, medianålder 64 år, intervall 35-84) som hade genomgått total eller delsumma gastrektomi för steg IV avancerade gastric karcinom på Mokdong sjukhus, Ewha Womans University School of Medicine, Seoul, Korea från 2001 till 2007.

Reagens och antikroppar

rekombinant murint och humant IFN-γ (mIFN-γ och hIFN- γ) och Mip-10 och hip-10 köptes från Prospec (Rehovot, Israel). Antikroppar mot PML (mus monoklonal) och STAT-1 köptes från Upstate Biotechnology, Inc. (Lake Placid, NY, USA) och neutraliserande antikropp mot IP-10 köptes från R &D Systems (Minneapolis, MN, USA). Antikropp till p-Y701-STAT-1 köptes från Cell Signa Technology (Beverly, MA). Antikroppar mot histon, var Lamin B och PML (kanin polyklonala) köpt från Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA), och anti-tubulin antikropp köptes från Sigma-Aldrich, Co. (St. Louis, MO, USA) .

immunohistokemi, cellräkning och mätning av immunreaktiva områden

mänskliga gastric cancervävnader bearbetades för immunohistokemisk analys som tidigare beskrivits [2] med mindre modifieringar. Primära antikroppar för PML (1:200, Santa Cruz Biotechnology), CD8 (1:50; Thermo Fisher Scientific, Fremont, CA, USA), och IP-10 (01:50; R &D Systems) användes. Alla bilder motfärgades med Mayers hematoxylin. Positiva kontroller erhölls med användning av Palatine tonsiller för PML protein och CD8 och nasofaryngeala odifferentierade karcinom för IP-10. Negativa kontroller erhölls genom att utelämna primära antikroppar från alla bilder. Immunopositivity för PML protein kategoriseras som diffus positivitet (kärn immunoreaktivitet i ≥50% av tumörcellerna), fokal positivitet (i ≥10%, men < 50%), eller fullständig förlust (i < 10% av tumörcellerna). Antalet CD8 immunpositiva celler i en hög effekt fält (HPF, x40) 0,25 mm ^{2 för fem slumpmässigt utvalda tumör infiltrativa gränser räknades för varje prov, följt av beräkning av det genomsnittliga antalet och SD. Immunopositivity för IP-10 definierades som alla kärn eller cytoplasmiskt positiva uttryck i tumörceller. För att bestämma den uttryckta nivån för varje bild, har digitala bilder som erhållits med hjälp av ett mikroskop monterad digitalkamera. Med ImageJ programvara (http://rsb.info.nih.gov/ij), fram varje bild omvandlas till 8-bitars gråskala och områdesdensiteterna mätt från pixlarna i regionen av intresse; endast pixlar som överstiger en viss nivå (större än 50 intensitetsvärde). inkluderades för att eliminera bakgrundsfelet}

siRNA transfektion

NIH3T3-celler transfekterades transient med användning av Mirus transfektionsreagens (Mirus Bio LLC, Madison,

• PLOS ONE: nedreglering av RPL6 av siRNA hämmar proliferation och cellcykelprogression av Human Gastric cancercellinjer
• PLOS ONE: MIR-29a hämmar celltillväxt och inducerar cellcykelstopp genom nedreglering av p42.3 i Human Gastric Cancer