Extracto
Antecedentes
El receptor para productos finales de glicación avanzada (RAGE) es una oncogénico multidisciplinar receptor de trans-membranosa, que se sobreexpresa en varios cánceres humanos. Recientemente, se ha demostrado que RAGE también participa en la carcinogénesis y la invasión tumoral. En este estudio, hemos investigado los niveles de expresión y valor pronóstico de RAGE en los cánceres gástricos primarios (GC).
Hemos investigado la expresión de RAGE en GC primaria y vinculado tejido gástrico normal real tiempo de RT-PCR cuantitativa (n = 30) y análisis de transferencia Western (n = 30). Adicionalmente, se realizó inmunohistoquímica en 180 muestras de GC incluidos en parafina, 69 especímenes normales emparejados.
RAGE se sobreexpresa en GC en comparación con los tejidos no cancerosos adyacentes ( P La sobreexpresión RAGE puede ser un útil marcador para predecir la progresión de la GC y el mal pronóstico Visto:. Wang D, Li T, G YE, Shen Z, Hu y, Mou T, et al. (2015) La sobreexpresión del receptor para productos finales de glucación avanzada (RAGE) se asocia con un mal pronóstico en cáncer gástrico. PLoS ONE 10 (4): e0122697. doi: 10.1371 /journal.pone.0122697 Editor Académico: Valli De Re, Instituto Nacional del Cáncer IRCCS, ITALIA Recibido: 22 Noviembre 2014; Aceptado: 13 Febrero 2015; Publicado: 10 Abril 2015 Derechos de Autor © 2015 Wang et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan Disponibilidad de datos: Todos los datos relevantes están dentro del papel Financiación:. Este trabajo fue apoyado por el Programa Nacional de la Especialidad de Medicina clínica clave, el Fondo de Investigación del bienestar del público en la Industria de la Salud (No.201402015), el programa principal de Ciencia y Tecnología programa de Guangzhou (No.201300000087), y The National Key Technology R & D programa (No.2013BAI05B00). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia Introducción el receptor para productos finales de glicación avanzada (RAGE), una molécula de superficie celular expresada en una amplia gama de tipos de células, es un miembro de multiligando de la superfamilia de inmunoglobulinas [1]. RAGE se ha implicado en un amplio espectro de respuestas patológicas, incluyendo la inflamación y el cáncer, sobre la base de la variedad de sus ligandos [2]. Como un receptor de trans-membranosa oncogénico recién reconocido, se ha demostrado estar implicado en múltiples cánceres humanos que estimulan el crecimiento, la supervivencia y la propagación metastásica [3]. Varios estudios han demostrado que RAGE está regulada positivamente y pierde su característico patrón granular en tumores primarios [4]. La interacción AGE-RAGE juega un papel crucial en el desarrollo del cáncer de próstata, y la inhibición de esta interacción tiene potencial como una nueva diana molecular para la prevención o la terapia del cáncer [5]. Co-expresión de rabia y de alta movilidad de proteína grupo B1 (HMGB1) se ha asociado sustancialmente con la invasión del cáncer colorrectal y metástasis [4,6,7]. Además, la expresión de RAGE se correlaciona con la metástasis y la angiogénesis tumoral en el carcinoma oral de células escamosas (COCE) y puede ser un factor pronóstico independiente de recidiva y el pronóstico en pacientes CCCA [8,9]. Por otra parte, el polimorfismo genético del gen RAGE puede ser un biomarcador predictivo utilizado para la detección de los pacientes sensibles a la termoterapia y para evaluar el pronóstico del cáncer de pulmón de células no pequeñas (NSCLC) de los pacientes [10]. Sin embargo, el papel de RAGE en el cáncer gástrico (CG) ha sido difícil de alcanzar. RAGE ha sido previamente indicado estrechamente asociada con la invasión y metástasis en el cáncer gástrico [11]. Por otra parte, se informó de que el bloqueo de la señalización de RAGE suprime el crecimiento y la metástasis de células de cáncer gástrico [12]. En una investigación sobre el papel de RAGE en la patogénesis de GC y la progresión y los efectos de sus polimorfismos de genes en la función del receptor, Gu y colegas [13] han demostrado que RAGE Gly 82Ser polimorfismo puede estar asociada con un mayor riesgo de iniciación o progresión de carcinoma gástrico. Sin embargo, hasta donde sabemos, la relación entre la expresión de RAGE y el pronóstico del paciente GC es desconocido. En este estudio, se analizó el nivel de expresión de RAGE en GC utilizando cuantitativa en tiempo real RT-PCR (QRT-PCR), transferencia de Western e inmunohistoquímica (IHC). Hemos identificado una relación entre la expresión de RAGE y las características clinicopatológicas de GC, y luego evaluaron el valor pronóstico de la expresión de RAGE para la supervivencia postoperatoria de pacientes con cáncer gástrico. Declaración de Ética Este estudio fue aprobado por el Comité ético del hospital Nanfang y el consentimiento informado escrito fue obtenido por todos estos pacientes involucrados. pacientes y muestras de tejido Treinta emparejados fresco congelado gástrica canceroso y el tejido no canceroso correspondiente mucosa (extirparon > 10 cm de distancia del borde de los GC) se recogieron muestras de pacientes con cáncer gástrico en los 30 minutos después de la resección y se almacenan inmediatamente en nitrógeno líquido hasta su uso. Otro 180 embebidos en parafina de tejido bloques GC y 69 muestras de control de los tejidos gástricos normales emparejados tomados del margen de resección distal se obtuvieron de los archivos almacenados del Departamento de Cirugía General, Hospital Nangfang, Universidad Médica del Sur, se recogieron quirúrgicamente entre enero de 2007 y diciembre 2008. Los 180 pacientes incluidos 120 hombres y 60 mujeres con edades 22-78 años (media, 55,62 años). Ninguno de estos pacientes fueron tratados con radioterapia o quimioterapia antes de la cirugía. El tipo histológico y el estadio de los especímenes resecados se determinaron de acuerdo con los criterios de la clasificación de la Organización Mundial de la Salud y el Comité Conjunto sobre el Cáncer (AJCC) Cancer Staging Manual (la 7ª edición de 2010). Entre ellos, 125 pacientes en estadio I-III recibieron resección radical (19, 25 y 81 para las etapas I, II y III, respectivamente), y 55 pacientes recibieron Etapa IV-cirugía y /o quimioterapia paliativa. Los órganos distantes metástasis afectados en pacientes Etapa-IV incluyen el peritoneo, los ganglios linfáticos distantes, hígado, colon transverso, ovario o oviducto, páncreas, intestino, hueso, pulmón, cerebro y la vena cava inferior. Los pacientes fueron seguidos hasta la muerte o la última fecha de seguimiento (30 de diciembre de 2013). El tiempo medio de seguimiento fue de 48 meses (de 2 a 82 meses). ARN total fue extraído a partir de tejidos picados con el TRIzol reactivo (Takara, Japón) y transcripción inversa en ADNc de primera cadena con el TaqMan transcripción reversa Kit (Takara, Japón). A continuación, se utilizaron 0,5 a 1-l alícuotas del ADNc como moldes para amplificar el fragmento de RAGE (adelante: 5- AAACATCACAGCCCGGATTG-3; inversa: 5- TCCGGCCTGTGTTCAGTTTCT-3) en las siguientes condiciones: 95 ° C durante 30 s; 40 ciclos de 95 ° C durante 5 s; 60 ° C durante 30 s; y punto de fusión de 95 ° C durante 5 segundos, seguido de 60 ° C durante 1 min, y enfriamiento a 50 ° C durante 30 seg. PCR y la recogida de datos se realizó en el Sistema LightCycler480 (Roche, Suiza) con 2 × SYBR Green kit de mezcla maestra (Invitrogen, Carlsbad, California, EE.UU.). expresión RAGE se normalizó a la de GAPDH. análisis de transferencia de Western Western Blot se realizó de acuerdo con métodos estándar como se describe anteriormente [14]. Brevemente, los tejidos se molieron y se lisaron con tampón de lisis RIPA y los lisados se recogieron por centrifugación (12.000 rpm) a 4 ° C durante 30 min. Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando el ácido bicinconínico kit de ensayo de proteínas (Pierce, Rockford, IL, EE.UU.). Aproximadamente el 50? G muestras se separan luego por electroforesis en un 10% de dodecil sulfato de sodio (SDS) geles poliacrilamida y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno. Después de bloquear los sitios de unión no específicos, la membrana se incubó con un anticuerpo anti-RAGE policlonal de conejo (Santa Cruz, CA, EE.UU.) a una dilución 1: 1000 a 4 ° C durante la noche. Después de tres lavados con TBST (solución salina tris-tamponada con Tween-20) durante 10 minutos, las membranas se incubaron con un anticuerpo secundario a una dilución de 1: 3000 a temperatura ambiente durante 60 min. Las proteínas se detectaron con un sistema de quimioluminiscencia (Amersham Pharmacia Biotechnology, Piscataway, NJ, EE.UU.), y se normalizaron a beta-actina detectados utilizando un anticuerpo β-actina anti-humano de ratón (1: 1000 dilución; Sigma, St. Louis, MO , EE.UU.). ensayo inmunohistoquímico El IHC ensayo se realizó como se ha descrito previamente [12,14]. Brevemente, los portaobjetos se desparafinaron con dimetilbenceno y rehidratada a través de un gradiente de etanol (100%, 95%, 90%, 80% y 70% de etanol) en el agua. Después de lavar con PBS (solución salina tamponada con fosfato) durante tres veces, los portaobjetos se hirvieron en tampón de recuperación de antígeno, citrato ácido clorhídrico 0,01 M de sodio (pH = 6,0), durante 30 min en un horno microondas. Después de la actividad peroxidasa endógena se inactivó con 3% de H 2O 2, después de tres lavados con PBS, anticuerpo unión no específica fue bloqueada por incubación de los portaobjetos con suero no inmune normal de cabra al 10%. Las secciones se incubaron a continuación a 4 ° C durante la noche con el anticuerpo policlonal de conejo RAGE (Santa Cruz, CA, EE.UU.) a una dilución 1: 400 y, posteriormente, se incubaron con peroxidasa de rábano (HRP) (kit de detección EnvisionTM DAKO ChemMateTM) a temperatura ambiente por 30 min. Después de lavar en PBS, las secciones a continuación, se desarrollaron utilizando 3,3-V-diaminobencidina (Sigma), se lavaron en agua corriente del grifo, y la ligera de contraste con hematoxilina antes de la deshidratación y cubreobjetos de montaje. experimentos de control negativo se llevaron a cabo mediante la sustitución del anticuerpo primario con PBS. La inmunotinción fue analizada por dos observadores independientes (Y.X. y L.Z.) que fueron cegados a los resultados de los pacientes y otros parámetros clínico. El sistema de detección de RAGE se ha descrito anteriormente [12]. Todas las muestras se clasifican por el grado de inmunorreactividad: 0, < 5%; 1, 5% -10%; 2, 10% -50%; 3, 50% -75%; 4, > 75%. intensidad de la tinción se puntuó como 0, negativo; 1, débil; 2, moderado; 3, fuerte. Para cada caso, la puntuación total inmunotinción también conocido como el índice de tinción (SI), se calculó multiplicando el porcentaje de células positivas con el marcador intensidad de la tinción, obteniéndose un valor entre 0 y 12. Para este estudio, un valor de corte óptimo era identificado de la siguiente manera: SI < 8 se utilizan para indicar la expresión de RAGE baja y alta expresión de RAGE SI≥8 el análisis estadístico el análisis estadístico se realizó mediante el paquete estadístico SPSS (SPSS versión 19.0.; SPSS, Chicago, IL, EE.UU.). Se utilizó una para muestras relacionadas t-test para comparar los ARNm de RAGE y los niveles de proteína en las muestras de tejidos cancerosos y cancerosos adyacentes. La prueba de Mann-Whitney o la prueba de chi-cuadrado de Pearson se utilizó para comparar las puntuaciones del SI obtenidos por el análisis inmunohistoquímico de la GC y el tejido de la mucosa normal correspondiente. La relación entre la expresión de RAGE y las características clínico-patológicas se analizaron mediante la prueba de Chi-cuadrado de Pearson. Las curvas de supervivencia se calcularon de acuerdo con el método de Kaplan-Meier y se analizaron utilizando la prueba de log-rank. El modelo de riesgos proporcionales de regresión de Cox se utilizó para el análisis univariante y multivariante para evaluar la razón de riesgo (HR) e identificar los factores que predicen la supervivencia. Una de dos caras p-valor. ≪ 0,05 se consideró estadísticamente significativa Resultados La sobreexpresión de RAGE en GC humana Para dilucidar el papel de RAGE en el desarrollo y GC progresión, primero analiza su expresión en muestras de GC y combinarse tejidos cancerosos adyacentes en el ARNm. Cuantitativa en tiempo real el análisis RT-PCR mostró que RAGE se sobreexpresa en la mayoría de los tejidos de GC en comparación con sus homólogos normales (19/30; 63,3%) (Fig 1). RAGE se upregulated de manera similar a nivel de proteínas en GC, como se muestra mediante transferencia Western y ensayos de IHC. nivel de expresión RAGE elevada fue encontrado por el análisis de transferencia de Western en 26 de 30 (86,7%) GCs en comparación con los tejidos normales (Fig 2). Se evaluaron los bloques incluidos en parafina (n = 249) a partir de 180 pacientes de GC para la expresión de proteína RAGE por IHC (Tabla 1). tinción ausente o baja (SI < 8) de la mucosa gástrica normal se observó en 55 de 69 casos (79,7%), mientras que se observó alta tinción (SI≥8) en la mayoría de los tejidos GC (111/180; 61,7%). expresión RAGE fue significativamente mayor en los tejidos GC (n = 180; SI = 6,22) en comparación con los tejidos gástricos normales (n = 69; SI = 2,09; P Asociación de expresión de RAGE con características clinicopatológicas Sobre la base de las categorías que hemos definido en el la sección Métodos, los datos mostraron que la alta expresión de RAGE se correlacionó significativamente con el grado histológico ( P Correlación entre la expresión de RAGE basado en IHC y la supervivencia del paciente La curva de Kaplan-Meier mostró que los pacientes en el grupo de alto RAGE tuvieron una supervivencia global significativamente peor que los pacientes de bajo RAGE grupo ( P Hotel < 0,001; figura 4A). Los pacientes con alta expresión de RAGE también tuvieron una supervivencia global significativamente peor que aquellos con baja expresión de RAGE en la etapa AJCC III /IV subgrupo (n = 136; P Hotel < 0,001; figura 4C), pero no en la etapa AJCC I /II subgrupo (n = 44; P = 0,695 los análisis univariados y multivariados el análisis univariante mostró una relación significativa entre el conjunto la supervivencia y la edad, la invasión tumoral, estado ganglionar, el estado de la metástasis, la etapa AJCC y la expresión de RAGE (véase la Tabla 3). Todos estos factores se incluyen en un modelo de riesgos proporcionales de Cox multivariado para los efectos de las covariables. Sobre la base de este modelo, los niveles de expresión de RAGE (razón de riesgo (HR) = 2.143; intervalo de confianza del 95% (IC del 95%) = 1,357 a 3,383; P Discusión GC sigue siendo una de las neoplasias humanas más mortales. , especialmente en Asia oriental. A pesar de avances en el diagnóstico y la terapia, el pronóstico para el cáncer gástrico es todavía triste y depende de una serie de características de carcinoma, tales como el crecimiento tumoral, la diferenciación, invasión y metástasis a distancia [15]. GC tumorigénesis y progresión son poco conocidos, complejos procesos de varios pasos, reguladas por señales celulares intrínsecas y extrínsecas que involucran a múltiples alteraciones de genes y proteínas. Es de vital importancia para identificar y comprender los mecanismos moleculares que subyacen a la iniciación y progresión del tumor para desarrollar enfoques racionales y específicos de cáncer para el diagnóstico precoz y el tratamiento de GC. En este estudio, se investigó el estado de la expresión de RAGE en GC tanto en el mRNA y los niveles de proteína y encontró que RAGE se reguló notablemente en los tejidos humanos GC en comparación con el epitelio gástrico normal. Se realizó un análisis de IHC para validar aún más esta regulación al alza de la expresión de RAGE en GC primaria. Hemos observado que un alto nivel de expresión de RAGE se asoció significativamente con el grado histológico, estado ganglionar, el estado de la metástasis, y la etapa AJCC en GC, similar a los resultados anteriores en COCE y NSCLC [9,10]. Tomados en conjunto, estos resultados sugieren que la rabia puede estar implicada en la progresión de la GC. También se determinó por primera vez que la expresión de RAGE es un fuerte predictor de mal pronóstico para los pacientes con cáncer gástrico, similar a los hallazgos en el cáncer colorrectal, hepatocelular cáncer, CCCA y NSCLC [9,10,16,17]. Sin embargo, el impacto pronóstico de la expresión de RAGE parece diferir en función del estadio del cáncer (figura 4). En el presente estudio, el análisis de supervivencia sugiere que la invasión tumoral y la expresión de RAGE predecían de forma independiente la supervivencia global pobres. Las muestras relativamente pequeñas de la etapa I y el grupo II podrían ser responsables de la diferencia. La mayoría de los pacientes con GC en China se diagnostican en estadios avanzados en los debido a la falta de detección precoz eficiente. Además, la expresión de RAGE tiene un CI más estrecho 95% y parece ser aa mejor predictor de GC en comparación con la invasión tumoral en este estudio. RAGE es un receptor de reconocimiento de patrones que se une múltiples ligandos derivados de un entorno de célula dañada, y desempeña un papel crítico en la promoción de la génesis tumoral gastrointestinal [18]. También como un mediador inflamatorio importante, RAGE podría modular la diafonía entre las vías de supervivencia y la autofagia en las células tumorales y promover la supervivencia del tumor a través de sostener la autofagia y la limitación de la apoptosis [19]. Ku et al Hasta la fecha, el valor de la orientación RAGE para una posible intervención temprana y la profilaxis en GC sigue sin estar clara. Sin embargo, varios estudios han puesto de manifiesto el papel de RAGE en otros tipos de cáncer y han demostrado que el bloqueo de RAGE disminución del crecimiento y metástasis de los tumores y los tumores implantados en desarrollo de forma espontánea en ratones susceptibles. La inhibición de RAGE disminución de la proliferación en células de cáncer de mama y de la apoptosis celular inducida e inhibió el crecimiento del cáncer de próstata [20,21]. Disfunción RAGE también inhibe la angiogénesis y la progresión del cáncer colorrectal, y prolongó la supervivencia en cáncer de páncreas [22-24]. El bloqueo de RAGE con RAGE soluble (sRAGE) atenúa la lesión hepática, lo que mejora la supervivencia, la protección contra la necrosis hepatocelular, y la mejora de la expresión del factor de necrosis tumoral-a citoquinas proregenerative [25]. Por otra parte, Moy et al. [26] encontró una asociación inversa estadísticamente significativa en el límite entre la exposición sRAGE continua y el riesgo de cáncer de hígado, lo que sugiere que sRAGE puede proteger contra los efectos inflamatorios causados por la activación RAGE. Estos hallazgos indican consistentemente que RAGE también podría actuar como una posible diana terapéutica en el GC. Dadas sus características biológicas, RAGE y sus derivados han sido considerados como un nuevo indicador de potencial maligno incluyendo GC. El RAGE Gly 82Ser polimorfismo se ha demostrado que se asocia con un mayor riesgo para el desarrollo o la progresión de GC en un estudio de casos y controles de base hospitalaria [13]. En el presente estudio, se encontró que la regulación positiva de la expresión de RAGE se asoció significativamente con pobres características clínico-patológicos y pobre supervivencia global, lo que sugiere que puede contribuir al potencial maligno de GC. Por lo tanto, RAGE podría, por tanto, servir como una novela valiosa biomarcador para predecir el pronóstico y una posible diana terapéutica para los pacientes con GC. Sin embargo, otros estudios para aclarar los mecanismos subyacentes de la sobreexpresión de RAGE, contribuyendo así a una mejor comprensión y desarrollar aún más su uso potencial. Agradecemos al Dr. Yan Xiao y el Dr. Liang Zhao del Departamento de Patología para el diagnóstico patológico y la confirmación de los resultados de IHC.
<0,001), y la más alta expresión de RAGE correlacionaron significativamente con el grado histológico ( P
= 0,002), el estado ganglionar ( P
= 0,025), el estado de metástasis ( P
= 0,002), y el American Joint Committee on etapa del cáncer ( P
= 0,020). Por otra parte, la regulación positiva de la expresión de RAGE es un factor pronóstico independiente en el análisis multivariante mediante regresión de Cox ( P
= 0,001).
Conclusiones
Materiales y Métodos
Total de la extracción de RNA y en tiempo real RT-PCR cuantitativa
< 0,001). Los ejemplos representativos de débiles, moderadas y fuertes de tinción (micrografías con 200 × ampliación) se muestran en la Figura 3.
= 0,002), el estado ganglionar (estadio N, P
= 0,025), el estado de la metástasis (fase M, P
= 0,002) y la etapa AJCC ( P
= 0,020), pero no fue con el género, la edad, el tamaño del tumor, localización del tumor, clasificación de Lauren o invasión tumoral (tabla 2).
; la figura 4B).
= 0,001) y la invasión tumoral (HR = 11,209; 95 % CI = 1,297 a 96,874; P = 0,028
) fueron confirmados como factores pronósticos independientes (Tabla 3) guía
. [11] han informado de que, RAGE expresión está estrechamente asociada con la invasión y la metástasis en pacientes con cáncer gástrico, lo que nos proporciona una base experimental para el estudio funcional de RAGE en el cáncer gástrico. Posteriormente, Xu et al [12] demostraron que la caída de la proliferación celular GC RAGE reducida y la invasión del cáncer gástrico, disminución de la expresión de AKT, PCNA y MMP-2, y la apoptosis celular inducida y la detención del ciclo. Por lo tanto, la inhibición específica de RAGE o sus ligandos pueden servir como nuevos objetivos para mejorar las terapias actuales contra el cáncer.
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