PLoS ONE: prekomjerna ekspresija receptora za glikozilacije krajnjih proizvoda (bijesa) povezana je s lošom prognozom u želučanom Cancer

Sažetak pregled

Pozadina pregled

receptor za napredne glikozilacije krajnjih proizvoda (RAGE) je onkogeni multidisciplinarna trans-membranski receptor koji je prekomjerno izražen na više ljudskih rakova. Nedavno je pokazano da RAGE također u karcinogenezi i tumorske invazije. U ovoj studiji istraživali smo razine ekspresije i prognostičku vrijednost RAGE u osnovnim želučanog karcinoma (GC). Pregled

Metode pregled

istraživali smo ekspresiju RAGE u osnovnoj GC i upareni normalno želučane tkiva stvarnost vrijeme kvantitativni RT-PCR (n = 30) i Western blot analiza (n = 30). Osim toga, proveli smo imunohistokemije na 180 parafin uklopljenih GC primjeraka, 69 podudarnih normalnih primjeraka. Pregled

Rezultati

RAGE je izraženo u GC u usporedbi sa susjednim noncancerous tkiva ( P
<0,001), a više izraz RAGE značajno koreliraju s histološkog stupnja ( P pregled = 0,002), čvora statusa ( P pregled = 0,025), status metastaza ( P
= 0,002), a američki Zajedničko povjerenstvo za rak fazi ( P pregled = 0,020). Nadalje, regulaciju bijesa izražavanja je nezavisni prognostički čimbenik u multivarijatne analize pomoću modela Cox regresijska ( P pregled = 0.001). Pregled

Zaključci

RAGE Prekomjerna ekspresija može biti korisna marker za predviđanje GC napredovanje i lošu prognozu pregled

Izvor:. Wang D, Li T, Ye G, Shen Z, Hu Y, Mou T, i sur. (2015) prekomjerna ekspresija receptora za glikozilacije krajnjih proizvoda (bijesa) povezana je s lošom prognozom u rak želuca. PLoS ONE 10 (4): e0122697. doi: 10,1371 /journal.pone.0122697 pregled

Akademska Urednik: Valli De Re, IRCCS National Cancer Institute, ITALIJA pregled

Primljeno: 22. studenog 2014; Prihvaćeno: 13. veljača 2015; Objavljeno: 10. travanj 2015 pregled

Copyright: © 2015 Wang et al. Ovo je otvoreno pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan pregled

Podaci Dostupnost: sve relevantne podatke su u radu pregled

Financiranje:. Ovaj rad je podržan od strane programa Nacionalnog ključ kliničke medicinske specijalnosti, istraživačkom fondu za javnu dobrobit u zdravstvenoj industriji (No.201402015), glavni program za znanost i tehnologiju Program Guangzhou (No.201300000087), a nacionalni ključ Technology R &D program (No.2013BAI05B00). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled

U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled

Uvod pregled

receptor za krajnji proizvodi uznapredovale glikozilacije (RAGE), molekulu na površini stanice izražen u rasponu od tipova stanica, je multiligand član superfamilije imunoglobulina [1]. RAGE je impliciran u širokom spektru patoloških odgovora, uključujući upale i rak, na temelju različitih njegovih liganada [2]. Kao novonastalu onkogene trans-membranske receptore, pokazano je da su uključene u brojnim humanim karcinomima koji potiču rast, preživljavanje i metastatskog širenja [3]. Nekoliko istraživanja je pokazalo da je RAGE je reguliran i gubi svoje karakteristične granulirani uzorak u primarnim tumorima [4]. Interakcija AGE-RAGE igra ključnu ulogu u razvoju raka prostate, te inhibira ovu interakciju ima potencijal kao novi molekularni cilj za prevenciju karcinoma ili terapije [5]. Co-izraz bijesa i visoke mobilnosti skupina proteina B1 (HMGB1) značajno je povezana s kolorektalnim invaziju i metastaziranje [4,6,7] raka. Osim toga, RAGE izraz korelira s angiogeneze i metastaze tumora u usnoj karcinom pločastih stanica (OSCC), a može biti neovisan prognostički čimbenik za recidiva i prognozu u OSCC bolesnika [8,9]. Osim toga, genetski polimorfizam bijesa gena može biti prediktivni biomarkera koristi za ekran za pacijente osjetljiv na termoterapiji i za procjenu prognoze ne-malih stanica raka pluća (NSCLC) bolesnika [10]. Pregled

Međutim, uloga bijesa kod raka želuca (GC) je ostao nedostižan. RAGE je prethodno već navedeno usko povezana s invaziju i metastaziranje u rakom želuca [11]. Štoviše, to je izvijestio da je blokada bijesa signalizacije potisnuti rast i metastaze želučanih stanica raka [12]. U istragu uloge bijes u GC patogenezi i progresiji i učincima njezinih genskih polimorfizama na funkciju receptora, Gu i kolege [13] su pokazali da RAGE gli ^{82Ser polimorfizam može biti povezana s povećanim rizikom od inicijacije ili progresija želučanog karcinoma. Međutim, da bi naše znanje, odnos između izraza bijesa i GC pacijenta prognozu je nepoznat. Pregled}

U ovoj studiji analizirali smo RAGE razinu ekspresije u GC pomoću realnom vremenu kvantitativni RT-PCR (QRT-PCR), western hibridizacija i imunohistokemijski (IHH). Identificirali smo odnos između izraza bijesa i kliničkopatološkim obilježja GC, a zatim ocjenjuje prognostičku vrijednost bijesa izražavanja za postoperativnom opstanak GC pacijenata. pregled

materijali i postupci

Etika izjava

Ova studija je odobren od strane Etičkog povjerenstva Nanfang bolnice i pismeni informirani pristanak dobiven je od strane svih tih bolesnika koji su uključeni. pregled

Pacijenti i uzorci tkiva

Trideset paru svježe smrznuta želučanog raka i odgovarajući nekancerozno tkivo sluzi (izrezane > 10 cm od ruba GC) uzoraka prikupljeni su iz GC pacijenata unutar 30 min nakon resekcije i odmah pohraniti u tekućem dušiku do upotrebe. Još 180 uklopljeni u parafin GC tkiva blokova i 69 kontrolnih uzoraka iz podudarnih normalnih želučanog tkiva uzetih iz distalnog resekcija margine dobiveni su iz pohranjenih datoteka Odjela za opću kirurgiju, Nangfang bolnica, Southern Medical University, prikupljeni su kirurški između siječnja 2007. i prosinca 2008. U 180 bolesnika uključeno 120 muškaraca i 60 žena u dobi od 22-78 godina (srednja, 55.62 godina). Nijedan od ovih bolesnika su tretirani s radioterapijom ili kemoterapijom prije operacijskog zahvata. Histopatološko tip i stadij reseciranog jedinki određeni su sukladno kriterijima klasifikacije Svjetske zdravstvene organizacije i Zajedničkog odbora američkog protiv raka (AJCC) Rak inscenacije Manual (i 7. izdanje, 2010). Među njima, 125 pacijenata Faza I-III dobio radikal resekciju (19, 25 i 81 za Faze I, II i III, odnosno), te 55-IV faza bolesnici primili palijativni operacije i /ili kemoterapije. Metastaza pogođenim udaljene organe u Stage-IV pacijenata uključenih peritoneuma, udaljeni limfni čvorovi, jetra, poprečno debelo crijevo, jajnika ili jajovoda, gušterača, crijeva, kosti, pluća, mozak i donju šuplju venu. Pacijenti su praćeni do smrti ili zadnji praćenja datuma (30. prosinca 2013). Medijan praćenja put je bio 48 mjeseci (od 2 do 82 mjeseci). Pregled

Ukupno ekstrakcija RNA i real-time kvantitativne RT-PCR pregled

Ukupna RNA se ekstrahira iz mljeveno tkiva s Trizol reagens (Takara, Japan), te reverzno transkribira u prvom lanca cDNA s TaqMan reverzne transkripcije Kit (Takara, Japan). Zatim, 0.5- do 1-ul alikvota cDNA su korišteni kao kalupi za pojačavanje bijes fragment (naprijed: 5 AAACATCACAGCCCGGATTG-3; preokrenuti: 5 TCCGGCCTGTGTTCAGTTTCT-3) pod sljedećim uvjetima: 95 ° C 30 s; 40 ciklusa od 95 ° C tijekom 5 sekundi; 60 ° C 30 s; i otapanje na 95 ° C kroz 5 sekundi, a nakon toga 60 ° C tijekom 1 min, te hlađenja na 50 ° C tijekom 30 sekundi. PCR i prikupljanje podataka su provedena na LightCycler480 System (Roche, Swiss) sa 2 × SYBR Green master mix kit (Invitrogen, Carlsbad, California, SAD). Ekspresija RAGE normalizirana onom GAPDH. pregled

Western blot analiza pregled

Western hibridizaciju provodi se u skladu sa standardnim postupcima kao što je opisano [14]. Ukratko, tkiva su tlo i lizirane s RIPA puferom za lizu, a lizati su skupljene centrifugiranjem (12.000 okretaja u minuti) na 4 ° C tijekom 30 minuta. Koncentracije proteina su određene korištenjem bicinkroniničnoj Acid komplet za određivanje proteina (Pierce, Rockford, IL, USA). Približno 50 ug uzoraka je zatim odvojen elektroforezom na 10% natrij dodecil sulfata (SDS) -polyacrylamide gelove i premješteni na polivinilidenfluorid membrane. Nakon blokiranje ne-specifičnog vezanja, membrana se inkubira s zečjim poliklonskim anti-RAGE antitijelom (Santa Cruz-, CA, USA) u omjeru 1: 1000, na 4 ° C preko noći. Nakon tri ispiranja s TBST (otopina soli puferirana Trisom s Tween-20) tijekom 10 minuta, membrane se inkubiraju sa sekundarnim protutijelom u razrjeđenju od 1: 3000, na sobnoj temperaturi 60 minuta. Proteini su detektirani s hemiluminiscencija sustav (Amersham Pharmacia Biotehnology, Piscataway, NJ, USA), te normalizirana na P-aktin detektira uporabom anti-ljudskog p-aktin antitijelo miša (1: 1000 razrjeđenje, Sigma, St. Louis, MO , USA). pregled

Imunohistokemijska analiza pregled

IHC test je izveden kao što je ranije opisano [12,14]. Ukratko, stakalca su deparafmizirani s dimetilbenzen i rehidrirane gradijentom etanola (100%, 95%, 90%, 80% i 70% etanola) u vodi. Nakon ispiranja s PBS-om (fosfatom puferirana fiziološka otopina) tri puta, stakalca su kuhani u antigena dohvat puferu, 0,01 M natrijev citrat-klorovodične kiseline (pH = 6,0), tijekom 30 min u mikrovalnoj pećnici. Nakon endogena peroksidazna aktivnost ugašena je s 3% H _{2O 2, nakon tri ispiranja PBS-om, nespecifični antitijela vezanje blokirano inkubacijom preparata u 10% normalnom kozjem serumu neimunološkog. Sekcije su zatim inkubirane na 4 ° C preko noći sa zečjim poliklonalnim RAGE protutijelom (Santa-Cruz, CA, USA) u omjeru 1: 400 i potom inkubiraju s peroksidazom iz hrena (HRP) (ChemMateTM DAKO EnVisionTM Detection Kit) na sobnoj temperaturi 30 min. Nakon ispiranja u PBS, sekcije su zatim razvijene korištenjem 3,3-V-Diaminobenzidin (Sigma), opere pod tekućom vodom iz slavine, i lagano negativno hematoksilinom prije dehidracije i stakalca montažu. Eksperimenti Negativne kontrole su proveli zamjene primarnog protutijela s PBS. pregled}

Imunobojanje je analiziran od strane dva nezavisna promatrača (Y.X. i L.Z.) koji su bili zaslijepljeni na ishod pacijenata i drugih kliničkopatološkim parametrima. Sustav detekcije RAGE je ranije [12] što je opisano. Svi uzorci su kategorizirani po mjeri imunoreaktivnost: 0, < 5%; 1, 5% -10%; 2, 10% -50%; 3, 50% -75%; 4 > 75%. Bojenje intenzitet ocijenjena je kao 0, negativna; 1, slab; 2, umjerena; 3, jak. Za svaki slučaj, ukupna ocjena imunološko također poznat kao indeks za bojenje (SI), izračunata je množenjem postotka pozitivnih stanica s rezultatom intenziteta bojanja, čime se vrijednost između 0 i 12. Za potrebe ove studije, optimalna vrijednost granična bio identificiran kao što slijedi: SI < 8 korišten je za označavanje slabu ekspresiju RAGE i SI≥8 visoku ekspresiju RAGE pregled

statistička analiza pregled

statistička analiza izvedena je pomoću SPSS statistički programski paket (SPSS verzija 19,0.; SPSS, Chicago, IL, USA). Uparenim-uzorci t-test je korišten za usporedbu bijes mRNA i proteina u uzorcima kancerogenih i susjednih noncancerous tkiva. Mann-Whitney U test ili Pearson Chi-kvadrat test je korišten za usporedbu SI rezultate dobivene imunohistokemijske analize GC i odgovarajući normalnog tkiva sluzi. Odnos između izražavanja bijesa i kliničkopatološkim karakteristike su analizirani primjenom Pearsonov Hi-kvadrat test. Krivulje preživljavanja izračunate su prema Kaplan-Meier metodi i analizirani pomoću log-rank testa. Cox proporcionalnih rizika regresijski model je korišten za univarijantne i multivarijatne analize ocijeniti omjer rizika (HR) i utvrditi čimbenike koji predviđaju opstanak. Dvostrani p-vrijednost. ≪ 0,05 smatrane su statistički značajne pregled

Rezultati

Prekomjerna ekspresija RAGE u ljudski GC pregled

Da se razjasni uloga RAGE u razvoju GC i napredovanje, prvo smo analizirali svoj izraz u uzorcima GC i uskladiti susjedna noncancerous tkiva na razini mRNA. U stvarnom vremenu kvantitativni RT-PCR analiza pokazala je da RAGE je izraženo u većini GC tkiva u usporedbi s njihovim uobičajenim kolegama (19/30; 63,3%) (Slika 1). RAGE sličan doreguliran na razini proteina u GC, kao što je prikazano Western analizom i IHC ispitivanjima. Povišena razina RAGE izraz pronašao je Western blot analizom u 26 od 30 (86,7%) GCS u usporedbi s normalnim tkivima (Slika 2). Parafin uklopljenih blokovi (n = 249) od 180 pacijenata GC su ispitani na ekspresiju RAGE proteina prema IHC (Tablica 1). Odsutan ili niska bojenje (SI < 8) normalne sluznice želuca zabilježeno je u 55 od 69 slučajeva (79,7%), dok je visoka bojenje (SI≥8) zabilježen je u većini GC tkiva (111/180; 61,7%). RAGE ekspresija bila je znatno viša u GC tkiva (n = 180; SI = 6,22) u usporedbi s normalnim želučanog tkiva (n = 69, SI = 2.09; P pregled < 0,001). Reprezentativni primjeri slabe, umjerene i jake boje (mikroskopa sa 200 puta) prikazane su na slici 3. pregled

Udruga bijesa izražavanja s kliničkopatološkim karakteristike

Na temelju kategorija koje smo definirali u odjeljak Metode, podaci su pokazali da je visoka ekspresija RAGE bilo značajno povezano sa histološkog stupnja ( P pregled = 0,002), čvora statusa (N fazi, P pregled = 0,025), metastaze statusa (M faza, P pregled = 0.002) i AJCC faza ( P pregled = 0,020), ali nije bio uz spol, dob, veličinu tumora, mjesto tumora, Lauren klasifikacije ili invazije tumora (tablica 2). pregled

Korelacija između bijesa izražavanja na temelju IHC i preživljavanje pacijenta pregled

krivulja Kaplan-Meier je pokazala da su pacijenti u visokoj bijesa skupini imali su značajno lošiji ukupno preživljenje od bolesnika u low-RAGE grupa ( P pregled i 0,001; Slika 4A). Pacijenti s visokim bijesa izražavanja također imao značajno lošiji ukupno preživljenje od onih s niskim izražavanja bijesa u AJCC fazi III /IV podskupine (n = 136; P izvoznici &0,001; Slika 4C), ali ne u AJCC faza i /II podskupina (n = 44; p pregled = 0,695; Slika 4B). pregled

univarijantna i multivarijatne analize pregled

Jednosmjerna analiza je pokazala značajnu povezanost između ukupni opstanak i dob, invazija tumora, čvora status, metastaze, AJCC pozornici i izraz RAGE (vidi tablicu 3). Svi ovi faktori su uključeni u više varijacija Cox proporcionalnih rizika modela za podešavanje učinaka kovarijanata. Na temelju ovog modela, razine RAGE izraz (omjer rizika (HR) = 2.143; 95% interval pouzdanosti (95% CI) = 1,357 - 3,383; P pregled = 0,001) i širenje tumora (HR = 11,209; 95 % CI = 1,297 do 96,874; p pregled = 0,028) potvrđeni su kao samostalne prognostičkih faktora (Tablica 3) pregled

Rasprava pregled

GC ostaje jedan od najvažnijih fatalnih humanih malignih bolesti. , pogotovo u istočnoj Aziji. Unatoč napretku u dijagnostici i terapiji, prognoza za rak želuca još uvijek je tužan i ovisi o nizu obilježja karcinoma, kao što je rast tumora, diferencijacije, invazije i udaljenim metastazama [15]. GC tumorigenezi i napredovanje, nedovoljno su poznati, složene, više koraka procesa propisane unutarnju i vanjsku staničnim signalima koji uključuju više gena i proteina promjena. Vrlo je bitno prepoznati i razumjeti molekularne mehanizme u podlozi inicijaciju i napredovanje tumora razvijati racionalno i raka specifične pristupe ranoj dijagnostici i liječenju GC. Pregled

U ovoj studiji ispitivali smo status RAGE izraz u GC na razini mRNA i proteina i otkrili da RAGE je izuzetno reguliran u ljudskim GC tkiva u usporedbi s normalnim želučanog epitela. IHC analiza je provedena da bi se potvrdilo ovo reguliranje prema izrazu bijesa u osnovnoj GC. Uočili smo da je visoka razina bijesa izražavanja znatno je povezan s histološkog stupnja, limfnih čvorova status, status metastaza, te AJCC pozornici u GC, sličan prethodnim nalazima u OSCC i NSCLC [9,10]. Uzeti zajedno, ti rezultati sugeriraju da RAGE mogu biti uključeni u GC napredovanje. Pregled

Također smo utvrdili za prvi put da RAGE izraz je jak pokazatelj loše prognoze za GC pacijenata, slično nalazima u rak debelog crijeva, jetre rak, OSCC i NSCLC [9,10,16,17]. Međutim, prognostički utjecaj bijesa izražavanja čini se razlikuju s obzirom na stadij raka (Slika 4). U ovom istraživanju, analiza preživljenja predložio da tumorske invazije i RAGE izraz neovisno predvidio slabu ukupno preživljenje. Relativno male veličine uzorka u kojoj je fazi I i II skupine mogu biti odgovorni za razlike. Većina bolesnika s GC u Kini su dijagnoze u u naprednim stadijima zbog nedostatka učinkovitog ranog otkrivanja. Osim toga, ekspresija RAGE ima uži 95% CI i čini se da aa bolji prediktor GC odnosu tumorske invazije u ovoj studiji. Pregled

RAGE je uzorak prepoznavanje receptora koji veže više liganada dobivene iz oštećene stanične okruženju, i igra ključnu ulogu u promicanju gastrointestinalni tumourigenesis [18]. Isto kao važan upalni posrednik, RAGE može modulirati preslušavanja između preživljavanja putevima i autophagy u stanicama tumora i promicanje opstanak tumora putem održavanja autophagy i ograničavanja apoptozu [19]. Kuniyasu i sur pregled. [11] su izvijestili da je izraz RAGE je usko povezan s invazijom i metastazama u GC bolesnika, što nam daje eksperimentalnu osnovu za funkcionalnu studiju RAGE u raka želuca. Nakon toga, Xu i suradnici [12] pokazali su da obaranje RAGE smanjene proliferacije GC stanice i invaziju raka želuca, smanjena ekspresija AKT, PCNA i MMP-2, a inducirana staničnoj apoptozi i ciklusa zaustavljanje. Dakle, ciljana inhibicija RAGE ili njegovih liganada može poslužiti kao nove ciljeve za poboljšanje trenutne terapije raka. Pregled

Do danas, vrijednost ciljanja RAGE za moguću ranu intervenciju i prevenciju u GC ostaje nejasno. Međutim, nekoliko studije su pokazale ulogu RAGE u drugih vrsta raka, te su pokazali da je blokada RAGE smanjen rast i metastaze oba ugrađuju tumora i tumora razvijaju spontano kod osjetljivih miševa. Inhibicija RAGE smanjene proliferacije kod stanica raka dojke i prevencije stanične apoptoze i inhibirati rast raka prostate [20,21]. RAGE disfunkcija također inhibira angiogenezu i progresiju raka debelog crijeva, i produžuje preživljavanje kod raka gušterače [22-24]. Blokada RAGE s topivim RAGE (sRAGE) oslabljena oštećenja jetre, čime se poboljšava preživljavanje, štiti od hepatocelularnog nekroze i povećanje ekspresije faktor-a proregenerative tumor citokina nekroze [25]. Štoviše, Moy et al. [26] našli granični statistički značajnu inverznu povezanost između kontinuiranog izlaganja sRAGE i rizika od karcinoma jetre, što sugerira da sRAGE može zaštititi protiv upalnih učinaka uzrokovanih aktivacijom bijesa. Ovi rezultati ukazuju da dosljedno RAGE također mogu djelovati kao potencijalnog terapijskog cilja u GC. S obzirom na svojim biološkim svojstvima, RAGE i njegovi derivati ​​su uzeti u obzir kao novi pokazatelj malignog potencijala, uključujući GC. Bijes gli ^{82Ser Polimorfizam je pokazala da je povezan s povećanim rizikom za razvoj GC ili napredovanja u case-control studija u bolnici na bazi [13]. Pregled}

U ovom istraživanju, otkrili smo da regulaciju bijesa izražavanja znatno je povezana s lošim kliničkopatološkim karakteristikama i lošeg ukupnog preživljavanja, sugerirajući da on može doprinijeti malignog potencijala GC. Dakle, RAGE, mogle bi poslužiti kao vrijedan novi biomarker za predviđanje prognozu i potencijalni terapijski cilj za pacijente s GC. Međutim, daljnja istraživanja imaju jamstvo razjasniti temeljne mehanizme bijesa prekomjernom ekspresijom, čime se doprinosi boljem razumijevanju i daljnjem razvitku potencijalnu uporabu. Pregled

Izvori pregled

Zahvaljujemo Dr. Yan Xiao i dr Liang Zhao iz Odjela za patologiju za patološku dijagnozu i potvrdu rezultata IHC. pregled