PLOS ONE: A superexpressão do receptor de glicação avançada Endproducts (RAGE) está associada a mau prognóstico no câncer gástrico

Abstract

Fundo

O receptor para produtos finais da glicação avançada (RAGE) é um receptor trans-membranoso multidisciplinar oncogênico, que está sobre-expressos em vários cancros humanos. Recentemente, tem sido mostrado que RAGE também está envolvido na carcinogénese e invasão tumoral. Neste estudo, nós investigamos os níveis de expressão e valor prognóstico do RAGE em cancros gástricos primários (GC).

Métodos

Nós investigamos a expressão RAGE no GC primário e emparelhados tecido gástrico normal real tempo de RT-PCR quantitativo (n = 30) e análise Western blot (n = 30). Além disso, foi realizada imuno-histoquímica em 180 espécimes GC embebidos em parafina, 69 espécimes normais correspondentes.

Resultados

RAGE foi sobre-expresso em GC em comparação com os tecidos não cancerosos adjacentes ( P
<0,001), e maior expressão de RAGE significativamente correlacionada com o grau histológico ( P
= 0,002), estado nodal ( P
= 0,025), o estado de metástase ( P
= 0,002), e pelo Comité Misto americana no palco do Câncer ( P
= 0,020). Além disso, a regulação positiva da expressão de RAGE é um fator prognóstico independente na análise multivariada, utilizando o modelo de regressão de Cox ( P
= 0,001).

Conclusões

A superexpressão RAGE pode ser um útil marcador para prever a progressão GC e mau prognóstico

Citation:. Wang D, Li T, Ye G, Shen Z, Hu Y, Mou T, et al. (2015) superexpressão do receptor de glicação avançada Endproducts (RAGE) está associada a mau prognóstico no câncer gástrico. PLoS ONE 10 (4): e0122697. doi: 10.1371 /journal.pone.0122697

Editor do Academic: Valli De Re, IRCCS Instituto Nacional do Câncer, ITALY

Recebido: 22 de novembro de 2014; Aceito: 13 de fevereiro de 2015; Publicação: 10 de abril de 2015

Direitos de autor: © 2015 Wang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo programa da Especialidade Key Clínica médica Nacional, do Fundo de Investigação do bem-estar do público na Indústria de Saúde (No.201402015), o Programa major da Ciência e Tecnologia programa de Guangzhou (No.201300000087) e The National Key Tecnologia R & D programa (No.2013BAI05B00). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o receptor para produtos finais de glicação avançada (RAGE), uma molécula da superfície celular expressa em uma variedade de tipos de células, é um membro multiligand da superfamília da imunoglobulina [1]. RAGE tem sido implicada em um amplo espectro de respostas patológicas, incluindo a inflamação e cancro, com base na variedade dos seus ligandos [2]. Como um receptor de trans-membranoso oncogénica recentemente reconhecido, demonstrou-se estar envolvido em vários cancros humanos estimular o crescimento, a sobrevivência, e a propagação metastática [3]. Vários estudos têm demonstrado que a raiva é regulada positivamente e perde a sua característica padrão granular em tumores primários [4]. A interação AGE-RAGE desempenha um papel crucial no desenvolvimento do câncer de próstata, e inibindo essa interação tem potencial como um novo alvo molecular para a prevenção ou tratamento do câncer [5]. Co-expressão de raiva e de alta mobilidade da proteína grupo B1 (HMGB1) foi substancialmente associado com a invasão câncer colorretal e metástases [4,6,7]. Além disso, a expressão RAGE se correlaciona com a angiogênese e tumor metástase do carcinoma de células escamosas oral (CCEO) e pode ser um fator prognóstico independente para recorrência e prognóstico em pacientes com tumores [8,9]. Além disso, o polimorfismo genético do gene RAGE pode ser um biomarcador preditivo utilizado para o rastreio de doentes sensíveis a termoterapia e para avaliar o prognóstico de cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) pacientes [10].

No entanto, o papel de RAGE no câncer gástrico (GC) permaneceu uma incógnita. RAGE já havia sido indicado intimamente associado com invasão e metástase no câncer gástrico [11]. Além disso, foi relatado que o bloqueio da sinalização de RAGE suprimiu o crescimento e as metástases de células cancerosas gástricas [12]. Em uma investigação sobre os papéis de RAGE na patogênese da GC e progressão e os efeitos de seus polimorfismos do gene em função do receptor, Gu e seus colegas [13] demonstraram que RAGE Gli ^{polimorfismo 82Ser pode estar associado com um risco aumentado de iniciação ou a progressão do carcinoma gástrico. No entanto, para o nosso conhecimento, a relação entre a expressão da raiva e GC prognóstico do paciente é desconhecido.}

Neste estudo, foram analisados ​​nível de expressão RAGE no GC usando em tempo real RT-PCR quantitativa (qRT-PCR), western blotting e imuno-histoquímica (IHC). Identificamos uma relação entre a expressão RAGE e as características clinicopatológicas de GC, e, em seguida, avaliaram o valor prognóstico da expressão RAGE para a sobrevivência pós-operatória dos pacientes do GC.

Materiais e Métodos

declaração Ética

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Nanfang Hospital e consentimento informado por escrito foi obtido por todos esses pacientes envolvidos.

pacientes e amostras de tecido

Trinta emparelhado fresco congelado gástrica canceroso e tecido não canceroso mucosa correspondente (excisadas > 10 cm de distância da borda dos GC) amostras foram coletadas de pacientes GC dentro de 30 minutos após a ressecção e imediatamente armazenados em nitrogênio líquido até o uso. Outra 180 embebidos em parafina blocos de tecido GC e 69 amostras de controlo de tecidos gástricos normais pareados tiradas da margem de ressecção distal foram obtidos a partir dos arquivos armazenados do Departamento de Cirurgia Geral, Nangfang Hospital, Southern Medical University, foram recolhidos cirurgicamente entre janeiro de 2007 e dezembro 2008. Os 180 pacientes incluídos 120 homens e 60 mulheres com idade entre 22-78 anos (média de 55,62 anos). Nenhum destes pacientes foram tratados com radioterapia ou quimioterapia antes da cirurgia. O tipo histológico e estágio dos espécimes ressecados foram determinados de acordo com os critérios da classificação da Organização Mundial de Saúde e American Joint Committee on Cancer (AJCC) Cancer Staging Manual (7ª edição, 2010). Entre eles, 125 pacientes estágio I-III recebeu ressecção radical (19, 25 e 81 para as fases I, II e III, respectivamente), e 55 pacientes Stage-IV recebeu cirurgia e /ou quimioterapia paliativa. Os órgãos distantes afectada de metástases em doentes Fase IV-incluído o peritoneu, nódulo linfático distante, do fígado, do cólon transversal, do ovário ou do oviduto, pâncreas, intestino, osso, pulmão, cérebro e veia cava inferior. Os pacientes foram acompanhados até a morte ou a última data de acompanhamento (30 de dezembro de 2013). O tempo médio de acompanhamento foi de 48 meses (de 2 a 82 meses).

extração de RNA total e em tempo real RT-PCR quantitativo

O RNA total foi extraído de tecidos picados com a TRIzol reagente (Takara, Japão) e reversamente transcrito em ADNc de primeira cadeia com o Kit de Transcrição reversa TaqMan (Takara, Japão). Em seguida, alíquotas de 0,5 a 1 ul de ADNc foram utilizados como moldes para amplificar o fragmento de RAGE (para a frente: 5- AAACATCACAGCCCGGATTG-3; reverso: 5- TCCGGCCTGTGTTCAGTTTCT-3) sob as seguintes condições: 95 ° C durante 30 s; 40 ciclos de 95 ° C durante 5s; 60 ° C durante 30 s; e ponto de fusão a 95 ° C durante 5 seg, seguido de 60 ° C durante 1 min, e de se arrefecer a 50 ° C durante 30 seg. PCR e coleta de dados foram realizados em LightCycler480 System (Roche, Suíça), com 2 × SYBR Green kit mestre mix (Invitrogen, Carlsbad, Califórnia, EUA). expressão RAGE foi normalizada para a da GAPDH.

análise de transferência de Western

Western blotting foi realizado de acordo com métodos normalizados, tal como descrito anteriormente [14]. Resumidamente, os tecidos foram moídos e lisadas com tampão de lise RIPA e os lisados ​​foram colhidos por centrifugação (12.000 rpm) a 4 ° C durante 30 min. As concentrações de proteína foram determinadas utilizando o Kit de ácido bicinconínico Protein Assay (Pierce, Rockford, IL, EUA). Aproximadamente 50 ug amostras foi, em seguida, separado por electroforese em 10% de dodecil sulfato de sódio (SDS) poliacrilamida geles e transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno. Depois de bloquear os sítios de ligação não específicos, a membrana foi incubada com um anticorpo anti-RAGE policlonal de coelho (Santa Cruz, CA, EUA) a uma diluição de 1: 1000 a 4 ° C durante a noite. Após três lavagens com TBST (soro fisiológico tamponado com Tris com Tween-20) durante 10 minutos, as membranas foram incubadas com um anticorpo secundário, a uma diluição de 1: 3000 a temperatura ambiente durante 60 min. As proteínas foram detectadas com um sistema de quimioluminescência aumentada (Amersham Pharmacia Biotechnology, Piscataway, NJ, EUA), e normalizada para p-actina detectada utilizando um anticorpo β-actina anti-humano de ratinho (diluição 1: 1000; Sigma, St. Louis, MO , EUA).

imuno-ensaio

O ensaio IHC foi realizada como previamente descrito [12,14]. Resumidamente, as lâminas foram desparafinadas e reidratadas com dimetilbenzeno através de um gradiente de etanol (100%, 95%, 90%, 80% e 70% de etanol) em água. Após lavagem com PBS (solução salina tamponada com fosfato) para três vezes, as lâminas foram fervidas em tampão de recuperação de antigénios, 0,01 M de citrato de sódio de ácido clorídrico (pH = 6,0), durante 30 min num forno de microondas. Depois de a actividade da peroxidase endógena foi extinta com 3% H _{2O 2, subsequente a três lavagens com PBS, o anticorpo a ligação não específica foi bloqueada através da incubação das lâminas com 10% de soro normal de cabra não imune. As secções foram então incubadas a 4 ° C durante a noite com o anticorpo policlonal de coelho RAGE (Santa-Cruz, CA, EUA) a uma diluição de 1: 400 e subsequentemente incubadas com peroxidase de rábano (HRP) (ChemMateTM DAKO EnVisionTM Detection Kit) à temperatura ambiente durante 30 min. Após lavagem em PBS, as secções foram então desenvolvidos utilizando 3,3-V-diaminobenzidina (Sigma), lavadas em água corrente, e ligeiramente contrastadas com hematoxilina antes da desidratação e lamela montagem. experiências de controlo negativo foram realizados substituindo o anticorpo primário, com PBS.}

A imunocoloração foi analisado por dois observadores independentes (Y.X. e L.Z.) que estavam cegos para o resultado dos doentes e outros parâmetros clínico-patológicos. O sistema de detecção de RAGE tem sido descrito anteriormente [12]. Todas as amostras foram classificadas pelo grau de imunorreactividade: 0, < 5%; 1, 5% -10%; 2, 10% -50%; 3, 50% -75%; 4, > 75%. intensidade da coloração foi classificada como 0, negativa; 1, fraco; 2, moderada; 3, forte. Para cada caso, a pontuação total imunocoloração também conhecido como o índice de coloração (SI), foi calculado multiplicando a percentagem de células positivas com a pontuação da intensidade da coloração, obtendo-se um valor entre 0 e 12. Para este estudo, um valor de corte foi óptima identificados como segue: SI < 8 foi usado para indicar baixa expressão RAGE e SI≥8 alta expressão de RAGE

a análise estatística

a análise estatística foi realizada utilizando o pacote de software estatístico SPSS (SPSS versão 19.0.; SPSS, Chicago, IL, EUA). A-amostras pareadas t-teste foi utilizado para comparar os mRNA raiva e os níveis de proteína nas amostras de tecido não-cancerosas e cancerosas adjacentes. O teste de Mann-Whitney ou o teste Pearson Qui-quadrado foi utilizado para comparar as pontuações SI obtidos por análise imuno-histoquímica da GC e tecido mucosa normal correspondente. A relação entre a expressão da raiva e características clínico-patológicos foram analisados ​​utilizando o teste de Pearson Chi-quadrado. As curvas de sobrevida foram calculadas de acordo com o método de Kaplan-Meier e analisadas pelo teste de log-rank. O modelo de riscos proporcionais de Cox foi utilizado para análise uni e multivariada para avaliar a taxa de risco (HR) e identificar fatores que predizem a sobrevivência. A frente e verso valor de p <. 0,05 foram considerados estatisticamente significativos

Resultados

A superexpressão de RAGE no GC humana

Para elucidar o papel de RAGE no desenvolvimento de GC e progressão, foram analisados ​​em primeiro lugar a sua expressão em amostras de GC e combinados tecidos cancerosos adjacentes ao nível do ARNm. Análise em tempo real quantitativa de RT-PCR mostrou que RAGE foi sobre-expresso na maioria dos tecidos de GC em comparação com as suas contrapartes normais (19/30; 63,3%) (Figura 1). RAGE foi semelhante regulada ao nível da proteína em GC, tal como mostrado por Western blot e ensaios IHC. nível de expressão RAGE elevada foi encontrado pela análise Western blot em 26 de 30 (86,7%) GCs em comparação com os tecidos normais (Figura 2). blocos embebidos em parafina (n = 249) a partir de 180 pacientes com GC foram avaliadas para a expressão da proteína RAGE por IHC (Tabela 1). coloração ausente ou baixo (SI < 8) da mucosa gástrica normal foi observada em 55 dos 69 casos (79,7%), ao passo que a coloração alta (SI≥8) foi observado na maioria dos tecidos de GC (111/180; 61,7%). expressão RAGE foi significativamente maior nos tecidos GC (n = 180; SI = 6,22) em comparação com os tecidos gástricos normais (n = 69; SI = 2,09; P Art < 0,001). Exemplos representativos de fracos, moderados, coloração forte (micrografias com 200 × ampliação) são mostrados na figura 3.

associação da expressão de RAGE com características clinicopatológicas

Com base nas categorias definidas que na na seção Métodos, os dados mostraram que a alta expressão de RAGE foi significativamente correlacionada com grau histológico ( P
= 0,002), estado nodal (fase N, P
= 0,025), o estado de metástase (M etapa, P
= 0,002) e estágio AJCC ( P
= 0,020), mas não estava com sexo, idade, tamanho do tumor, localização do tumor, classificação Lauren ou invasão tumoral (Tabela 2).

Correlação entre a expressão de RAGE baseado em IHC e sobrevida do paciente

A curva de Kaplan-Meier mostrou que os pacientes no grupo de alto RAGE apresentaram uma sobrevida global significativamente pior do que os pacientes em baixo RAGE grupo ( P Art < 0,001; Fig 4A). Pacientes com alta expressão de RAGE também tiveram uma sobrevivência significativamente pior global do que aqueles com baixa expressão de RAGE na fase AJCC III /IV subgrupo (n = 136; P Art < 0,001; Fig 4C), mas não em o palco AJCC I /II subgrupo (n = 44; P
= 0,695; Fig 4B).

uni e multivariada análises

a análise univariada mostrou uma relação significativa entre global sobrevivência e idade, invasão do tumor, estatuto nodal, estado metástase, fase AJCC e expressão RAGE (ver Tabela 3). Todos esses fatores são incluídos em um Cox modelo de risco proporcional multivariada para ajustar os efeitos das covariáveis. Com base neste modelo, os níveis de expressão RAGE (hazard ratio (HR) = 2.143; intervalo de confiança de 95% (95% CI) = 1,357-3,383; P
= 0,001) e invasão tumoral (HR = 11,209; 95 % CI = 1,297-96,874; P
= 0,028) foram confirmados como fatores prognósticos independentes (Tabela 3)

Discussão

GC continua sendo um dos males humanos mais fatais. , especialmente no leste da Ásia. Apesar dos avanços no diagnóstico e terapia, o prognóstico para o cancro gástrico ainda é sombrio e é dependente de uma série de características de carcinoma, tais como crescimento tumoral, diferenciação, invasão e metástase [15]. tumorigênese GC e progressão são mal compreendidos, processos complexos, de várias etapas reguladas por sinais celulares intrínsecos e extrínsecos envolvendo múltiplas alterações genéticas e proteínas. É vital identificar e compreender os mecanismos moleculares subjacentes a iniciação e progressão tumoral para desenvolver abordagens racionais e específicos de câncer para o diagnóstico precoce e tratamento de GC.

Neste estudo, nós investigamos o status de expressão RAGE no GC em ambos os mRNA e os níveis de proteína e descobriram que RAGE foi extremamente regulada nos tecidos GC humanos em comparação com o epitélio gástrico normal. análise IHC foi realizada para validar ainda mais este upregulation de expressão RAGE no GC primário. Observou-se que um nível elevado de expressão RAGE foi significativamente associada com o grau histológico, estado nodal, estado de metástase, e estágio AJCC em GC, semelhante aos achados anteriores em CCEO e NSCLC [9,10]. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a raiva pode estar envolvido na progressão GC.

Nós também determinou pela primeira vez que a expressão RAGE é um forte preditor de mau prognóstico para pacientes GC, semelhante aos achados em câncer colorretal, hepatocelular câncer, CEB e NSCLC [9,10,16,17]. No entanto, o impacto prognóstico da expressão RAGE parece diferir de acordo com o estágio do câncer (Fig 4). No presente estudo, análise de sobrevivência sugeriu que a invasão do tumor e expressão RAGE preditores independentes de sobrevida global pobres. Os relativamente pequenos tamanhos de amostra da fase I e grupo II pode ser responsável pela diferença. A maioria dos pacientes com GC na China são diagnosticados em nos estágios avançados, devido à falta de detecção precoce eficiente. Além disso, a expressão de RAGE tem uma IC 95% mais estreita e parece ser a uma melhor preditor de GC em comparação com a invasão do tumor neste estudo.

RAGE é um receptor de reconhecimento de padrões que se liga a vários ligandos derivados a partir de um ambiente celular danificada, e desempenha um papel crítico na promoção da tumorigénese gastrointestinal [18]. Além disso, como um importante mediador inflamatório, raiva poderiam modular a diafonia entre os percursos de sobrevivência e autofagia em células tumorais e promover a sobrevivência do tumor através de sustentar autofagia e limitação da apoptose [19]. Kuniyasu et al
. [11] relataram que, expressão RAGE está intimamente associada com a invasão e metástase em pacientes GC, o que nos proporciona uma base experimental para o estudo funcional do RAGE no câncer gástrico. Subsequentemente, Xu e colaboradores [12] demonstraram que o knockdown da proliferação celular RAGE GC reduzida e invasão de cancro gástrico, diminuição da expressão de AKT, PCNA e MMP-2, e a apoptose celular induzida e a paragem do ciclo. Portanto, alvo de inibição de raiva ou seus ligantes podem servir como novos alvos para melhorar cancro terapias atuais.

Até o momento, o valor de segmentação RAGE para uma possível intervenção precoce e profilaxia em GC permanece obscuro. No entanto, vários estudos têm revelado o papel de RAGE em outros tipos de câncer e têm demonstrado que o bloqueio de RAGE diminuição do crescimento e as metástases de ambos os tumores implantados e desenvolver tumores espontaneamente em ratos suscetíveis. A inibição da RAGE diminuição da proliferação em células de câncer de mama e apoptose celular induzida e crescimento do câncer de próstata inibida [20,21]. RAGE Disfunção também inibiu a angiogênese ea progressão do cancro colorectal, e prolongou a sobrevida no câncer pancreático [22-24]. O bloqueio do RAGE com RAGE solúvel (sRAGE) atenuou a lesão hepática, melhorando assim a sobrevivência, a protecção contra necrose hepatocelular, e aumentar a expressão do fator de necrose tumoral citocina proregenerative [25]. Além disso, Moy et al. [26] encontraram uma associação inversa estatisticamente significativa limítrofe entre a exposição sRAGE contínua eo risco de câncer de fígado, sugerindo que sRAGE pode proteger contra os efeitos inflamatórios causados ​​pela ativação de RAGE. Estas descobertas consistentemente indicaram que RAGE também pode atuar como um potencial alvo terapêutico no GC. Dadas as suas características biológicas, RAGE e seus derivados têm sido considerados como um novo indicador de potencial maligno incluindo GC. O RAGE Gli ^{polimorfismo 82Ser foi mostrado para ser associado com um risco aumentado para o desenvolvimento GC ou progressão em um estudo de caso-controle de base hospitalar [13].}

No presente estudo, verificou-se que supra-regulação da expressão de RAGE foi significativamente associado com características clinicopatológicas pobres e sobrevivência global fraca, o que sugere que pode contribuir para o potencial maligno de GC. Portanto, RAGE poderia, portanto, servir como um romance valioso biomarcador para predizer o prognóstico e um potencial alvo terapêutico para pacientes com GC. No entanto, mais estudos são necessários para esclarecer os mecanismos subjacentes da superexpressão RAGE, contribuindo assim para uma melhor compreensão e continuar a desenvolver o seu potencial uso.

Reconhecimentos

Agradecemos ao Dr. Yan Xiao e Dr. Liang Zhao, do Departamento de Patologia para o diagnóstico patológico e confirmação dos resultados IHC.

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