PLoS ONE: Das hat-miR-526b Bindungsstelle rs8506G > Ein Polymorphismus im lincRNA-NR_024015 Exon Identifiziert durch Gwäss prädisponieren zu Nicht-Cardia Magenkrebs Risk

Abstrakte

Magenkrebs einschließlich der Cardia und nicht -cardia Typen ist die zweithäufigste Ursache der durch Krebs verursachten Todesfälle weltweit. Eine Untergruppe von Nicht-Cardia Magenkrebs genetische Anfälligkeit Loci wurden unter den asiatischen durch genomweite Assoziationsstudien (Gwäss) angesprochen. Diese Studie war es, die Auswirkungen von Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs) von langen intergenischen nicht-kodierenden RNAs (lincRNAs) auf Nicht-Cardia Magenkrebs Anfälligkeit in der chinesischen Bevölkerung zu bewerten. Wir haben uns lange intergenic nicht-kodierenden RNAs (lincRNAs) befindet sich in einer Nicht-Cardia Magenkrebsrisiko im Zusammenhang mit loci und identifiziert 10 SNPs befindet sich innerhalb lincRNA exonische Regionen. Wir untersuchten, ob genetische Polymorphismen in lincRNAs Exons mit nicht-Cardia Magenkrebsrisiko bei 438 nicht-Cardia chinesischen Bevölkerung Magenkrebs-Patienten und 727 Kontrollpersonen in logistischer Regression assoziiert sind. Funktionelle Relevanz wurde durch biochemische Assays untersucht. Wir fanden, dass lincRNA-NR_024015
rs8506AA Träger signifikant mit dem Risiko einer nicht-Cardia Magenkrebs (adjustierte Odds Ratio assoziiert war [OR] = 1,56, 95% CI = 1,03-2,39, verglichen mit der rs8506 AG oder GG . Genotyp weitere Stratifizierung-Analyse zeigte, dass das Risiko Effekt in Subgruppen von Rauchern ausgeprägter war ( P
= 0,001) Biochemische Analysen zeigten, dass die G bis A Basenänderung bei rs8506G >. A die Bindungsstelle für HAS- stört . miR-526b, wodurch die Transkriptionsaktivität von Beeinflussung lincRNA-NR_024015
und die Auswirkungen auf die Zellproliferation Unsere vorliegende Studie eine robuste Verbindung zwischen dem rs8506G etablierten > ein Polymorphismus in der lincRNA-NR_024015
Exon und das Risiko von nicht-Cardia Magenkrebs

Citation: Fan QH, Yu R, Huang WX, Cui XX, Luo BH, Zhang LY (2014) HAS-miR-526b Bindungsstelle rs8506G > ein Polymorphismus. in der lincRNA-NR_024015
Exon identifiziert durch Gwäss prädisponieren zu Nicht-Cardia Magenkrebsrisiko PLoS ONE 9 (3):. e90008. doi: 10.1371 /journal.pone.0090008

Editor: Xiaoping Miao, MOE Key Laboratory von Umwelt und Gesundheit, School of Public Health, Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, China

empfangen: 11. Dezember 2013; Akzeptiert: 25. Januar 2014; Veröffentlicht: 4. März 2014

Copyright: © 2014 Fan et al. Dies ist eine Open-Access-Artikel unter den Bedingungen der Lizenz Creative Commons, die uneingeschränkte Nutzung erlaubt, die Verteilung und Vervielfältigung in jedem Medium, vorausgesetzt, der ursprüngliche Autor und Quelle genannt werden

Finanzierung:. Diese Studie unterstützt wurde von der Suzhou Social Development Fund Projekt (SS08047), Jiangsu Province Key medizinischen Abteilung im Jahr 2011. die Geldgebern hatte keine Rolle in Studiendesign, Datenerfassung und Analyse, Entscheidung zu veröffentlichen oder um die Herstellung des Manuskripts.

Interessenkonflikt: die Autoren haben erklärt, dass keine Interessenkonflikte bestehen

Einführung

Magenkrebs (GC) ist die zweite Ursache von Krebs weltweit nach Lungenkrebs im Jahr 2010, obwohl die Sterblichkeit Todesfälle führende Tod. leicht von 774.000 haben im Jahr 1990 auf etwa 755.000 im Jahr 2010 zurückgegangen [1], [2]. Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass Umweltfaktor zeigte, einschließlich Ernährung, Rauchen, Alkoholverbrauch und vor allem eine Infektion mit Helicobacter pylori mit einem höheren Risiko für GC verbunden sind [3], [4]. Trotz dieser bekannten Risikofaktoren, überzeugte Forscher immer noch, dass genetische Faktoren, insbesondere Einzelnukleotid-Polymorphismen (SNPs), sind wahrscheinlich eine wesentliche Rolle in einer Person das Risiko der Entwicklung von Magenkrebs als nur ein Bruchteil der exponierten Personen entwickeln Magenkrebs zu spielen [5] .

Bis heute mit dem Fortschritt der Transkriptom-Sequenzierung der nächsten Generation (RNA-Seq), gibt es eine grundlegende Änderung wurde in unserem den gesamten Satz von Transkriptionsfehler in einer Krankheit zu verstehen, einschließlich neuer Transkripte und nicht-kodierenden RNAs (ncRNAs) nicht mit konventionellen Analysen [6] gemessen - [9]. Von all den derzeit gekennzeichnet Klassen von nicht-kodierenden RNAs Moleküle, haben diese lange genannt worden dazwischen ncRNAs (lincRNAs) mehr als 200 Nukleotiden (nt), die einen offenen Leserahmen sind, fehlen und nicht Protein-kodierenden Gene [7] überlappen, [10]. [15] - Gruppen von lincRNAs wurden korreliert mit wichtigen zellulären Prozessen zu einem gewissen Grad und demonstriert wie Prägung, X-Chromosom-Inaktivierung, Pluripotenz Wartung und Transkriptionsregulation [10] gut charakterisiert. Darüber hinaus haben immer mehr Anzeichen dafür dysregulated lincRNA Ausdruck in zahlreichen Krebsarten lincRNA als neuer Aspekt der Biologie entstanden, mit Hinweise darauf, dass eine wichtige Rolle für die Beteiligung von lincRNA in menschlichen Tumorentstehung und Metastasierung [16], [17]. Tatsächlich ist ein gut beschriebenes Beispiel: HOTAIR
die Beiträge zur schrittweisen Fortschreiten der Tumorentstehung [11], [18] untersucht worden, die Rolle der lncRNAs in der Krebsbiologie hervorheben. Darüber hinaus ist die lange nichtkodierende RNA MALAT1
(Metastasen-assoziierten Lungenadenokarzinom transcript 1), ist häufig Fehlregulation und als prädiktive Marker für eine Vielzahl von menschlichen Krebserkrankungen des Kolons, der Brust und der Prostata [19] - [ ,,,0],22]. Dennoch hat sich die Mechanismen, die spezifische Funktion von lincRNAs bei der Krebsentwicklung zugrunde liegenden nicht vollständig abgegrenzt worden.

In den letzten zehn Jahren mehrere unvoreingenommene genomweite Assoziationsstudien (GWAS) haben unser Verständnis der genetischen Variationen im Zusammenhang mit verschiedenen verbreiterte Arten von Krankheiten und Krebserkrankungen durch hohe Durchsatztechnologien [23]; jedoch mindestens ein Drittel der identifizierten Varianten sind in nicht-kodierenden Intervallen [24]. Vor kurzem zeigte zwei GWAS, dass mehrere Anfälligkeit Risiko-Loci, die mit nicht-Cardia Magenkrebs (NCGC) Risiko in einem chinesischen Bevölkerung verbunden sind. Bioinformatik-Analyse hat zahlreiche lincRNAs nah an diesen Loci aufgedeckt. Darüber hinaus mehrere relevante Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) in den exonische Regionen lincRNAs gelegen, die mit NCGC identifiziert assoziieren kann; jedoch hat die Assoziation zwischen genetischen Variationen in lincRNAs Exons und Krebsanfälligkeit selten berichtet.

In der vorliegenden Studie wurde die Hypothese aufgestellt, dass SNPs im exonische Region lincRNAs Ebenen Ausdruck verändert und damit zur Beeinträchtigung zu NCGC beitragen können. Um diese Hypothese zu testen, führten wir eine Krankenhaus-Fall-Kontroll-Studie, um die Verbindungen zwischen diesen SNPs und die Anfälligkeit für NCGC in einem chinesischen Bevölkerung untersuchen.

Materialien und Methoden

Studienteilnehmer

Alle Probanden in der aktuellen Studie waren ethnisch homogenen Han-Chinesen einschließlich 438 NCGC Patienten und 727 gesunden Kontrollpersonen. Die Patienten, die eine Operation an den angeschlossenen Krankenhäusern von Soochow University (Suzhou) unterzogen wurden fortlaufend von 2003 bis 2009 mit einer Rücklaufquote von 94% eingestellt. Die Patienten wurden von Suzhou Stadt und die umliegenden Regionen, und es gab keine Alter, Geschlecht und Histologie Einschränkungen. Details zu den klinischen Merkmale der Patienten sind in Tabelle 1 zusammengefasst Der Tumor, Knoten, Metastasen (TNM) Klassifikation und Tumor-Staging ausgewertet wurden nach dem 2002 American Joint Committee on Cancer Staging-System. Bevölkerung Kontrollen waren Krebs-freie Menschen in Suzhou Region leben; sie wurden in der gleichen Zeit von einer Ernährungs Umfrage ausgewählt, wie die Fälle gesammelt wurden. Die Kontrollproben wurden uns aus früheren Studien, die zufällig aus einer Datenbank ausgewählt wurden, bestehend aus 3500 Individuen auf der Grundlage einer körperlichen Untersuchung [25] - [27]. Die Messung für Serum H.pylori Immunglobulin G in NCGC Patienten und Kontrollen wurde durch enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) bestimmt. Diese Studie wurde von der medizinischen Ethikkommission der Soochow Universität genehmigt. Alle Teilnehmer waren genetisch nicht verwandten ethnischen Han-Chinesen und keiner hatte eine Bluttransfusion in den letzten 6 Monaten. eine schriftliche informierte Zustimmung gegeben hat, wurde jeder Teilnehmer für ein Interview mit einem strukturierten Fragebogen geplant ausgewählte Informationen zu sammeln, und 5 ml peripherem Blut zu spenden.

SNP-Auswahl

Alle veröffentlichten Literatur eine Untersuchung Assoziation zwischen genetischen Anfälligkeit und NCGC Risiko in Betracht kamen. Wir suchten nach Studien bis August 2013 die PubMed-Datenbank und Web of Science mit. Relevante Suchbegriffe waren "genomweite Assoziationsstudie", "GWAS", "NCGC", "Magenkrebs", "Magenkrebs" und "Asian". Wir suchten auch manuell die Referenzlisten in ausgewählten Artikeln. Ausgeschlossen wurden zunächst einige Artikel durch Scannen der Titel und Abstracts von Studien, die nicht in englischer Sprache verfasst wurden. Dann, nach dem vollständigen Wortlaut der übrigen Artikel lesen, identifizierten wir eine abschließende Reihe von Studien. Alle ausgewählten Studien erfüllten die folgenden Kriterien: (1) das Ergebnis wurde auf GWAS sucht Sitz in Bezug auf NCGC beim Menschen; (2) Die Artikel wurden in englischer Sprache veröffentlicht; (3) wurden die neuesten Studien ausgewählt unter Daten überlappen und duplizierten Daten; (4) GWAS wurde mit Chip-Technologie durchgeführt. Die wichtigsten Ausschlusskriterien waren (1) Bewertungen, Tutorials, Briefe und Editorials; (2) doppelte Daten; (3) kein Fall-Kontroll-Design; und (4) überlappende Daten oder Daten, die von den jüngsten Berichten abgeladen. Als nächstes wir die Suszeptibilitätsloci von GWAS für NCGC in ausgewählten Artikeln identifiziert abgekocht, 4 lincRNAs, die nicht in jeder Richtung mit beliebigen anerkannten Gene innerhalb einer 1-MB-Bereich dieser Loci überlappen hat (insgesamt Spanne von 2 MB) wurden schließlich identifiziert aus dem menschlichen lincRNAs Datenbank [28]. Darüber hinaus wurde für bioinformatische Analyse von Haplotyp-Block auf der Grundlage der chinesischen Han Peking (CHB) Bevölkerungsdaten in HapMap (HapMap Datenfreigabe 27 Phase-II + III, im Februar 2009, auf der NCBI B36 Montage, dbSNP b126) Haploview Software 4.2 verwendet. Diese SNPs mit minor Allel-Häufigkeiten von mehr als 5% in der chinesischen Bevölkerung extrahiert. Es gab drei Haplotyp-Blöcke in der chinesischen Bevölkerung (1A). Die Haplotyp-Tagging SNPs wurden mit dem Haploview Software 4.2 Tagger-Programm ausgewählt; es war, dass die rs11752896, rs11752942, rs4714336 und rs4711631 fand den Haplotyp in Block 1 mit einer 100% Frequenz abgedeckt (rs11752896 und rs11752942: D '= 1,0, r ^{2 = 1,0; rs11752896 und rs4714336: D' = 1,0, r 2 = 1,0; rs11752896 und rs4711631: D '= 1,0, r 2 = 1,0). Zusätzlich rs2467950, rs2450764 und rs9312 bedeckt rs8506 den Haplotyp in Block 1 zu einem 100%, bzw. (rs2467950 und rs2450764: D '= 1,0, r 2 = 1,0; rs9312 und rs8506: D' = 1,0, r 2 = 1,0). SNPs rs2304285 und rs2477757 sind außerhalb der Blöcke. Aus diesem Grund wurden die SNPs rs11752896, rs2467950, rs8506, rs2477757 und rs2304285 als fünf potentielle funktionelle SNPs im exonische der ausgewählten lincRNAs gewählt für ihre Verbände mit Risiko von Magenkrebs untersucht werden.}

Genotyping Analyse

Genom-DNA wurde aus peripheren Blut-Lymphozyten des Probanden extrahiert. Allelspezifische MALDI-TOF-Massenspektrometrie wurden verwendet, um die Markierungen in der Assoziation verwendet, um Genotyp analysiert, wie zuvor beschrieben [27], [29]. Insgesamt 60 Proben wurden zufällig für die direkte Sequenzierung ausgewählt, um die Genotypisierung Ergebnisse der massenspektrometrischen Analyse zu bestätigen, und die Ergebnisse waren in Übereinstimmung von 100%. Ungefähr 10% der Proben wurden ebenfalls für eine verblendete Wiederholung der Genotypisierung ohne vorherige Kenntnis der vorherigen Genotypisierung Ergebnis oder den Status zufällig ausgewählt von einem Fall und Kontrolle zu sein, und die Ergebnisse waren in Übereinstimmung von 100%.

Cell Culture

der 293T oder HGC-27-Zellen wurden aus der Zellbank von Type Culture Collection der chinesischen Akademie der Wissenschaften, Shanghai Institute of Cell Biology erworben und wurden für weniger als 6 Monate agiert. Die 293T oder HGC-27-Zellen wurden in DMEM mit hohem Glucosegehalt (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) oder RPMI 1640 Medium mit 10% hitzeinaktiviertem fötalem Rinderserum (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) ergänzt beibehalten und 50 ug /ml Streptomycin (Gibco-BRL, Gaithersburg, MD, USA) bei einer 37 ° C in Gegenwart von 5% CO _2.

Subcellular Fractionation

HGC- 27-Zellen wurden in einem befeuchteten Inkubator für 2 Tage kultiviert. Für subzelluläre Fraktionierung Experimenten bis zu 2 x 10 ^{6 Zellen verwendet wurden. Cytosolic und Kernextrakten von Brustkrebszellen wurden mit einem Kern /Cytosol Fractionation Kit (Biovision, USA) gesammelt nach den Anweisungen des Herstellers.}

In-silico
Vorhersage von Faltungsstrukturen induziert durch Rs8506G > A in LincRNA-NR_024015

Da bestimmte Strukturen sind eher eine Schlüsselrolle in biologischen Funktionen zu spielen; so haben wir RNAfold und SNPfold Algorithmen, um den vermeintlichen Einfluss von rs8506G >vorherzusagen; A auf den lokalen Faltungsstrukturen von lincRNA-NR_024015 und Videos, die 61-bp Regionen Analyse des Polymorphismus flankieren

Bau von. Reporter Plasmide

Zwei Reporterplasmide, die 160 bp lincRNA-NR_024015
Exonbereich Fragment flankieren die rs8506G oder rs8506A Allel durch die GENEWIZ Firma synthetisiert wurden (Suzhou, China) und dann in die psiCHECK- geklont 2 Basisvektor (Promega, Madison, WI) (Abbildung 1B). Das resultierende Konstrukt mit lincRNA-NR_024015
rs8506 SNP (psiCHECK-2-lincRNA-rs8506G und psiCHECK-2-lincRNA- rs8506A) durch Sequenzierung bestätigt wurde.

transienten Transfektionen und Luciferasetests

Bioinformatik-Analyse ergab, dass die rs8506G > Ein Polymorphismus an der Bindungsstelle von microRNA lokalisieren hat-miR-526b (http://snpinfo.niehs.nih.gov/). Dabei von der Mimik und Inhibitoren hat-miR-526b (Genepharma Co, Shanghai) wurden angewandt, um die Wirkung von has-miR-526b auf psiCHECK-2-lincRNA-rs8506 Reportergene in vitro
zu analysieren. Die 293T oder HGC-27-Zellen in 24-well Platten ausgesät wurden (1 × 10 ^{5 Zellen pro Vertiefung) kultiviert und auf 60-70% Konfluenz vor der Transfektion; Zellen wurden dann mit dem Reporter-Plasmiden transfiziert oben beschrieben unter Verwendung von Lipofectamine 2000 (Invitrogen, CA, USA) wie zuvor beschrieben [25]. In jede Vertiefung, die Co-Transfektion wurde unter Verwendung von 800 ng konstruierte Plasmid-DNA durchgeführt und 0, 1 oder 40 pmol microRNA hat-miR-526b-Mimetika (Shanghai Genepharma Co., Ltd.), und mit oder ohne 40 pmol hat-miR -526b Inhibitors gemäß den Anweisungen des Herstellers. Die Luciferase-Aktivität wurde mit dem Doppel-Luciferase Reporter Assay System (Promega, Madison, WI, USA) unter Verwendung einer TD-20/20 Luminometer (Turner Biosystems, Sunnyvale, CA, USA) gemessen, und die Ergebnisse wurden gegen die Aktivität normalisiert von die Renilla
Luciferase-Gen. Jede Gruppe 6 Wiederholungen enthalten und unabhängige Dreifachversuche durchgeführt wurden.}

Expression Vector Construction

Zur weiteren Untersuchung der Rolle von lincRNA-NR_024015
in der Tumorprogression, die Full- Länge cDNA von lincRNA-NR_024015
rs8506G und rs8506A Allele wurden synthetisiert durch die GENEWIZ Company (Suzhou, China) und dann kloniert in den pcDNA3.1 Vektoren beherbergen. Das resultierende Konstrukt mit lincRNA-NR_024015
rs8506 SNP (pcDNA-lincRNA-rs8506G und pcDNA-lincRNA-rs8506A) durch Sequenzierung bestätigt wurde.

RNA-Isolierung und quantitative RT-PCR-Analyse

Zweiunddreißig NCGC Gewebeproben wurden aus Biopsien von einzelnen Patienten erhalten und bei -80 ° C vor der Analyse gelagert. Gesamt-RNA wurde aus diesen Krebsgewebe mit TRIzol-Reagenz (Molecular Research Center, Inc.) erhalten. cDNA wurde aus mRNA unter Verwendung des Random-Primer und Superscript II (Invitrogen) entsprechend dem Protokoll des Herstellers erzeugt. Quantitative Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) wurde die relative Genexpression zu quantifizieren durchgeführt lincRNA-NR_024015
, eines ABI Prism 7500 Sequenz Nachweissystems (Applied Biosystems) auf der Basis der SYBR-grün Verfahren und GAPDH
als interne Referenz-Gen in jeder Reaktion verwendet wurde.

Zell Sichtbarkeit Assay

in 96-Well-Flachboden-Platten (BD Biosciences, Bedford , MA), 100 &mgr; l HGC-27-Zellen cotransfiziert mit pcDNA-lincRNA-rs8506SNP und hat-miR-526b oder Kontrolle wurden in jede Vertiefung aliquotiert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wurde durch Zellzählung gemessen Kit-8 (CCK-8) (Dojindo Laboratory, Kumamoto, Japan), basierend auf den Anweisungen des Herstellers.

Statistische Analyse

Die Unterschiede in den Verteilungen ausgewählter demographischen Variablen zwischen Fällen und Kontrollen sowie der Allel und Genotyphäufigkeiten wurden durch zweiseitige Chi-Quadrat-Tests ermittelt. Unbedingte logistische Regressionsmodelle wurden verwendet, mit dem Risiko von Magenkrebs durch Odds Ratios die Verbände von Genotypen von SNPs zu schätzen (OR) und ihre 95% Konfidenzintervall (CI), gefolgt von Schichtung Analyse nach Alter, Geschlecht, Rauchen und Trinken Status. Die logistische Regression Modellierung wurde in der Trend-Test verwendet wird, sowie das Potential multiplikativen und additiven Gen-Gen und Gen-Umwelt-Faktoren-Wechselwirkungen zu bewerten. Darüber hinaus wurden die Daten weiter durch Untergruppen der Klinik-pathologischen Variablen geschichtet. Statistische Macht wurde durch die Anwendung der PS-Software berechnet (http://biostat.mc.vanderbilt.edu/twiki/bin/view/Main/PowerSampleSize, abgerufen 14. Dezember 2010). One-way ANOVA-Test verwendet wurde, die Wirkung verschiedener SNPs auf dem lincRNA-NR_024015
Transkriptexpression zu bewerten. Alle Tests wurden zweiseitig von der SAS-Software (Version 9.1; SAS Institute, Cary, NC, USA). A P
. ≪ 0,05 als Kriterium für die statistische Signifikanz wurde verwendet

Ergebnisse

Genotypen und Risiko von Nicht-Cardia Magenkrebs

In der vorliegende Studie, fünf SNPs wurden zwischen Fällen und Kontrollen genotypisiert. Wie in Tabelle 2 gezeigt, wurde für rs8506G >eine signifikante Assoziation mit NCGC Risiko beobachtet; A. Insbesondere zeigten die Ergebnisse der Genotypisierung, dass im Vergleich mit dem rs8506GG oder AG-Genotyp, lincRNA-NR_024015
rs8506AA Träger signifikant mit dem Risiko einer nicht-Cardia Magenkrebs (adjustierte Odds Ratio [OR] = 1,56, 95% verbunden war CI = 1,03-2,39). Darüber hinaus wurden keine signifikanten Unterschiede in den anderen vier SNPs sucht ( P
> 0,05). So konnten wir diese genetische Variante rs8506G >schließen;. Ein Polymorphismus in lincRNA-NR_024015
bei der Vermittlung das Risiko von NCGC eine wesentlich Rolle spielt

Stratifizierung Analyse von Rs8506G > A Genotypen und Risiko von NCGC

Wir führten weiterhin eine Schichtung Analyse der Assoziationen zwischen Variante Genotypen und das Risiko von NCGC durch Untergruppen von klinisch-pathologischen Eigenschaften von NCGC in dieser Studie. Wie in Tabelle 3 dargestellt ist, wurde bei Patienten mit dem Rauchen ein signifikanter Zusammenhang zwischen der Variante Genotypen und das Risiko von NCGC beobachtet (bereinigt OR = 2,48, 95% CI = 1,63-3,78, Homogenitätstest P
= 0,001) , was darauf hindeutet, dass das Rauchen moduliert die Assoziation zwischen der lincRNA-NR_024015
rs8506G > eine Variante Genotypen und das Risiko von NCGC. Kein signifikanter Zusammenhang wurde in anderen Untergruppen gefunden.

Cellular Charakterisierung von LincRNA-NR_024015

Die Niveaus der nuklearen Kontrolle Transkript ( U6
), cytoplasmatische Steuer Transkript ( GAPDH
mRNA) und lincRNA-NR_024015
in der Kern- und Cytoplasma-Fraktionen von HGC-27-Zellen mittels RT-qPCR bewertet wurden, beziehungsweise. Die Ergebnisse zeigten, dass GAPDH
mRNA ausschließlich in der zytoplasmatischen Fraktion nachgewiesen wurde, während Kern-beibehalten U6
überwiegend in der Kernfraktion gefunden wurde. Und lincRNA-NR_024015
Ausdruck war vorwiegend zytoplasmatische (Abbildung 1B)

In-silico
Analyse der Wirkung von Rs8506G >. A in LincRNA-NR_024015
Folding

mit RNAfold und SNPfold Algorithmen in in-silico
Analyse, wir vorhergesagt lokale strukturelle Veränderungen von lincRNA-NR_024015 und Videos der rs8506G >verursacht, ein Polymorphismus befindet sich innerhalb die exonische Bereich von lincRNA-NR_024015
. Wie in 1C und D gezeigt, legten die Ergebnisse nahe, dass die G bis A Basenänderung von rs8506G > A direkt die Faltung von lincRNA-NR_024015
beeinflusst, welche die Bindungsstelle für die microRNA beeinflussen können. Dies kann dann Einfluss auf die lincRNA-NR_024015
Genexpression

Rs8506G > a. Die Genotypen beeinflussen die LincRNA-NR_024015
Expression durch die Bindung von Brechender Hat-miR-526b in-vitro-

Zwei Luziferasereportergen Konstrukte enthielten rs8506G oder A-Allel durch transiente Cotransfektion mit mimischen getestet wurden und Inhibitor der hat-miR-526b, die auf rs8506G >sagt wurden Bindung, eine polymorphe Stelle durch bioinformatische Analyse. Das Ergebnis der Luciferase-Aktivität zeigte, dass die HEG-27-Zellen, die transient cotransfiziert hat-miR-526b-Mimetika und konstruieren die rs8506G Allel signifikant reduziert Luciferase-Aktivität gezeigt, die in einem konzentrationsabhängig, und der HAS-miR-526b-Inhibitoren erheblich umgekehrt und nach oben reguliert ihre Aktivitäten. Es wurde jedoch keine offensichtlichen Wandel für Reporter-Gen mit einem Allel mit hat-miR-526b-Mimetika oder Inhibitoren ( P
> 0,05) behandelten Patienten beobachtet (2A). Die gleichen Ergebnisse wurden auch beobachtet, wenn diese Versuche wiederholt wurden 293T-Zellen (2B) mit

Association of Rs8506G >. A Genotypen mit LincRNA-NR_024015
Expression

Wir gesammelt 32 Tumorgewebe von den unbehandelten NCGC Patienten mit verschiedenen Genotypen und durchgeführt real-time PCR die Auswirkungen von lincRNA-NR_024015
rs8506G >zu bewerten; A auf lincRNA-NR_024015
Ausdruck. Das Ergebnis zeigte, dass Patienten mit den rs8506AG und rs8506AA Genotypen ausgedrückt deutlich höher lincRNA-NR_024015
mRNA-Spiegel (Mittelwert ± SEM) im Vergleich zu Trägern des rs8506GG Genotyp (AG: 0,029 ± 0,005; AA: 0,040 ± 0,005; GG: 0,019 ± 0,004; P
= 0,023), wie in den 2C gezeigt

Die Wirkung von miRNA-abhängige Regulation von LincRNA-NR_024015
Expression auf die Zellproliferation.

Wir untersuchten weiter, ob die lincRNA-NR_024015
rs8506G > A Genotypen haben Auswirkungen auf die Zellproliferation in vitro
. Wie in 2D gezeigt, lincRNA-NR_024015
Ausdruck sank nach 24 h Transfektion in Zellen, die transient cotransfiziert mit pcDNA-lincRNA-rs8506G und hat-miR-526b im Vergleich mit denen cotransfiziert mit pcDNA-lincRNA- rs8506A und hat-miR-526b ( P
< 0,001). Die Zellen mit einer verminderten Expression von lincRNA-NR_024015
eine schwache Zellwachstumsrate mit Zellen im Vergleich hatten transfiziert mit pcDNA-lincRNA-rs8506A und hat-miR-526b von Tag 2 ( P
= 0,004 ) (Abbildung 2E)

dicussion

In der vorliegenden Krankenhaus-Fall-Kontroll-Studie mit insgesamt 438 Patienten und 727 gesunden Kontrollen, unsere Gruppe die rs8506G gefunden >enthält;. A ist im Zusammenhang mit Risiken von NCGC. Unsere Daten zeigten, dass Probanden, die rs8506AG und rs8506AA Genotypen hatten ein signifikant erhöhtes Risiko für NCGC im Vergleich mit dem GG-Genotyp tragen ( P
< 0,05). Zusätzlich zeigte sich, dass ein hohes Risiko Wirkung dieses Polymorphismus ausgeprägter in Rauchern war. Unseres Wissens ist dies die erste Studie umfassend die Assoziation zwischen den Varianten in exonische von lincRNA und das Risiko von NCGC bewerten.

Als eine andere Klasse von regulatorischen nicht-kodierenden RNAs haben lincRNAs, die vor kurzem an die Spitze der nichtkodierende bewegt RNA-Studie. Diese mRNA-ähnliche Moleküle, fehlt eine erhebliche offene Leserahmen, werden im Allgemeinen mit einer Kappe bedeckt, gespleißt und polyadenyliert sind in einer Vielzahl von zellulären Prozessen, wie beispielsweise Kernarchitektur, die Regulierung der Genexpression, der Immunüberwachung oder embryonale Stammzelle Pluripotenz in Verbindung gebracht. Eine Handvoll Studien haben gezeigt lincRNAs als neuer Aspekt der Biologie in einer Vielzahl von Krankheitszuständen taucht, und Veränderungen in der Expression von lincRNAs kann an Transkriptions, post-transkriptionale und epigenetische Ebenen [18], [30], um Krebsbiologie beitragen - [32]. Ein prominentes lincRNA, ANRIL
hatte funktionell bei Tumorprogression in Zusammenhang gebracht, in der Regel epigenetische Genexpression Unterdrückung durch die Bindung an und die Rekrutierung Chromatin modifizierenden Komplexe [33], [34]. Ein anderes bekanntes Beispiel ist die lincRNA, GAS5
; [37] - genetische Aberrationen bei dieser lincRNA Locus sind in vielen Arten von Tumoren, einschließlich Melanom, Brust- und Prostatakrebs [35] zu finden. Diese Beweislinien unterstützt die Bedeutung der lincRNAs in der Zellbiologie und der Onkogenese. Kürzlich wurden zwei Gwäss haben eine Teilmenge von NCGC Suszeptibilitätsloci berichtet (5p13.1, 3q13.31, 8q24.3, 6p21.1 und 7p15.3), die mit der Entwicklung von NCGC verbunden. Bioinformatik-Analyse ergab mehrere lincRNAs auf diese Loci geschlossen. Ferner ist bei den exonische Regionen lincRNAs gelegen mehrere relevante Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs), die mit NCGC assoziieren können, wurden identifiziert. Wie wir alle, in den letzten zehn Jahren mit der Verfügbarkeit von großen RNA-Sequenzierung bekannt, ist es nun immer bemerkenswert klar, dass Tausende von krankheitsbedingten genetischen Varianten außerhalb von Genen gewohnt oder sogar in nicht-kodierenden Transkripte wurden bereits erzielt worden durch Genomprojekt bei Säugetieren [24]. Jüngste Schwellen Beweise haben die Assoziation zwischen SNPs wohnhaft in lincRNAs und Krebserkrankungen des Menschen angegeben. Beispielsweise auf der Grundlage der 1000 Genomes Daten, Guangfu Jin und colleages haben festgestellt, dass die Regionen von lncRNA eine SNPs Dichte ähnlich der Protein-codierenden Regionen an und weiter der Phänotyp bezogenen SNPs durch GWAS bei lncRNA Region berichtet kommentierten kann Prostata Risiko [beitragen ,,,0],38]. Eine kürzlich durchgeführte Studie berichtete auch, dass ein genetischer Polymorphismus in lincRNA-uc003opf.1
Gen mit einem erhöhten Risiko der Entwicklung von Plattenepithelkarzinomen des Ösophagus in der chinesischen Bevölkerung verbunden ist [39]. Zusammengefasst unsere vorliegende Studie steht im Einklang mit früheren Ergebnissen zeigten, dass lincRNA-NR_024015
im Zytoplasma mäßig häufiger als im Kern der fraktionierten Magenkrebszellen, was darauf hindeutet, dass die Funktion dieses lincRNAs im Zytoplasma ausgeübt wird . Unsere Ergebnisse liefern einen starken Beweis, eine Hypothese für Cytoplasma-Regelung, bei der die lincRNA-NR_024015
rs8506G >unterstützen;. Ein SNP die Expression dieses lincRNA durch Modifizieren der Bindungsstelle für die has-miR-526b beeinflussen können

in der vorliegenden Studie, unser Ergebnis der Assoziation zwischen einem genetischen Polymorphismus in den exonische Regionen eines lincRNA und die Anfälligkeit für NCGC wurde zunächst in der chinesischen Bevölkerung erhalten. Die relativ großen Probengrößen verwendet verringert die Größe der ORs, die statistisch erfasst werden kann. Darüber hinaus haben wir eine Studie Leistung von über 90% (zweiseitiger Test, α = 0,05) in Detektieren eines OR von 1,28 für die rs8506AG + AA-Genotypen (vorkommendes bei einer Frequenz von 42,5% bei den Kontrollen) erreicht haben, im Vergleich zu die rs8506GG Genotyp. Bemerkenswerterweise ist die Assoziation biologisch plausibel und steht im Einklang mit den Ergebnissen unserer funktionelle Studien.

Im Ergebnis der vorliegenden Studie die ersten Beweise dafür, dass genetische Polymorphismen in den exonische Regionen lincRNAs spielen eine entscheidende Rolle bei der Vermittlung einzelner Anfälligkeit für NCGC. Unsere Ergebnisse stützen ferner die Hypothese, dass genetische Varianten in lincRNA exonische Regionen mikroRNA-vermittelte Regulierung und im Zusammenhang mit dem Risiko einer GC beeinflussen können. Unsere Ergebnisse rechtfertigen die Validierung in größeren, vorzugsweise populationsbasierte Fall-Kontroll-Studien, sowie durch gut gestaltete mechanistische Studien.

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