PLoS One: a receptor túlexpressziója előrehaladott glikáció végtermékeinek (RAGE) van rossz prognózissal társul gyomorrákban

absztrakt katalógusa

Háttér katalógusa

A receptora glikációs végtermékek (RAGE) egy onkogén multidiszciplináris transz-membrán receptor, amely túlzott mértékben több emberi rákos. Újabban kimutatták, hogy a RAGE is részt vesz a karcinogenezis és a tumor invázió. Ebben a tanulmányban azt vizsgáltuk, az expressziós szintek és prognosztikus RAGE elsődleges gyomorrák (GC). Katalógusa

Módszerek katalógusa

Megvizsgáltuk RAGE expressziója primer GC és párosítva normál gyomor szöveteit valós idejű kvantitatív RT-PCR (n = 30) és Western-blot-elemzés (n = 30). Továbbá, mi végeztünk immunhisztokémiai 180 paraffinba ágyazott GC példányok, 69 illesztett normális példányok. Katalógusa

Eredmények katalógusa

RAGE-ben túltermelõdik GC összehasonlítva a szomszédos rákos szövetekben ( P katalógusa <0,001), és a magasabb RAGE expresszió szignifikáns összefüggést mutat a szövettani grade ( P katalógusa = 0,002), a nyirokcsomó státusz ( P katalógusa = 0,025), áttét állapot ( P katalógusa = 0,002), és az American Joint Committee on Cancer szakasz ( P katalógusa = 0,020). Továbbá felfokozását RAGE kifejezés önálló prognosztikai faktor többváltozós elemzés a Cox-féle regressziós modell ( P katalógusa = 0,001). Katalógusa

Következtetések katalógusa

RAGE túltermelése hasznos lehet a marker megjósolni GC progresszió és a rossz prognózissal. katalógusa

Citation: Wang D, Li T, Ye G, Shen Z, Hu Y, Mou T et al. (2015), a receptor túlexpressziója előrehaladott glikáció végtermékeinek (RAGE) társul rossz prognózissal gyomorrákban. PLoS ONE 10 (4): e0122697. doi: 10,1371 /journal.pone.0122697 katalógusa

Akadémiai Kiadó: Valli De Re, IRCCS National Cancer Institute, OLASZORSZÁG katalógusa

Beérkezett: november 22, 2014; Elfogadva: február 13, 2015; Megjelent: április 10, 2015 katalógusa

Copyright: © 2015 Wang et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra katalógusa

Az adatok elérhetősége: Minden lényeges adatot belül a papír. katalógusa

Forrás: Ezt a munkát a program által támogatott Nemzeti legfontosabb klinikai orvosi szakterület, Kutatási Alap közjóléti egészségügyi Industry (No.201402015), a Major Program Tudományos és Technológiai Program Guangzhou (No.201300000087) és az Országos Key Technology R &D Program (No.2013BAI05B00). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

a receptora glikációs végtermékek (RAGE), egy sejtfelszíni molekula kifejezve egy sor sejttípus, egy multiligand tagja az immunglobulin szupercsalád [1]. RAGE hozták összefüggésbe széles spektrumát patológiai válaszok, beleértve a gyulladást és a rák, amely a különböző ligandumai [2]. Mint újonnan felismert onkogén transz-hártyás receptor, kimutatták, hogy részt vesz a többszörös humán rákok növekedés, túlélés, és metasztatikus terjedését [3]. Számos tanulmány igazolta, hogy a RAGE túlszabályozott és elveszíti jellegzetes szemcsés mintázatot primer tumorokban [4]. Az AGE-RAGE interakció játszik döntő szerepet a fejlesztés a prosztatarák, és gátolja e kölcsönhatást potenciális új molekuláris célpontja a rák megelőzésére vagy kezelésére. [5] Koexpresszáltatása RAGE és a High-mobility group protein B1 (HMGB1) jelentősen járó colorectalis rák terjedését és áttét [4,6,7]. Továbbá, RAGE kifejezés korrelál a angiogenezis és a tumor metasztázis szájüregi laphámrák (OSCC) és lehet önálló prognosztikai tényezője kiújulás és a prognózis OSCC betegeknél [8,9]. Továbbá, a genetikai polimorfizmus RAGE gén lehet egy prediktív biomarker használható képernyő érzékeny betegeknél termoterápia és értékelje a prognózis a nem kissejtes tüdőrák (NSCLC) szenvedő betegek [10].

Azonban a szerepe a RAGE a gyomorrák (GC) megfoghatatlan maradt. RAGE korábban jeleztük szorosan kapcsolódik invázió és metasztázis gyomorrákban [11]. Sőt, azt jelentették, hogy blokád a RAGE jelzési elnyomta a növekedés és metasztázisok gyomorrák-sejtek [12]. Egy vizsgálat a szerepét RAGE GC patogenezisében és progressziójában és hatásai a gén polimorfizmusok receptor funkció, Gu és mtsai [13] kimutatták, hogy a RAGE Gly ^{82Ser polimorfizmust kapcsolódó fokozott kockázata megkezdése vagy progresszióját gyomorrák. Ahhoz azonban, hogy tudomásunk szerint a kapcsolat a RAGE expresszió és GC beteg prognózisa ismeretlen. Katalógusa}

Ebben a tanulmányban elemeztük RAGE expressziós szintjének GC segítségével valós idejű kvantitatív RT-PCR (qRT-PCR), Western blot és immunhisztokémiai (IHC). Azonosítottunk közötti kapcsolat RAGE expresszió és a klinikopatológiai jellemzői GC, és ezután értékelték a prognosztikai RAGE kifejezés a posztoperatív túlélése GC betegek. Katalógusa

Anyagok és módszerek katalógusa

Etikai nyilatkozat

Ez a tanulmány által jóváhagyott Nanfang Kórház Etikai Bizottság írásos beleegyezését adta mindezen érintett betegek. katalógusa

a betegek és szövetminták

harminc párosított friss fagyasztott gyomor rákos és megfelelő jóindulatú nyálkahártya szövet (kimetszett > 10 cm-re a szélén a GC) mintákat gyűjtöttünk GC betegek után 30 percen belül reszekció, és azonnal folyékony nitrogénben tároltuk a felhasználásig. További 180 paraffinba ágyazott GC szövettani blokkok és 69 kontroll mintákat illesztett normál gyomor szövetek venni a distalis reszekciós kaptuk a tárolt fájlok a Általános Sebészeti Osztály, Nangfang Kórház, Dél Orvostudományi Egyetem, gyűjtöttük sebészileg között 2007. január december 2008. A 180 beteget vontak 120 férfi és 60 éves nők 22-78 éves (átlagéletkor 55,62 év). Ezek egyike sem beteget kezeltek radioterápiával vagy kemoterápiával a műtét előtt. A kórszövettani típusától és stádiumától Az eltávolított mintákat szerint meghatározott kritériumok az Egészségügyi Világszervezet besorolása és American Joint Committee on Cancer (AJCC) Cancer Staging Manual (7. kiadás, 2010). Ezek közül 125 szakasz I-III beteg kapott reszekcióra (19, 25, és 81. szakaszai I, II és III-kal), és a 55 szakasz-IV beteg kapott palliatív műtét és /vagy a kemoterápia. A metasztázis sújtotta távoli szervekben a Stage-IV bevont betegek a hashártya, távoli nyirokcsomó, a máj, a keresztirányú vastagbél, a petefészek vagy petevezeték, hasnyálmirigy, bél, csont, tüdő, agy és inferior vena cava. A betegek követése, amíg a halál vagy az utolsó nyomonkövetési dátum (december 30, 2013). A medián követési idő 48 hónap (2-82 hónap). Katalógusa

A teljes RNS extrakció és a valós idejű kvantitatív RT-PCR katalógusa

A teljes RNS-t vontunk ki darált szöveteket a TRIzol reagenst (TaKaRa, Japán), és reverz transzkripcióval első cDNS-szálat a TaqMan Reverse Transcription reagenskészlet (Takara, Japán). Ezután 0,5- és 1 ul-es aliquot a cDNS-t alkalmaztunk templátként amplifikálására RAGE fragmenst (Előre: 5- AAACATCACAGCCCGGATTG-3; reverz: 5- TCCGGCCTGTGTTCAGTTTCT-3) a következő körülmények között: 95 ° C-on 30 s; 40 ciklus 95 ° C-5S; 60 ° C-on 30 s; és olvadáspontja 95 ° C-on 5 másodpercig, majd 60 ° C-on 1 percig, és a hűtés 50 ° C-on 30 mp. PCR és adatgyűjtés végeztük LightCycler480 rendszer (Roche, svájci), 2 × SYBR Green Master Mix kittel (Invitrogen, Carlsbad, Kalifornia, USA). RAGE expresszióját normalizáltuk, hogy a GAPDH.

Western blot analízis

Western-blot vizsgálatot végeztünk standard módszerekkel korábban leírtak szerint [14]. Röviden, a szöveteket talaj és lizáltuk RIPA lízispufferben, és a lizátumot centrifugálással (12000 rpm), 4 ° C-on 30 percig. A protein koncentrációt határoztuk meg bicinchoninsav- Protein Assay Kit (Pierce, Rockford, IL, USA). Körülbelül 50 jig mintákat ezután elektroforetikusan elválasztható 10% -os nátrium-dodecil-szulfát (SDS) -poliakrilamid gél gélek és átvisszük egy polivinilidén-difluorid membránra. Blokkolás után a nem specifikus kötőhelyeket, a membránt egy nyúl poliklonális anti-RAGE antitesttel (Santa-Cruz, CA, USA) 1: 1000 hígításban 4 ° C hőmérsékleten egy éjszakán át. Három mosás után TBST-vel (Tris-pufferolt sóoldattal Tween-20) 10 percig, a membránokat egy szekunder antitesttel hígításban 1: 3000, szobahőmérsékleten 60 percig. A fehérjéket detektáltuk fokozott kemilumineszcenciás rendszert (Amersham Pharmacia Biotechnology, Piscataway, NJ, USA), és a normalizált, hogy p-aktin alkalmazásával detektáltuk egér anti-humán β-aktin antitestet (1: 1000 hígítás; Sigma, St. Louis, MO , USA).

immunhisztokémiai vizsgálattal

IHC vizsgálatot végeztünk a korábban leírtak [12,14]. Röviden, a lemezeket paraffint a dimetilbenzol és rehidratált keresztül etanol gradiens (100%, 95%, 90%, 80% és 70% -os etanol) vízbe. Mosás után PBS-sel (foszfáttal pufferolt sóoldat) három alkalommal, tárgylemezeket forraljuk antigén visszakeresés puffer, 0,01 M nátrium-citrát-sósav (pH = = 6,0), 30 percig egy mikrohullámú sütőben. Miután az endogén peroxidáz aktivitást, majd 3% H _{2 O 2, az azt követő három PBS mosás, nem specifikus antitest kötődés blokkoljuk a lemezeket 10% -os normál kecske-immun szérum. A metszeteket ezután inkubáljuk 4 ° C hőmérsékleten egy éjszakán át a nyúl poliklonális RAGE antitesttel (Santa-Cruz, CA, USA) 1: 400 hígítás, majd ezt követően inkubáljuk torma-peroxidázzal (HRP) (ChemMateTM DAKO EnVisionTM Detection Kit) szobahőmérsékleten 30 percig keverjük. A mosás után PBS-ben, a metszeteket ezután használatával kifejlesztett 3,3-V-diaminobenzidinnel (Sigma), mossuk folyó csapvízzel, és enyhén hematoxilinnel ellenfestettük előtt kiszáradás és fedőlemez szerelhető. Negatív kontroll kísérleteket végeztünk helyett a primer antitest-sel. Katalógusa}

Immunfestést elemezték két független megfigyelő (Y.X. és L.Z.), akik tudták, hogy a betegek kimenetelét és más klinikopatológiai paraméterek. A RAGE érzékelő rendszer korábban már leírták [12]. Az összes mintát kategorizált mértékének immunreaktivitás: 0, < 5%; 1, 5% -10%; 2, 10% -50%; 3, 50% -75%; 4, > 75%. A festés intenzitását pontozni 0, negatív; 1, gyenge; 2, mérsékelt; 3, erős. Minden egyes esetben a teljes immunfestés pontszám is ismert, mint a festés index (SI), számítottuk megszorozzuk a pozitív sejtek százalékos aránya a festődés intenzitása pontszám, így kapunk egy értéket 0 és 12. Ebben a vizsgálatban egy optimális cutoff érték volt a következők:: SI < a 8. jelzésére használt alacsony RAGE expresszióját és SI≥8 magas RAGE expresszióját.

statisztikai analízis

a statisztikai elemzést az SPSS statisztikai szoftver (SPSS változat 19.0; SPSS, Chicago, IL, USA). A párosított-mintás t-tesztet alkalmaztunk, hogy összehasonlítsuk a RAGE mRNS és fehérje szinten a rákos és a szomszédos nem-rákos szöveti mintákat. A Mann-Whitney U teszt vagy a Pearson Chi-négyzet tesztet használtuk, hogy összehasonlítsuk a SI pontszámokat kapott immunhisztokémiai elemzést a GC és a megfelelő normális nyálkahártya szövet. A kapcsolat a RAGE expresszió és a klinikopatológiai jellemzők elemeztük a Pearson Chi-négyzet próba. A túlélési görbéket szerint számított Kaplan-Meier módszerrel és elemeztük a log-rank teszt. A Cox-féle regressziós modellt alkalmaztunk egyváltozós és többváltozós elemzés, hogy értékelje a kockázati arány (HR) és azonosítja tényezők megjósolni a túlélést. A kétoldalas p-érték < 0,05 statisztikailag szignifikánsnak tekintettük. Katalógusa

Eredmények katalógusa

túltermelése RAGE humán GC katalógusa

Hogy világosabb szerepét RAGE GC fejlesztés és progresszió, először elemezni expresszióját GC minták és kiegyenlített szomszédos rákos szövetekben az mRNS szintjén. Valós idejű kvantitatív RT-PCR elemzés azt mutatta, hogy a RAGE-ben overexpresszált a legtöbb GC szövetek összehasonlítva a normális társaik (19/30; 63,3%) (1. ábra). RAGE hasonlóképpen upregulált fehérje szintű GC, amint azt a Western-blot és IHC vizsgálatokban. Emelkedett RAGE expressziós szintet találtak a Western blot analízis 26 30 (86,7%), GC képest normál szövetekben (2. ábra). Paraffinba ágyazott blokkok (n = 249) 180 GC beteget vizsgáltunk RAGE fehérje expressziót IHC (1. táblázat). Vagy hiányzik, vagy alacsony festéssel (SI < 8) normál gyomornyálkahártya volt megfigyelhető 55 69 esetben (79,7%), míg a magas festést (SI≥8) volt megfigyelhető a legtöbb GC szövetekben (111/180; 61,7%). RAGE expresszió szignifikánsan magasabb volt GC szövetekben (n = 180; SI = 6,22), mint a normál gyomor szövetekben (n = 69; SI = 2,09; P
< 0,001). Jellegzetes példák a gyenge, mérsékelt, erős festődés (mikrográfokat 200 × nagyítás) ábra mutatja 3.

Egyesülete RAGE expresszióját klinikopatológiai jellemzőkkel

kategóriákon alapul, hogy mi határozza meg az a módszerek fejezetben, az adatok azt mutatják, hogy a magas szintű expresszióját RAGE szignifikáns korrelációt a szövettani grade ( P katalógusa = 0,002), a nyirokcsomó státusz (N stádium, P katalógusa = 0,025), metasztázis állapot (M fázisban P katalógusa = 0,002) és AJCC szakasz ( P katalógusa = 0,020), de nem volt a nem, az életkor, a tumor mérete, helye, Lauren besorolása vagy tumor invázió (táblázat 2). katalógusa

korrelációja RAGE kifejezés alapján IHC és a betegek túlélési katalógusa

A Kaplan-Meier görbe azt mutatja, hogy a betegek nagy RAGE csoportban szignifikánsan rosszabb teljes túlélés, mint a betegek alacsony RAGE csoport ( P &katalógusa 0,001; ábra 4A). A betegek nagy RAGE expresszióját is szignifikánsan rosszabb teljes túlélés, mint az alacsony kifejeződése RAGE a AJCC szakaszban III /IV-alcsoportot (n = 136; P &katalógusa 0,001; 4c), de nem a AJCC szakasz I /II alcsoport (n = 44; P katalógusa = 0,695; 4.b ábra). katalógusa

egy- és többváltozós elemzések katalógusa

az egyváltozós analízis szignifikáns összefüggést az általános túlélés és az életkor, a tumor invázió nyirokcsomóstátus, metasztázis állapot, AJCC színpadi és RAGE kifejezés (lásd 3. táblázat). Mindezek a tényezők szerepelnek a többváltozós Cox modell segítségével állítsa be a hatását a kovariáns. A modell alapján, RAGE expressziós szintek (kockázati arány (HR) = 2,143; 95% konfidencia intervallum (95% CI) = 1,357-3,383; P katalógusa = 0,001) és a tumor invázió (HR = 11,209; 95 % CI = 1,297-96,874; P katalógusa = 0,028) bebizonyosodott, hogy független prognosztikai faktorok (3. táblázat). katalógusa

Vita katalógusa

GC továbbra is az egyik legvégzetesebb emberi daganatok különösen Kelet-Ázsiában. A haladás ellenére, a diagnózis és terápia, a prognózis a gyomorrák még mindig lehangoló és függ egy sor karcinóma jellemzők, mint például a tumor növekedést, differenciálódást, invázió és a távoli metasztázisok [15]. GC tumorigenezis és progressziója kevéssé ismert, komplex, többlépéses eljárások által szabályozott intrinsic és extrinsic celluláris jelek érintő több gén és fehérje változtatások. Rendkívül fontos, hogy azonosítani és megérteni a molekuláris mechanizmusok mögöttes tumor kialakulásában és progressziójában, hogy dolgozzon ki a racionális és a rák-specifikus megközelítések a korai diagnózis és a kezelés a GC. Katalógusa

Ebben a tanulmányban azt vizsgáltuk, hogy a RAGE kifejezés állapotát GC mind az mRNS és fehérje szinten, és megállapította, hogy a RAGE-ben jelentősen fokozódik az emberi GC szövetekben, mint a normál gyomornyálkahártya. IHC analízist végeztünk, hogy tovább igazoljuk az fokozza a RAGE expressziója primer GC. Megfigyeltük, hogy a magas szintű RAGE expresszió szignifikáns összefüggést a szövettani grade, nyirokcsomóstátusz, metasztázis állapotát, és AJCC szakaszában GC, hasonló az előző megállapításokat OSCC és NSCLC [9,10]. Összefoglalva, ezek az eredmények arra utalnak, hogy a RAGE lehet vonni GC progresszióját.

Azt is megállapítottuk, az első alkalom, hogy a RAGE expresszióját egy erős előrejelzője rossz prognózisú GC betegek hasonló megállapítások kolorektális rák, hepatocelluláris rák, OSCC és NSCLC [9,10,16,17]. Azonban prognosztikai RAGE kifejezés tűnik szerint különböznek a rák szakaszban (4. ábra). A jelen vizsgálatban a túlélésre vonatkozó elemzés azt javasolta, hogy a tumor invázió és RAGE expresszióját függetlenül előre az általában gyenge túléléssel. A viszonylag kis esetszám a színpad I. és II csoport lehet felelős a különbség. A legtöbb beteg a GC Kínában diagnosztizáltak az előrehaladott szakaszában hiánya miatt a hatékony korai felismerés. Továbbá, RAGE expresszióját szűkebb 95% CI és úgy tűnik, hogy az AA jobb előrejelzője GC képest tumor invázió ebben a vizsgálatban.

RAGE egy minta felismerés receptor, amely kötődik többszörös ligandumok származó károsodott sejt környezetben, és játszik döntő szerepet játszhat a gasztrointesztinális tumorgenesisben [18]. Szintén fontos a gyulladásos mediátor, RAGE lehetett modulálni közötti áthallás túlélés utak és autofágia a tumorsejtekben és elősegíti a tumor túlélését keresztül fenntartó autofágiát és korlátozza az apoptózist [19]. Kuniyasu és munkatársai katalógusa. [11] arról számoltak be, hogy a RAGE kifejezés szorosan kapcsolódó invázió és metasztázis GC betegeknél, amely biztosítja számunkra, kísérleti jelleggel a funkcionális vizsgálat RAGE gyomorrákban. Ezt követően, Xu és munkatársai [12] kimutatták, hogy a kiütése RAGE csökkentett GC sejtproliferáció és invázió gyomorrák, csökkent expressziója AKT, PCNA és az MMP-2 és indukált apoptózisát, és sejtciklus leállásához. Ezért célzott gátlását RAGE vagy ligandumai szolgálhatnak új célokat, hogy fokozza a jelenlegi rákterápia.

A mai napig, az érték a célzási RAGE a lehetséges korai beavatkozás és a profilaxis GC tisztázatlan marad. Ugyanakkor több tanulmányok kimutatták a szerepét RAGE más ráktípusok és kimutatták, hogy a blokád RAGE csökkent növekedés és metasztázisok mindkét beültetett daganatok és tumorok fejlődő spontán fogékony egerekben. Gátlása RAGE csökkent osztódást mellrák sejtek által indukált apoptózis és gátolja a prosztatarák növekedését [20,21]. RAGE zavar is gátolta az angiogenezis és progressziója colorectalis rák, és meghosszabbította a túlélést hasnyálmirigyrák [22-24]. Blokádja RAGE oldható RAGE (sRAGE) attenuált májkárosodás, és ezáltal javítja a túlélést, ellen védő hepatocelluláris nekrózis, és fokozza a kifejezés a proregenerative citokin tumornekrózis faktor-a [25]. Sőt, Moy és mtsai. [26] talált egy határvonal statisztikailag szignifikáns fordított összefüggést folyamatos sRAGE expozíció és a májrák kockázatát, ami arra utal, hogy sRAGE véd a gyulladásgátló hatás okozta RAGE aktiválást. Ezek az eredmények azt mutatták, hogy következetesen RAGE azt is jár, mint egy potenciális terápiás célpont GC. Tekintettel arra, hogy a biológiai jellemzőit, RAGE és származékai volna tekinthető új mutató malignus potenciállal beleértve GC. A RAGE Gly ^{82Ser polimorfizmus kimutatták, hogy összefüggésbe hozható megnövekedett kockázatával GC fejlődés vagy progresszió egy kórházi alapú eset-kontroll vizsgálat [13]. Katalógusa}

A jelen tanulmányban azt találták, hogy felfokozását RAGE expresszió szignifikáns összefüggést szegény klinikopatológiai jellemzői és az általában gyenge túléléssel, ami arra utal, hogy ez hozzájárulhat a malignus potenciálját GC. Ezért RAGE ezért szolgálhat értékes új biomarker előrejelzésére prognózis és potenciális terápiás célpontot betegek GC. Azonban további vizsgálatok szükségesek, hogy tisztázza a háttere RAGE túltermelése, és ezáltal hozzájárul a jobb megértés és továbbfejlesztésének lehetséges használatát. Katalógusa

Köszönetnyilvánítás katalógusa

Köszönöm Dr. Yan Xiao és Dr. Liang Zhao a Department of Pathology patológiai diagnózis és megerősítését IHC eredményeket. katalógusa

• PLoS One: prognosztikai előkezelés szérum CEA szint gyomorrákban: A meta-analízis, 14651 Patients
• PLoS One: LAPTM4B-35, a rákkal kapcsolatos Gene társul rossz prognózissal TNM szakaszai I-III gyomorkarcinóma Patients