PLoS ONE: Analyse der MET-mRNA-Expression in Magenkarzinome unter Verwendung von RNA in situ Hybridisierung Assay: Die klinische Implikation und Vergleich mit Immunhistochemie und Silber in situ-Hybridisierung

Abstrakt

Wir untersuchten MET
mRNA Status Ausdruck in-situ-Hybridisierung (ISH) Technik in primären und metastatischen Läsionen von 535 chirurgisch reseziert Magenkarzinom (GC) Fällen unter Verwendung von RNA. Wir verglichen die Ergebnisse mit denen von Immunhistochemie und Silber in-situ-Hybridisierung, und untersuchten den Zusammenhang mit klinisch-pathologische Merkmale und Prognose. Unter 535 primären GCs, 391 (73,1%) wurden 0 erzielte, 87 (16,3%) 1 erzielt wurden, 38 (7,1%) 2 erzielt wurden, 12 (2,2%) erzielt wurden 3 und 7 (1,3%) wurden 4 erzielt durch RNA ISH. High MET
mRNA-Expression (Score ≥3) wurde mit Lymphknotenmetastasen assoziiert ( P
= 0,014), Fernmetastasen ( P
= .001), und höhere TNM-Stadium ( P
< 0,001). MET
mRNA-Expression wurde mit Protein-Expression korreliert (r = 0,398; P
< 0,001) und der Anzahl der Genkopien (r = 0,345; P
<. 001). Die Patienten zeigen hoch MET
mRNA in primären oder metastatischen Läsionen hatte kürzere Überlebenszeit als diejenigen, zeigt Low- MET
mRNA (Primärtumoren, P
= .002; metastatischen Lymphknoten, P
< 0,001). Die Patienten positive Umwandlung von MET
mRNA Status bei metastasierendem Lymphknoten zeigt hatte kürzere Überlebenszeit als diejenigen, die keine Umwandlung ( P
= 0,011). Multivariate Analyse zeigte, dass hohe MET
mRNA-Expression in metastatischen Lymphknoten ein unabhängiger prognostischer Faktor für das Gesamtüberleben war ( P
= 0,007). Daher schlägt diese Studie, dass MET
mRNA-Expression durch RNA ISH beurteilt nützlich sein könnte, als ein potentieller Marker zu identifizieren MET
Onkogen-süchtig GC

Citation:. Choi J Lee HE, Kim MA, Jang BG, Lee HS, Kim WH (2014) Analyse von MET
mRNA Expression in Magenkarzinome unter Verwendung von RNA in situ Hybridisierung Assay: Die klinische Implikation und Vergleich mit Immunhistochemie und Silber in Situ Die Hybridisierung. PLoS ONE 9 (11): e111658. doi: 10.1371 /journal.pone.0111658

Editor: Svetlana Pack CCR, National Cancer Institute, NIH, Vereinigte Staaten von Amerika

Empfangen: 11. März 2014; Akzeptiert: 6. Oktober 2014; Veröffentlicht: 3. November 2014

Copyright: © 2014 Choi et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Arbeit wurde von der National Research Foundation of Korea (NRF) A3 Foresight-Programm (http://www.nrf.re.kr) unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung oder Vorbereitung des Manuskripts zur Veröffentlichung

Konkurrierende Interessen:.. Die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Während der letzten zehn Jahre Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK) Wege haben sich als attraktive Angriffspunkte für Medikamente für die Krebstherapie zu sein [1] und der MET-Weg ist eine dieser viel versprechende Ziele. MET
ist ein Proto-Onkogen in der 7q31-Locus befindet und codiert eine RTK für Hepatozyten-Wachstumsfaktor (HGF) [2], [3]. Die enge Regulierung des HGF /MET Weg, der in der Entwicklung und Regeneration beobachtet wird, wird in Krebs verloren, und solche Deregulation erfolgt durch mehrere Mechanismen [1]. Aberrant MET Aktivierung spielt eine wichtige Rolle in der Krebszelle Überleben, Wachstum, Angiogenese und Metastasierung bei verschiedenen Krebsarten wie Lungen-, Brust-, Nieren- und Magen-Darm-Trakt malignen Erkrankungen [4]. Obwohl jedoch zur Stratifizierung von Patienten nach MET-Expression oder Aktivität wichtig für den therapeutischen Erfolg ist, die Methoden für die Beurteilung der Höhe der MET-Expression oder Aktivität sind nicht hergestellt worden [4].

Für das Magenkarzinom (GC), anomale MET-Aktivierung ist gedacht worden, um eine Gen-Dosis-Effekt bezogen werden [5] und MET
Genamplifikation (GA) oder Protein-Überexpression mit aggressiven Tumor-Eigenschaften und /oder schlechteren klinischen Ergebnis [6] in Verbindung gebracht worden - [14]. Darüber hinaus MET
-amplified oder -overexpressed GC zeigte Ansprechen auf die Behandlung mit verschiedenen Inhibitoren des HGF /MET-Signalweg in präklinischen Studien [15] und die Phase I der klinischen Studien [12], [16]. Daher hat MET Hemmung das Potenzial als eine weitere erfolgreiche therapeutische Strategie folgende humanen epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor 2 (HER2) -targeted Therapie bei fortgeschrittenem GC. Allerdings haben frühere Studien verschiedene Methoden verwendet, MET-positive GC zu erkennen und haben Diskrepanz in der Prävalenz von MET-Überexpression oder Amplifikation gezeigt: MET-Überexpression in Studien betrug 18% auf 73,7% unter Verwendung von Immunhistochemie (IHC) [7] - [9], [13], [14], [17], MET
Genkopienzahl (GCN) Gewinn lag im Bereich von 10% bis 21,2% in Studien quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qPCR) [10] unter Verwendung von [ ,,,0],11] und MET
GA betrug 2% bis 3,9% in Studien unter Verwendung von Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH) [12], [18] oder Silber in situ-Hybridisierung (SISH) [13]. Von diesen Verfahren wird IHC weit verbreitet in der klinischen Praxis und der wahrscheinlichste Screening-Methode für den Nachweis von MET-positive GC verwendet. Allerdings ist die weitere Erforschung noch eine prädiktive Biomarker oder den Untersuchungsmethoden für eine MWB hemmende Therapie zu finden benötigt.

In dieser Studie führten wir eine RNA in situ Hybridisierung (ISH) Assay gepaart DNA-Oligonukleotid-Sonden und Vorverstärker-Verstärker -markierten Sonden zur Visualisierung [19]. Bei dieser Methode wird in Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE) Gewebe und ermöglicht Einzelmolekül-Visualisierung unter einem Hellfeld-Mikroskop. In unserer früheren Studie haben wir bewiesen, dass HER2
mRNA-Expression durch RNA ISH ausgewertet und mit Protein-Überexpression und GA ausgewertet durch IHC und FISH 211 GC Fällen [20] korreliert. Außerdem zeigten wir die Korrelation zwischen MET
GCN und Proteinexpression in einer früheren Studie [13]. Hier haben wir ausgewertet MET
mRNA-Expression unter Verwendung von RNA ISH-Verfahren, und verglichen die Ergebnisse mit denen von IHC und SISH in einer großen Serie von GC. Darüber hinaus wurden klinisch-pathologische Parameter und die klinischen Ergebnisse von GC Patienten nach MET
mRNA-Expression Status ausgewertet.

Materialien und Methoden

Patienten und Gewebeproben

Wir sammelten Archivierung von Gewebeproben von GC-Patienten, die nacheinander unterzog Gastrektomie an der Seoul National University Hospital, Seoul, Korea, von Januar 2004 bis Dezember 2005 schließlich 535 Proben von primären GC und 199 Proben von synchronen regionalen metastatischen Lymphknoten (LN) aus 535 Patienten wurden für diese Studie zur Verfügung. Die klinisch-pathologische Merkmale der Patienten wurden durch die Überprüfung medizinische Diagramme und pathologischen Aufzeichnungen (Tabelle 1) untersucht. TNM-Stadium wurde nach dem System des American Joint Committee on Cancer Staging-Handbuch klassifiziert, 7 ^{th Edition. Klinische Ergebnisse wurden ab dem Zeitpunkt der Operation bis zum Tod oder 60 Monate beobachtet.}

Alle Gewebeproben für 24-48 Stunden in 10% gepuffertem Formalin fixiert wurden und dann in Paraffin eingebettet. Kerngewebe (2 mm Durchmesser) wurden unter Verwendung eines Trepan Vorrichtung entnommen (Superbiochips Laboratories, Seoul, Korea). Für die primäre GCs wurde die Invasion vor jedem Primärtumor ausgewählt. Metastasiertem LNs wurden dem Gewebearray ausgesetzt, aber die Fälle mit Mikrometastasierung wurden ausgeschlossen. Insgesamt 22 Tissue Microarray-Blöcke, die zu 60 Kerne enthielten bis gebaut.

Ethical Aussage

Alle menschlichen Proben wurden während der therapeutischen Chirurgie erhalten. Die Teilnehmer hat nicht die schriftliche Zustimmung in dieser Studie teilzunehmen. Die retrospektive Studie wurde unter Verwendung der Proben über die Regale nach der pathologischen Diagnose durchgeführt, und alle Proben wurden vor der Studie anonymisiert. Unser IRB (Seoul National University Hospital) genehmigte diese retrospektive Studie unter der Bedingung der Anonymisierung (Referenz: H-1006-035-320).

RNA ISH

Für die in situ Nachweis von MET
mRNA, die RNAscope FFPE 2.0 Assay-Kit (Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA, USA) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. Kurz gesagt, wurden 2 bis 3 um dicken FFPE Gewebeschnitte entparaffiniert, erwärmt, durch Protease behandelt und für 2 Stunden (die Referenzsequenz, NM_001127500; Sondenregion, 1236 bis 2257) mit der Sonde bei 40 ° C hybridisiert. Nach dem Waschen und Amplifikation, 3, 3'-Diaminobenzidin wurde für den Nachweis von Ziel-RNA zugegeben. Die Zellkerne wurden mit Hämatoxylin gegengefärbt. Eine positive Färbung wurde durch braune punctate Punkte im Zellkern und /oder Zytoplasma angegeben. MET
mRNA Expression in 5 Klassen gemäß der Hersteller Scoring-Richtlinie eingestuft wurden: 0 punkten, keine Färbung oder < 1 Punkt pro Zelle; Note 1, 1-3 Punkte pro Zelle (sichtbar bei 20-40 ×); Note 2, 4-10 Punkte pro Zelle und keine oder nur sehr wenige Punktcluster (sichtbar bei 20-40 ×); Note 3, > 10 Punkte pro Zelle und < 10% positive Zellen Punktcluster (sichtbar bei 20 ×); Note 4, > 10 Punkte pro Zelle und > 10% positive Zellen Punktcluster (sichtbar bei 20 ×) (Bild 1) haben. Die Sonden für UBC
(Ubiquitin C) und dapB
(ein bakterielles Gen) wurden als positive und negative Kontrolle verwendet wurden. Die Proben wurden als ausreichend angesehen, wenn die UBC
mRNA-Signale unter einem 10-fach Objektivlinse leicht sichtbar waren und die dapB
Signal nicht sichtbar war.

IHC und SISH

Die immunhistochemische Färbung für MET wurde mit anti-Gesamt MET (SP44) Kaninchen monoklonalen primären Antikörper (Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, USA) durchgeführt. Eine automatische immunostainer (BenchMark XT, Ventana Medical Systems) wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers verwendet. MET-Immunfärbung wurde mit den HercepTest Scoring-Richtlinien für die GC (DAKO, Glostrup, Dänemark) erzielt: Score 0, keine Membranfärbung oder Membranfärbung in < 10% der Tumorzellen; Note 1, schwach /kaum wahrnehmbare Teilmembranfärbung in > 10% der Tumorzellen; Note 2, schwache bis mäßige Anfärbung der gesamten Membran in > 10% der Tumorzellen; Note 3, eine starke Färbung der gesamten Membran in >. 10% der Tumorzellen (Abbildung 2)

wurde Doppel-Farbe SISH Test durchgeführt mit MET-DNA-Sonde INFORM und Chromosome 7 Sonde (Ventana Medical Systems) INFORM auf einem XT Ventana BenchMark den Protokollen des Herstellers folgen. Die Signale wurden in 40 Tumorzellkerne pro Kern aufgezählt, und MET
Gen-Status wurde in 6 Gruppen eingeteilt, die University of Colorado Cancer Center Kriterien für den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor-Gen unter Verwendung von [21] (Abbildung 2).

die statistische Analyse

die χ ^{2-Test oder der exakte Test nach Fisher wurde verwendet, um den Zusammenhang zwischen MWB-Status und klinisch-pathologische Faktoren zu testen. Der Student t
-Test wurde verwendet, mittels kontinuierlichen Variablen zu vergleichen. Der Spearman Korrelationstest wurde verwendet, um die Beziehung zwischen RNA ISH Ergebnisse und IHC oder SISH Ergebnisse zu bewerten. Die Kaplan-Meier-Methode wurde verwendet, das Gesamtüberleben (OS) zu schätzen und OS Unterschiede zwischen den Gruppen mit unterschiedlichen MWB-Status wurden mit dem Log-Rank-Test verglichen. Multivariaten Analyse wurde mit dem Cox Proportional Hazard Ratio Modell. Die Datenanalyse unter Verwendung von SPSS Version 20.0 (SPSS, Chicago, IL, USA) durchgeführt wurde, und die Ergebnisse wurden als signifikant angesehen, wenn P
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Ergebnisse

• PLoS ONE: Wirkung der Eradikation von Helicobacter pylori auf Expression von FHIT, IL-8 und P73 in der Magenschleimhaut von Verwandten ersten Grades von Patienten mit Magenkrebs
• PLoS ONE: A 346 Fallanalyse für laparoskopische Spleen-Preserving No.10 Lymphknotendissektion für Proximale Magenkrebs: ein einziges Zentrum Study