PLoS ONE: Анализ MET экспрессия мРНК в желудочном Раки с использованием РНК В гибридизация анализе: его клиническое проявление и сравнение с иммуногистохимии и серебро в гибридизация

Абстрактный
<р> Мы исследовали Met
статус экспрессии мРНК с использованием РНК гибридизация (МОГ) техники в первичных и метастатических поражений 535 хирургическим путем резекции рака желудка (GC) в случаях. Мы сравнили результаты с результатами иммуногистохимии и серебра в гибридизация, и исследовали ассоциацию с клиникопатологическими характеристиками и прогнозом. Среди 535 первичных ШС, 391 (73,1%) были забиты 0, 87 (16,3%) было забито 1, 38 (7,1%) было забито 2, 12 (2,2%) были забиты 3 и 7 (1,3%) были забиты 4 по РНК ISH. Высокие Met
экспрессии мРНК (оценка ≥3) была связана с метастазов в лимфатических узлах ( P
= 0,014), отдаленных метастазов ( P
= .001), и более высокая стадия TNM ( P
&л; 0,001). Met
экспрессия мРНК коррелировало с экспрессией белка (г = 0,398; P
&л; 0,001) и число копий гена (г = 0,345; P
&л;. 001). Пациенты, показывающие высокого Met
мРНК в первичных или метастатических поражений имели меньшую общую выживаемость, чем те, которые показывают с низким Met
мРНК (первичные опухоли, P
= 0,002; метастатических лимфатических узлов, P
&л; 0,001). Пациенты, показывающие положительное преобразование Met
статуса мРНК в метастатической лимфатического узла была короче общей выживаемости, чем те, без преобразования ( P
= 0,011). Многофакторный анализ показал, что высокий Met
экспрессия мРНК в метастатической лимфатический узел был независимым прогностическим фактором для общей выживаемости ( P
= .007). Таким образом, это исследование показывает, что Met
экспрессии мРНК оценивали с помощью РНК-ISH может быть полезным в качестве потенциального маркера для идентификации Met
онкоген пристрастившихся GC

Citation:. Choi J Ли ОН, Ким М.А., Jang BG, Ли HS, Ким WH (2014) Анализ Met
экспрессия мРНК в желудочном Раки с использованием РНК в гибридизация анализе: его клиническая подтекста и сравнение с иммуногистохимии и серебро в Ситу гибридизация. PLoS ONE 9 (11): e111658. DOI: 10.1371 /journal.pone.0111658
<р> Редактор: Светлана Pack, CCR, Национальный институт рака, NIH, Соединенные Штаты Америки
<р> Поступило: 11 марта 2014 года; Принято: 6 октября 2014 года; Опубликовано: 3 ноября 2014
<р> Copyright: © 2014 Choi и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Эта работа Работа выполнена при поддержке Национального научного фонда программы Корея (NRF) A3 Foresight (http://www.nrf.re.kr). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение

в течение последнего десятилетия, рецептор тирозинкиназы (РТК) пути оказались привлекательными объектами наркотиков для противораковой терапии [1], а путь MET является одним из таких перспективных целей. МЕТ
является прото-онкоген расположен на 7q31 локус и кодирует РТК для фактора роста гепатоцитов (HGF) [2], [3]. Плотный регулирование пути HGF /Met, которая наблюдается в развитии и регенерации теряется при раке, и такое дерегулирование происходит через несколько механизмов [1]. Аномальным активации МЕТ играет важную роль в выживании клеток рака, роста, ангиогенеза и метастазирования в различных видов рака, включая легких, молочной железы, почек, а также злокачественных опухолей желудочно-кишечного тракта [4]. Тем не менее, хотя расслоение пациента в соответствии с экспрессией или активностью MET имеет важное значение для успеха терапии, методы оценки уровня экспрессии или активности MET не были установлены [4].
<Р> Для рака желудка (GC), аберрантное МЕТ активации, как считалось быть связано с эффектом дозы гена [5], и Met
амплификации гена (GA) или белок избыточная экспрессия была связана с агрессивными характеристиками опухоли и /или хуже, клинический исход [6] - [14]. Кроме того, Met
-amplified или -overexpressed ГХ показал ответ на лечение с несколькими ингибиторов сигнального пути HGF /МЕТ в доклинических исследованиях [15] и фазы клинических испытаний [12], [16]. Следовательно, ингибирование МЕТ имеет потенциал в качестве еще одного успешного терапевтической стратегии следующий человеческого эпидермального фактора роста рецептора 2 (HER2) -targeted терапии в пожилом GC. Тем не менее, предыдущие исследования использовали различные методы для идентификации МЕТ-позитивного GC и показали расхождение в распространенности MET экспрессией или амплификации: MET избыточная экспрессия колебалась от 18% до 73,7% в исследованиях с использованием иммуногистохимии (IHC) [7] - [9], [13], [14], [17], Met
числа копий гена (GCN) коэффициента усиления в диапазоне от 10% до 21,2% в исследованиях с использованием количественной ПЦР в реальном времени (КПЦР) [10], [ ,,,0],11], и Met
GA варьировались от 2% до 3,9% в исследованиях с использованием флуоресценции в гибридизация (FISH) в [12], [18] или серебряная гибридизация (SISH) [13 в]. Из этих методов IHC широко используется в клинической практике и метод, скорее всего, скрининг для выявления MET-положительного GC. Тем не менее, дальнейшее изучение по-прежнему необходимо, чтобы найти прогностическую биомаркера или методологию анализа для ингибирования MET терапии.
<Р> В этом исследовании мы провели РНК гибридизация (МОГ) анализа при помощи парного ДНК олигонуклеотидных зондов и предусилитель-усилитель -label зонды для визуализации [19]. Этот метод использует фиксированные формалином, залитых парафином (FFPE) тканей и позволяет визуализировать одной молекулы под ярко-поле микроскопа. В нашем предыдущем исследовании, мы доказали, что Her2
экспрессия мРНК оценивали РНК ISH была хорошо коррелируют с повышенной экспрессией белка и GA оценивали с помощью IHC и FISH в 211 случаях GC [20]. Кроме того, мы показали корреляцию между MET
GCN и экспрессии белка в предыдущем исследовании [13]. Здесь мы оценивали Met
экспрессии мРНК с помощью метода РНК ISH, и сравнили результаты с результатами IHC и SISH в большой серии GC. Кроме того, клиникопатологическими параметры и клинические исходы больных ГХ в соответствии с Met
статус экспрессии мРНК оценивали.

Материалы и методы

Пациенты и ткани образцов
<р> Мы собрали образцы архивные ткани пациентов GC, которые последовательно гастрэктомия в Прошел Сеульского национального университета, больницы Сеул, Корея, с января 2004 по декабрь 2005 года, наконец, 535 образцов первичного GC и 199 образцов синхронного регионального метастатическим лимфатического узла (LN) из 535 пациентов были доступны для этого исследования. В клиникопатологическими характеристики пациентов были исследованы путем анализа медицинских карт и патологические записи (таблица 1). TNM стадия была классифицирована в соответствии с системой американского Объединенного комитета по вопросам рака Руководство по Подмости, 7 ^{е издание. Клинические исходы наблюдались с момента операции до смерти или 60 месяцев
. <Р> Все образцы ткани фиксировали в 10% забуференном формалине в течение 24-48 часов, а затем заливали в парафин. Основные ткани (2 мм в диаметре) были взяты с использованием Трепан аппарата (Superbiochips Laboratories, Сеул, Корея). Для первичных ШС, был выбран нашествие фронт каждой первичной опухоли. Метастатические LNS были подвергнуты массива ткани, но случаи с микрометастазами были исключены. Всего было построено 22 блоков ткани микрочипов, которые содержали до 60 ядер.}

Этические утверждение
<р> Все человеческие образцы были получены в ходе терапевтической хирургии. Участники не предоставил письменное согласие на участие в этом исследовании. Ретроспективный исследование проводили с использованием образцов в течение полок после патологической диагностики, и все образцы были анонимными до исследования. Наш IRB (Seoul National University Hospital) одобрил эту ретроспективное исследование при условии обезличивания (Артикул: H-1006-035-320).

РНК ISH

Для обнаружения на месте их залегания в Met
мРНК, 2,0 набора для анализа RNAscope FFPE (Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA, USA) использовали в соответствии с инструкциями изготовителя. В кратком изложении, 2-к тканевые срезы толщиной FFPE 3-мкм депарафинировали, нагревают, обрабатывают с помощью протеазы, и гибридизуют с зондом при температуре 40 ° С в течение 2-х часов (Эталонная последовательность, NM_001127500; зондировать область, 1236-2257). После промывки и амплификации, 3, 3'-диаминобензидин добавляли для обнаружения РНК-мишени. Ядра контрастному окрашиванию гематоксилином. Положительное окрашивание указывает коричневыми точечными точками в ядре и /или цитоплазме. не Met
уровни экспрессии мРНК были разделены на 5 классов в соответствии с скоринга руководства завода-изготовителя: оценка 0, нет окрашивания или &л; 1 точка на клетку; Счет: 1, 1-3 точек на ячейку (видимые на 20-40 ×); забито 2, 4-10 точек на клетку и нет или очень мало точечных кластеров (видимые на 20-40 ×); 3 балла, > 10 точек в ячейке и &ЛТ; 10% положительных клеток имеют точечные кластеры (видимые при 20 ×); 4 балла, > 10 точек в ячейке и > 10% положительных клеток имеют точечные кластеры (видимые при 20 ×) (рисунок 1). Зонды для UBC
(убиквитин C) и dapB
(бактериального гена) были использованы в качестве положительного и отрицательного контроля, соответственно. Образцы считаются адекватными, когда UBC
мРНК сигналы были хорошо видны под 10-кратным объективом а dapB
сигнал не был виден.

IHC и SISH
<р> иммуногистохимическое окрашивание MET осуществляли с помощью анти-MET общего (SP44) кроличьих моноклональных антител (первичные Ventana Medical Systems, Tucson, AZ, США). Автоматический immunostainer (BenchMark XT, Ventana Medical Systems) использовали в соответствии с инструкциями изготовителя. MET иммунное был забит с руководящими указаниями HercepTest тем самым увеличив счет GC (DAKO, Glostrup, Дания): Счет: 0, отсутствие мембраны окрашивания или мембраны окрашивание в &л; 10% опухолевых клеток; 1 балл, слабый /едва заметное частичное окрашивание мембраны в &ГТ; 10% опухолевых клеток; оценка 2, слабый до умеренного окрашивания всей мембраны в &ГТ; 10% опухолевых клеток; оценка 3, сильное окрашивание всей мембраны в &ГТ;. 10% опухолевых клеток (рисунок 2)
<р> двухцветными SISH анализ проводили с INFORM MET ДНК-зонд и INFORM хромосоме 7 зонда (Ventana Medical Systems) на BenchMark XT Ventana следующие протоколы изготовителя. Сигналы были перечислены в 40 ядрах опухолевых на ядро, и Met
статус гена классифицировали на 6 групп по Университета Колорадо онкологического центра критерии гена рецептора эпидермального фактора роста [21] (Рисунок 2).

Статистический анализ
<р> χ ^{2 тест или точный критерий Фишера использовали для проверки связи между МЕТ статусом и клиникопатологическими факторов. Студента т
-test был использован для сравнения средних непрерывных переменных. Корреляция тест Спирмена был использован для оценки взаимосвязи между результатами и IHC РНК ISH или результатов SISH. Метод Каплана-Мейера использовали для оценки общей выживаемости (OS), а также различия OS между группами с различным статусом MET сравнивали с помощью лог-рангового теста. Многофакторный анализ выживаемости проводили с использованием коэффициента пропорционального риска Кокса модели. Анализ данных проводился с помощью программы SPSS версия 20.0 (SPSS, Чикаго, Иллинойс, США), и результаты были признаны значимыми, когда P
&л;. .05}

Результаты

1. Met
статус мРНК оценивали с помощью РНК ISH
<р> 535 первичных опухолей, 391 (73,1%), 87 (16,3%), 38 (7,1%), 12 (2,2%) и 7 ( 1,3%) показал РНК ISH оценка 0, 1, 2, 3, и 4, соответственно. Когда мы сравнили результаты РНК ISH с клиникопатологическими данных, включая выживание, и проанализированы результаты РНК-ISH с IHC и SISH данных, группы балла 3 и 4 показали, отличительные черты. Поэтому мы считали счет 3 и 4, как высоко- Met
группа мРНК, и всего 19 случаев (3,5%) принадлежали к высоко- Met
мРНК.
<Р> Высокий - Met
мРНК была связана с более старшего возраста ( P
= .002), больший размер опухоли ( P
= 0,006), Л. Н. метастазирования ( P
= 0,014), лимфатической инвазии ( P
&л; 0,001), увеличение числа метастатических лимфатических узлов ( P
&л; 0,001), отдаленных метастазов ( P
= .001), и более высокая стадия TNM ( P
&л; 0,001) по сравнению с низким Met
мРНК (таблица 2). Тем не менее, с высоким Met
мРНК не показали никаких ассоциаций с пола, локализации опухоли, классификации Lauren, и глубина вторжения (таблица 2).
<Р> 199 синхронных метастатических лимфоузлов, 119 (59,8% ), 45 (22,6%), 22 (11,1%), 4 (2,0%) и 9 (4,5%) показал РНК ISH балл 0, 1, 2, 3, и 4, соответственно. Таким образом, в 13 случаях (6,5%) были высокого Met
мРНК. Среди 199 пар первичных и метастатических поражений, 186 (93,5%) показали согласные Met
статус мРНК и 13 (6,5%) не сделал. Из этих 13 случаев несогласованных, отрицательная конверсия была обнаружена в 50% (7/14) высококаче-

• PLoS ONE: Влияние эрадикации Helicobacter Pylori на экспрессию уровней FHIT, IL-8 и Р73 в желудочном слизистая родственников пе…
• PLoS One: 346 Case анализ для лапароскопической Селезенка сохраняющих No.10 лимфодиссекция для проксимального рака же…