PLOS ONE: Överuttryck av receptorn för avancerade glykation slutprodukter (RÅGE) är associerad med dålig prognos i Gastric Cancer

Abstrakt

Bakgrund

receptorn för avancerade glykation slutprodukter (RÅGE) är en onkogen tvärvetenskapligt transmembranreceptor, som överuttrycks i flera humana cancrar. Nyligen har det visats att RÅGE är också involverad i cancer och tumörinvasion. I denna studie undersökte vi de uttrycksnivåer och prognostiska värde av RÅGE i primära gastric cancer (GC).

Metoder

Vi undersökte RAGE uttryck i primär GC och parade normal gastrisk vävnad genom real- kvantitativ RT-PCR (n = 30) och Western blotting-analys (n = 30). Dessutom genomförde vi immunohistokemi på 180 paraffininbäddade GC prover, 69 matchade normala prover.

Resultat

RAGE överuttrycktes i GC jämfört med de intilliggande noncancerous vävnader ( P
<0,001), och högre RAGE uttryck signifikant korrelerad med den histologiska grad ( P
= 0,002), nodal status ( P
= 0,025), metastaser status ( P
= 0,002), och amerikanska kommittén för cancer scenen ( P
= 0,020). Vidare är uppreglering av RÅGE uttryck en oberoende prognostisk faktor för multivariat analys med användning av Cox regressionsmodell ( P
= 0,001).

Slutsatser

RAGE Överuttryck kan vara en användbar markör för att förutsäga GC progression och dålig prognos

Citation. Wang D, Li T, Ye G, Shen Z, Hu Y, Mou T, et al. (2015) överuttryck av receptor för avancerade glykation slutprodukter (RÅGE) är associerad med dålig prognos i magcancer. PLoS ONE 10 (4): e0122697. doi: 10.1371 /journal.pone.0122697

Academic Redaktör: Valli De Re, IRCCS National Cancer Institute, ITALIEN

Mottagna: 22 november 2014. Accepteras: 13 februari 2015, Publicerad: 10 april 2015

Copyright: © 2015 Wang et al. Detta är en öppen tillgång artikel distribueras enligt villkoren i Creative Commons Attribution License, som tillåter obegränsad användning, distribution och reproduktion i alla medier, förutsatt den ursprungliga författaren och källan kredit

datatillgänglighet: Alla relevanta uppgifter är inom pappers-

Finansiering:. Detta arbete stöddes av programmet för Nationalnyckeln klinisk medicinsk specialitet, forskningsfonden för offentlig välfärd i Hälsa industri (No.201402015), den omfattande program för vetenskap och teknik program för Guangzhou (No.201300000087), och The National Key Technology R &D-programmet (No.2013BAI05B00). Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet

Konkurrerande intressen:.. Författarna har förklarat att inga konkurrerande intressen finns

Introduktion

receptorn för avancerade glykation slutprodukter (RAGE), en cellytemolekyl uttrycks i ett intervall av celltyper, är en multiligand medlem av immunglobulin-superfamiljen [1]. RÅGE har implicerats i ett brett spektrum av patologiska svar, inklusive inflammation och cancer, baserat på den variation av dess ligander [2]. Som en nyligen erkänt onkogen transmembranreceptor, har det visat sig vara inblandade i flera humana cancrar stimulera tillväxt, överlevnad, och metastasering [3]. Flera studier har visat att RÅGE uppregleras och förlorar sin karakteristiska granulära mönster i primära tumörer [4]. AGE-RAGE interaktion spelar en avgörande roll i utvecklingen av prostatacancer, och hämma denna interaktion har potential som en ny målmolekyl för förebyggande eller terapi av cancer [5]. Co-uttryck av RAGE och hög rörlighet grupp protein B1 (HMGB1) har i huvudsak i samband med kolorektal cancer invasion och metastaser [4,6,7]. Dessutom korrelerar RAGE uttryck med angiogenes och tumörmetastaser i oral skivepitelcancer (OSCC) och kan vara en oberoende prognostisk faktor för återfall och prognos i OSCC patienter [8,9]. Dessutom kan genetisk polymorfism av RAGE-genen vara en prediktiv biomarkör som används för att screena för patienter känsliga för termo och utvärdera prognosen av icke-småcellig lungcancer (NSCLC) patienter [10].

Men rollen RAGE i magcancer (GC) har förblivit svårfångade. RAGE har tidigare antytts nära förknippad med invasion och metastaser i magcancer [11]. Dessutom rapporterades det att blockad av RAGE signalering dämpade tillväxten och metastaser av gastric cancerceller [12]. I en undersökning av rollerna för RÅGE i GC patogenes och progression och effekterna av dess gen polymorphisms på receptorfunktion, Gu och medarbetare [13] har visat att RAGE Gly ^{82Ser polymorfism kan förknippas med en ökad risk för initiering eller progression av gastrisk karcinom. Men så vitt vi vet, är förhållandet mellan RAGE uttryck och GC patientens prognos okänd.}

I denna studie analyserade vi RAGE expressionsnivån i GC med hjälp realtid kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR), Western blotting och immunohistokemi (IHC). Vi identifierade en relation mellan RAGE uttryck och kliniskt patologiska funktioner i GC, och sedan utvärderade prognostiska värde RAGE uttryck för den postoperativa överlevnad GC patienter.

Material och metoder

Etik uttalande

Denna studie godkändes av den etiska kommittén Nanfang sjukhus och skriftligt informerat samtycke erhölls genom alla dessa patienter är inblandade.

patienter och vävnadsprover

Trettio parade färskfryst gastric cancer och motsvarande noncancerous slemhinna vävnad (utskurna > 10 cm från kanten av GC) samlades in från GC patienter inom 30 minuter efter resektion och omedelbart lagras i flytande kväve fram till användning. En annan 180 paraffininbäddade GC vävnadsblock och 69 kontrollprover från matchade normala mag vävnader tagna från den distala resektion marginal erhölls från de lagrade filerna vid institutionen för allmän kirurgi, Nangfang sjukhus, Southern Medical University, samlades kirurgiskt mellan januari 2007 och december 2008. De 180 patienter ingick 120 män och 60 kvinnor i åldrarna 22-78 år (medelvärde, 55,62 år). Ingen av dessa patienter behandlades med radioterapi eller kemoterapi före operation. Den histopatologiska typ och stadium av utskurna proverna bestämdes enligt kriterierna i Världshälsoorganisationens klassificering och den amerikanska kommittén för cancer (AJCC) Cancer Staging Manual (7: e upplagan, 2010). Bland dem, mottog 125 Steg I-III patienter radikal resektion (19, 25 och 81 för stegen I, II och III, respektive), och 55 Stage-IV patienter fick palliativ kirurgi och /eller kemoterapi. Metastasen drabbade avlägsna organ i Stage-IV inkluderade patienter bukhinnan, avlägsen lymfkörtel, lever, tvärgående tjocktarmen, äggstock eller äggledare, bukspottkörtel, tarm, ben, lunga, hjärna och nedre hålvenen. Patienterna följdes till döden eller den sista uppföljningsdatum (30 December 2013). Median uppföljningstid var 48 månader (från 2 till 82 månader).

Total RNA-extraktion och i realtid kvantitativ RT-PCR

Totalt RNA extraherades från malet vävnader med TRIzol reagens (TaKaRa, Japan) och transkriberades omvänt till första sträng cDNA med TaqMan Reverse Transcription Kit (TaKaRa, Japan). Därefter tillsattes 0,5- till 1-il alikvoter av den cDNA som användes som templat för att amplifiera RAGE-fragmentet (framåt: 5- AAACATCACAGCCCGGATTG-3, omvänd: 5- TCCGGCCTGTGTTCAGTTTCT-3) under följande betingelser: 95 ° C under 30 s; 40 cykler av 95 ° C under 5 s; 60 ° C under 30 s; och smälte vid 95 ° C under 5 sek, följt av 60 ° C under 1 min och kylning vid 50 ° C under 30 sek. PCR och datainsamling utfördes på LightCycler480 System (Roche, Schweiz) med 2 x SYBR Green Master Mix kit (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornien, USA). RAGE uttryck normaliserades till den för GAPDH.

Western blotting-analys

Western blotting utfördes enligt standardmetoder såsom beskrivits tidigare [14]. Kortfattat, vävnader maldes och lyserades med RIPA-lysbuffert och lysaten skördades genom centrifugering (12000 rpm) vid 4 ° C under 30 min. Proteinkoncentrationer bestämdes med användning av bicinkoninsyra Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Approximativt 50 pg prover separerades därefter elektroforetiskt på 10% natriumdodecylsulfat (SDS) -polyacrylamide geler och överfördes till ett polyvinylidendifluoridmembran. Efter blockering av de icke-specifika bindningsställen, inkuberades membranet med en kanin polyklonal anti-RAGE-antikropp (Santa-Cruz, CA, USA) vid en 1: 1000 spädning vid 4 ° C över natten. Efter tre tvättningar med TBST (Tris-buffrad saltlösning med Tween-20) under 10 min, inkuberades membranen med en sekundär antikropp vid en utspädning av 1: 3000 vid rumstemperatur i 60 min. Proteiner detekterades med en förstärkt kemiluminescens (Amersham Pharmacia Biotechnology, Piscataway, NJ, USA), och normaliseras till p-aktin detekteras med användning av en mus-anti-human-β-aktin-antikropp (1: 1000 spädning; Sigma, St. Louis, MO , USA).

Immunhistokemisk analys

IHC-analysen utfördes såsom tidigare beskrivits [12,14]. I korthet innebar detta glasen avparaffineras med dimetylbensen och rehydratiserades genom en etanol-gradient (100%, 95%, 90%, 80% och 70% etanol) i vatten. Efter tvättning med PBS (fosfatbuffrad saltlösning) under tre gånger, var slides kokas i antigenåtervinning buffert, 0,01 M natriumcitrat-saltsyra (pH = 6,0), under 30 minuter i en mikrovågsugn. Efter endogen peroxidasaktivitet släcktes med 3% H _{2O 2, efter det att tre PBS-tvättar, icke-specifik antikroppsbindning blockerades genom att inkubera objektglasen med 10% normalt get-icke immunt serum. Sektionerna inkuberades sedan vid 4 ° C över natten med polyklonal kanin-RAGE-antikropp (Santa-Cruz, CA, USA) vid en 1: 400 utspädning och inkuberades därefter med pepparrotsperoxidas (HRP) (ChemMateTM DAKO EnVisionTM Detection Kit) vid rumstemperatur under 30 min. Efter tvättning i PBS, var sektionerna därefter framkallas genom användning 3,3-V-diaminobensidin (Sigma), tvättades i rinnande kranvatten, och lätt motfärgades med hematoxylin före uttorkning och täckglas montering. Negativa kontrollexperiment genomfördes genom att ersätta den primära antikroppen med PBS.}

Immunfärgning analyserades av två oberoende observatörer (Y.X. och L.Z.) som var blinda för patienternas utfall och andra kliniskt patologiska parametrar. Systemet RAGE upptäckt har beskrivits tidigare [12]. Samtliga prover kategoriseras omfattningen av immunoreaktivitet: 0 < 5%; 1, 5% -10%; 2, 10% -50%; 3, 50% -75%; 4 > 75%. Färgningsintensitet bedömdes som 0, negativ; 1, svag; 2, måttlig; 3, stark. För varje fall, det totala immunfärgning poängen även känd som färgningsindex (SI), beräknades genom att multiplicera procenttalet positiva celler med färgningsintensiteten poäng, vilket gav ett värde mellan 0 och 12. För denna studie var en optimal cutoff värde identifieras enligt följande: SI < 8 användes för att indikera låg RAGE uttryck och SI≥8 hög RAGE expression

Statistisk analys

Statistisk analys utfördes med användning av SPSS statistiskt programpaket (SPSS version 19,0. , SPSS, Chicago, IL, USA). En parade prover t-test användes för att jämföra de RAGE mRNA och proteinnivåer i cancer och angränsande noncancerous vävnadsprover. Mann-Whitney U-test eller Pearson Chi-Square test användes för att jämföra SI poäng som immunohistokemisk analys av GC och motsvarande normal slemhinna vävnad. Förhållandet mellan RAGE-expression och kliniskt patologiska egenskaper analyserades med användning av Pearson Chi-square test. Överlevnadskurvorna beräknades enligt Kaplan-Meier-metoden och analyserades med användning av log-rank test. Cox proportional hazards regressionsmodell användes för univariata och multivariat analys för att bedöma hazard ratio (HR) och identifiera faktorer som kan förutsäga överlevnad. En dubbelsidig p-värde. ≪ 0,05 ansågs statistiskt signifikant

Resultat

Uttryck av RAGE i human GC

För att belysa betydelsen av RÅGE i GC utveckling och progression, först analyserade vi dess uttryck i GC prover och matchas intilliggande noncancerous vävnader på mRNA-nivå. I realtid av kvantitativ RT-PCR-analys visade att RÅGE överuttrycktes i majoriteten av GC vävnader jämfört med deras normala motsvarigheter (19/30; 63,3%) (fig 1). RAGE på liknande uppregleras på proteinnivå i GC, såsom visas med Western blöt och IHC-analyser. Förhöjda RAGE uttrycksnivån konstaterades av Western blotting-analys i 26 av 30 (86,7%) GC jämfört med normala vävnader (Fig 2). Paraffininbäddade block (n = 249) från 180 GC patienter utvärderades för RAGE-proteinuttryck med IHC (tabell 1). Frånvarande eller låg färgning (SI < 8) av normal magslemhinna observerades i 55 av 69 fall (79,7%), medan hög färgning (SI≥8) noterades i de flesta GC vävnader (111/180; 61,7%). RAGE uttryck var betydligt högre i GC vävnader (n = 180, SI = 6,22) jämfört med normala gastriska vävnader (n = 69, SI = 2,09; P Hotel < 0,001). Representativa exempel på svaga, måttliga, stark färgning (micrographs med 200 gångers förstoring) visas i figur 3.

Association of RAGE uttryck med kliniskt patologiska egenskaper

Baserat på de kategorier som vi definierade i metoddelen, visade data som högt uttryck av RÅGE var signifikant korrelerad med histologisk grad ( P
= 0,002), nodal status (N skede P
= 0,025), metastaser status (M skede P
= 0,002) och AJCC stadium ( P
= 0,020), men var inte med kön, ålder, tumörstorlek, tumörplacering, Lauren klassificering eller tumörinvasion (Tabell 2).

Samband mellan RAGE uttryck baserat på IHC och patientöverlevnad

Kaplan-Meier-kurva visade att patienter i hög RAGE gruppen hade en signifikant sämre överlevnad än patienter i låg-RAGE grupp ( P Hotel < 0,001; figur 4A). Patienter med högt RAGE uttryck hade också en betydligt sämre total överlevnad än de med lågt uttryck av RÅGE i AJCC stadium III /IV subgrupp (n = 136; P Hotel < 0,001; figur 4C), men inte i den AJCC steg i /II subgrupp (n = 44; P
= 0,695; figur 4B).

univariata och multivariata analyser

Univariat analys visade en signifikant samband mellan den totala överlevnad och ålder, tumörinvasion, nodal status, metastaser status, AJCC scen och RAGE uttryck (se tabell 3). Alla dessa faktorer ingår i en multivariat Cox proportional hazards modell för att justera för effekterna av variablerna. Baserat på denna modell, RAGE uttrycksnivåer (hazard ratio (HR) = 2.143, 95% konfidensintervall (95% CI) = 1,357-3,383; P
= 0,001) och tumörinvasion (HR = 11,209; 95 % CI = 1,297-96,874; P
= 0,028) bekräftades som oberoende prognostiska faktorer (tabell 3) katalog

Diskussion

GC är fortfarande en av de mest dödliga humana maligniteter. , särskilt i östra Asien. Trots framsteg inom diagnostik och terapi, är fortfarande dyster prognos för magsäckscancer och är beroende av en rad karcinom egenskaper, såsom tumörtillväxt, differentiering, invasion och avlägsna metastaser [15]. GC tumörbildning och progression är dåligt kända, komplexa flerstegsprocesser som regleras av inre och yttre cellulära signaler som involverar flera gen- och proteinförändringar. Det är viktigt att identifiera och förstå de molekylära mekanismerna bakom tumör initiering och progression att utveckla rationella och cancerspecifika metoder för tidig diagnos och behandling av GC.

I denna studie undersökte vi RAGE uttryck status i GC både mRNA och proteinnivåer och fann att RAGE var anmärkningsvärt uppregleras i humana GC vävnader jämfört med normal gastric epitel. IHC analys utfördes för att ytterligare bekräfta denna uppreglering av RAGE uttryck i primär GC. Vi observerade att en hög nivå av RAGE-uttryck signifikant samband med den histologiska grad, nodal status, metastaser status och AJCC steg i GC, som liknar tidigare fynd i OSCC och icke småcellig lungcancer [9,10]. Sammantaget föreslår dessa resultat att RÅGE kan vara inblandade i GC progression.

Vi bestämde också för första gången att RAGE uttryck är en stark prediktor för dålig prognos för GC patienter, liknande iakttagelser i kolorektal cancer, hepatocellulär cancer, OSCC och NSCLC [9,10,16,17]. Dock verkar prognostiska effekterna av RAGE uttryck att variera beroende på cancer stadium (Fig 4). I den aktuella studien föreslog överlevnadsanalys att tumörinvasion och RAGE uttryck oberoende förutspått dålig överlevnad. De relativt små provstorlekar av det stadium I och II gruppen kan vara ansvarig för skillnaden. De flesta patienter med GC i Kina diagnostiseras i de avancerade stadier på grund av en brist på effektiv tidig upptäckt. Dessutom har RAGE uttryck en smalare 95% KI och verkar vara en en bättre prediktor för GC jämfört med tumörinvasion i denna studie.

RÅGE är en mönsterigenkännings receptor som binder multipla ligander härledda från en skadad cellmiljö, och spelar en avgörande roll för att främja den gastrointestinala tumörbildning [18]. Också som en viktig inflammatorisk medlare kan RAGE modulera överhörning mellan överlevnadsvägar och autophagy i tumörceller och främja tumöröverlevnad via upprätthålla autophagy och begränsa apoptos [19]. Kuniyasu et al
. [11] har rapporterat att, RAGE uttryck är nära förknippad med invasionen och metastaser i GC patienter, vilket ger oss en försöksverksamhet för den funktionella studier av RÅGE i magcancer. Därefter Xu och medarbetare [12] visade att knockdown av RÅGE reducerat GC cellproliferation och invasion av magcancer, minskad expression av AKT, PCNA och MMP-2, och inducerades cellapoptos och cykelstopp. Därför riktade hämning av RAGE eller dess ligander kan fungera som nya mål för att förbättra de nuvarande cancerterapier.

Hittills är fortfarande oklart värdet av inriktnings RAGE för eventuell tidigt ingripande och profylax i GC. Däremot har flera studier visat betydelsen av RÅGE i andra cancertyper och har visat att blockaden av RAGE minskad tillväxt och metastaser av både implanterade tumörer och tumörer utvecklar spontant hos känsliga möss. Hämning av RAGE minskad proliferation i bröstcancerceller och inducerade cell apoptos och hämmade prostatacancer tillväxt [20,21]. RAGE dysfunktion hämmade också angiogenes och utvecklingen av kolorektal cancer, och förlängde överlevnaden i cancer i bukspottskörteln [22-24]. Blockad av RAGE med lösligt RÅGE (sRAGE) försvagade leverskada, vilket förbättrar överlevnaden, skyddar mot hepatocellulär nekros, och öka uttrycket av proregenerative cytokin tumörnekrosfaktor-a [25]. Dessutom Moy et al. [26] fann ett gränsfall statistiskt signifikant omvänt samband mellan kontinuerlig sRAGE exponering och risk levercancer, vilket tyder på att sRAGE kan skydda mot de inflammatoriska effekter som orsakas av RAGE aktivering. Dessa fynd genomgående indikerade att RAGE kan också fungera som ett potentiellt terapeutiskt mål i GC. Med tanke på dess biologiska egenskaper, RAGE och dess derivat har ansetts som en ny indikator för malign potential inklusive GC. RAGE Gly ^{82Ser polymorfism har visat sig vara associerade med en ökad risk för GC utveckling eller progression i en sjukhusbaserad fall-kontrollstudie [13].}

I den aktuella studien fann vi att uppreglering av RAGE-uttryck signifikant associerade med dåliga kliniskt patologiska egenskaper och dålig överlevnad, vilket tyder på att det kan bidra till den maligna potential GC. Därför kunde RAGE därför tjäna som en värdefull ny biomarkör för att förutsäga prognos och ett potentiellt terapeutiskt mål för patienter med GC. Det krävs dock ytterligare studier motiverat att klargöra de bakomliggande mekanismerna för RAGE uttryck och därmed bidra till en bättre förståelse och vidareutveckla dess potentiella användning.

Tack till

Vi tackar Dr Yan Xiao och Dr. Liang Zhao från avdelningen för patologi för patologisk diagnos och bekräftelse av IHC resultat.

• PLOS ONE: Den prognostisk betydelse för förbehandling Serum CEA-nivåer i Gastric Cancer: A Meta-Analysis Inklusive 14651 Patienter
• PLOS ONE: LAPTM4B-35, en cancerrelaterad Gene, är associerad med dålig prognos i TNM stadium I-III magcancer Patienter