PLOS ONE: alto contenido de manosa-lectina de unión antiviral de Pseudomonas fluorescens PFL Pf0-1 promueve la muerte celular de las células del cáncer del estómago MKN28 a través de la interacción con α2-Integrin

Extracto

Novel anti-VIH de la familia de lectina que muestra una estricta especificidad de unión para altas glicanos de manosa se ha encontrado en organismos inferiores. El orthologue bacteriana ha sido identificado en el genoma de Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 y se clonó el gen que codifica una lectina putativo, expresada en Escherichia coli
y se purificó mediante una filtración en gel paso. detección matriz de glicanos de la lectina recombinante, denominado PFL, ha revelado que el PFL reconoce preferencialmente altos glicanos manosa con α1-3 hombre que estaba muy expuesta en la posición D2. En contraste, el enmascaramiento de este hombre con el hombre α1-3 α1-2 afectado profundamente al interacciones lectina-carbohidrato. Disacárido reductor terminal, GlcNAc-GlcNAc de altas glicanos manosa también era esencial para PFL vinculante. PFL mostró una actividad anti-virus de la influenza potente inhibiendo la entrada del virus en las células a las dosis de baja concentración nanomolar. A una concentración micromolar o superior, PFL mostró una citotoxicidad pérdida de la adhesión celular contra las células MKN28 de cáncer gástrico humano que acompaña. La molécula de la superficie celular a la que se une PFL co-precipitado con PFL marcado con biotina y se identificó como la integrina α2 mediante huella de masas de péptidos usando MALDI-TOF espectrometría de masas. Curiosamente, tras el tratamiento con exógeno PFL, integrina α2 en la superficie celular se sometió a la internalización rápida en el citoplasma y se acumula a la región perinuclear, junto con el límite PFL. La consiguiente pérdida de adherencia de las células desencadenaría una vía de señalización que induce la muerte celular anoikis similar. Estos eventos fueron inhibidas eficazmente por el tratamiento previo de PFL con mannnan, lo que indica la implicación de los altos glicanos de manosa sobre la muerte celular inducida por PFL que se desencadenó por interacciones a2 PFL-integrina

Visto:. Sato Y, Morimoto K, Kubo T, K Yanagihara, Seyama T (2012) de alta manosa-lectina de unión antiviral PFL de Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 promueve la muerte celular de las células del cáncer del estómago MKN28 a través de la interacción con la integrina α2-. PLoS ONE 7 (9): e45922. doi: 10.1371 /journal.pone.0045922

Editor: Roger Chammas, Universidad de Sao Paulo, Brasil |

Recibido: May 7, 2012; Aceptado: 27 Agosto 2012; Publicado: 20 Septiembre 2012

Copyright: © Sato et al. Este es un artículo de acceso abierto distribuido bajo los términos de la licencia Creative Commons Attribution License, que permite el uso ilimitado, distribución y reproducción en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan

Financiación:. Esta investigación fue apoyado en parte por una subvención-en-Ayudas para jóvenes científicos (B) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSP) (Grant número 24790101). Los donantes no tenía papel en el diseño del estudio, la recogida y análisis de datos, decisión a publicar, o la preparación del manuscrito

Conflicto de intereses:.. Los autores han declarado que no existen intereses en competencia

Introducción

High lectinas de unión a manosa que se dirigen a glicanos específicos en una superficie de virus son prometedores agentes que inactivan virales potenciales que podrían ser utilizados para la prevención y control de las infecciones de virus [1], [2]. Numerosos lectinas que reconocen específicamente altos glicanos de manosa se encuentran desde varios taxonomía incluyendo bacterias, algas, plantas y animales, y algunos de los cuales se ha demostrado que presentan actividad anti-VIH [3]. Hemos encontrado recientemente una nueva familia de lectina anti-VIH distribuidos en organismos inferiores incluyendo bacterias, cianobacterias y algas marinas [4]. Ellos presentan características comunes, tales como secuencia de multiplicación de muy conservadas dominio N-terminal y exclusivos altos reconocimientos de oligosacáridos de manosa. Algunas lectinas de esta familia como OAA cianobacterias de Oscillatoria agardhii
[4] y de algas rojas ESA-2 a partir de Eucheuma serra
[5] han demostrado que inhiben la entrada del VIH en las células huésped con CE _{50 años de bajo rango nanomolar uniéndose directamente a la cubierta gp120. Por otra parte, una lectina de algas rojas KAA-2 a partir de kappaphycus alvarezii
, que también pertenece a esta familia inhibe la infección de diferentes cepas del virus de la gripe con CE 50 años de bajos niveles nanomolares de una manera independiente de la tensión, a través el reconocimiento de alta oligosacárido manosa en la hemaglutinina envoltura viral de glicoproteína (HA) [6].}

Además de la actividad antiviral potente, eSA-2 muestra diversas actividades biológicas tales como actividad mitogénica para ratón y linfocitos humanos y in vitro
inhibición del crecimiento de células tumorales [7], [8]. Aunque las propiedades biológicas de esta familia de lectina se están haciendo evidentes, las propiedades de los ortólogos bacterianos de Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 y Herpetosiphon aurantiacus
aún quedan por aclarar.

el presente estudio, hemos clonado el gen ortólogo lectina de P. fluorescens
Pf0-1 y la proteína codificada lectina (PFL) se expresó en Escherichia coli
. Functional PFL se purificó con éxito en un alto rendimiento y caracteriza en términos de sus actividades biológicas tales como la actividad antiviral y anti-tumor. Como se predijo a partir de intensa similitud estructural de PFL con otros miembros de esta familia de lectina, PFL exhibe especificidad exclusiva para alta oligosacárido manosa y potente actividad antiviral contra virus de influenza. Por otra parte, PFL muerte celular inducida por anoikis similar de células de cáncer gástrico MKN28 a través de la interacción con la superficie celular de integrina α2.

Materiales y Métodos

Materiales

cultura punzada de PAG. fluorescens
Pf0-1 fue proporcionado generosamente por el Dr. Mark W. Silby (Universidad de Massachusetts Dartmouth, EE.UU.). Los virus de influenza y células de riñón canino Madin-Darby (MDCK) fueron generosamente proporcionadas por el Dr. T. Sakaguchi (Universidad de Hiroshima, Japón): los virus de influenza se cultivaron en el líquido corioalantoidea de huevos de gallina 10 días de edad. células MDCK se cultivaron en medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) suplementado con suero bovino fetal al 10% y penicilina-estreptomicina. Una línea celular de cáncer de estómago, MKN28 fue proporcionado amablemente por el Prof. Suzuki (Universidad Médica de Fukushima, Fukushima, Japón). La línea celular se mantuvo en medio RPMI-1640 (GIBCO, Grand Island, NY) suplementado con 10% de suero fetal bovino (FBS, GIBCO), 100 UI /ml de penicilina G sódica y 100 mg /ml de sulfato de estreptomicina. Otra línea celular de cáncer de estómago, GCIY, se adquirió de RIKEN CELL BANK (Ibaraki, Japón) y se mantiene de la misma manera como se describió anteriormente. Primary normal de las células de hepatocitos humanos (ACBRI 3716) se adquirió de DS Pharma Biomédica (Osaka, Japón) y se mantiene en CS-C medio R kit (DS Pharma Biomedical).

hemaglutinación Ensayo

hemaglutinación ensayo se realizó usando una suspensión al 2% (v /v) de eritrocitos de conejo tratados con tripsina como se describe anteriormente [9]. Brevemente, la suspensión de eritrocitos de conejo nativa se trató con 0,5% de tripsina en solución salina y la mezcla se incubó a 37 ° C durante 60 min. Después de lavar con solución salina, 2% de suspensión de eritrocitos tratados con tripsina se preparó en solución salina. actividad de hemoaglutinación se expresó como un título, el recíproco de la mayor dilución de 2 veces exhibiendo hemaglutinación positiva.

clonación de genes y expresión de lectina PFL

ADN genómico de P. fluorescens
Pf0-1 se utilizó como molde para la clonación de genes de gen PFL. En primer lugar, un conjunto de cebadores de oligonucleótidos, 5'-GGCAGGTCTCCCGAAACTTCAAG-3 'y 5'-AGTCGAACGCCTGAACCTGTTGA-3', que hibrida con aguas arriba y aguas abajo de la región de codificación de PFL, respectivamente, fueron utilizados, y la PCR se realizó utilizando ADN Prime Star la polimerasa (TAKARA). Utilizando el fragmento de PCR amplificado como molde, la PCR posterior se realizó con un cebador directo, 5 'CACCATGTCTAAATACGCAGTGGCA-3', que tenía CACC secuencia adicional para codón ATG de iniciación del gen PFL, y un cebador inverso, 5 'TTACTCTATCTGCCCACGGAAG -3 '(TTA; correspondiente al codón de parada del gen de RFL). Los fragmentos amplificados se ligaron en el vector de expresión pET101 /D-TOPO. El plásmido recombinante se transformó en Escherichia coli
células Top10 (Invitrogen). Los clones recombinantes obtenidos se confirmaron ser una construcción correcta mediante secuenciación de ADN. Los clones funcionales se transformaron en Escherichia coli BL21
Star (DE3) células para la expresión inducible del gen PFL. IPTG con una concentración final de 0,8 mM se añadió en el cultivo transformado para inducir la expresión PFL. Después de 6 h de incubación a 37 ° C, las células se recogieron por centrifugación a 8000 rpm durante 20 min.

Purificación de lectina PFL

Las células bacterianas recogidas se resuspendieron en tampón de fosfato 20 mM ( pH 7,0) que contiene 0,15 M de NaCl (PBS) y se rompieron mediante sonicación. Después de centrifugación a 8000 rpm durante 20 min, una parte alícuota del sobrenadante se sometió a Superose 12 columna (GE Healthcare) equilibrada con PBS. La columna se eluyó con PBS a un caudal de 0,8 ml /min por un modo isocrático. El eluato se monitorizó por absorción a 280 nm y se examinó para la actividad de hemaglutinación, y se agruparon las fracciones activas.

Determinación del peso molecular de PFL

El peso molecular de PFL se determinó por MALDI-TOF MS análisis con un espectrómetro de masas Autoflex (Bruker, Japón) después de la calibración con un kit estándar de masas péptido (Bruker, Japón) usando ácido sinapínico como matriz.

secuencia de ADN análisis de secuencias

nucleótidos se determinaron por el método de terminador de cadena didesoxi usando una versión 3.1 kit de secuenciación BigDye Terminator Cycle (Applied Biosystems). La secuenciación del ADN se realizó utilizando un ABI 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

array análisis de glicanos

PFL fue marcado con Alexa Fluor 488 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, Eugene, OR). especificidad de unión de glicanos de PFL se determinó por los microarrays de glicanos impresos (versión 5.0) de acuerdo con el procedimiento estándar de COREH del Consorcio para Funcional Glycomics (CFG) (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp ). La fluorescencia relativa media en réplicas de seis se calculó el promedio de los cuatro valores después de la eliminación de los valores más altos y más bajos para eliminar algunos de los falsos éxitos con puntos muy altas o bajas. Las barras de error representan el error estándar de la media (SEM), y el% CV es el coeficiente de variación (DE /media) calculado como%.

Actividad anti-influenza de PFL

vitro
actividad anti-influenza a de PFL se determinó por el ensayo de absorción de colorante rojo neutro (NR). Varias concentraciones de PFL se prepararon con DMEM que contiene 10 mg /ml de tripsina en una microplaca de 96 pocillos. A cada pocillo, se añadió virus como una multiplicidad de infección de aproximadamente 0.001 partículas infecciosas por célula. Después de incubar a 37 ° C durante 48 h, se añadieron 100 l de colorante NR (150 g /ml en DMEM) y se incubó adicionalmente durante 2 h. NR colorante incorporada en las células se extrajo mediante la adición de 100 l de 1% acético /50% de etanol ácido. Los pocillos se midieron a 540 nm con un lector de microplacas (1420 contador Multilabel, PerkinElmer, MA, EE.UU.) como un factor de supervivencia del efecto citopático del virus.

inmunofluorescencia Microscopía

La tinción de inmunofluorescencia se realizado para visualizar la inhibición de la entrada de virus de la gripe por PFL. Brevemente, las células MDCK cultivadas en cubreobjetos de vidrio fueron infectadas con A /Udorn /72 a una multiplicidad de infección de aproximadamente 0.001 partículas infecciosas por célula, en presencia o ausencia de 200 nM PFL en DMEM que contenía 10 mg /ml de tripsina. Después de 24 horas de la infección, las células infectadas se fijaron con acetona al 80% durante 5 min. Tras el lavado con PBS, las células se incubaron con anticuerpo monoclonal de ratón anti-HA (HyTest, Turku, Finlandia) a 37 ° C durante 1 h. Después de lavar con PBS, las células se incubaron con anticuerpo isotiocianato de fluoresceína (FITC) de cabra conjugado con anti-IgG de ratón (Anticorps secondaires, Compiègne, Francia) a 37 ° C durante 1 h. Después de lavado adicional PBS, las células se montaron utilizando Vectashield con 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) y se observaron bajo un fluorescencia de microscopio (Olympus BX51, Olympus, Japón).

ELISA ensayo

interacción directa de PFL con el sobre viral glicoproteína hA se ensayó usando un ensayo de immnosorbent ligado a enzimas (ELISA). PFL (5 mg /ml) en tampón de carbonato (pH 9,6) se revistió sobre 96 placas de ELISA pocillos (BD Biosciences, Bedford, MA). Los pocillos se lavaron tres veces con PBS que contiene 0,1% de Tween 20 (PBST) y se bloquearon con 3% de leche desnatada a 37 ° C durante 1 h. Después de lavar con PBST, variando las concentraciones de preparación de la vacuna de HA de la gripe (Astellas, Tokio, Japón) se añadieron a cada pocillo y se incubó a 37 ° C durante 1 h. Después de lavar con PBST, los pocillos se incubaron con anti-HA anticuerpo monoclonal de ratón (HyTest) a 37 ° C durante 1 h seguido por incubación con peroxidasa de rábano picante (HRP) conjugado con anticuerpo anti-ratón IgG de cabra (GE Healthcare, Reino Unido ) a 37 ° C durante 1 h. Posteriormente 3,3 ', se añadió 5,5'-tetrametilbencidina (TMB) (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MI). La reacción se detuvo usando el reactivo TMB parada (Sigma-Aldrich) y la absorbancia a 450 nm se midió utilizando un lector de microplacas (1420 contador Multilabel, PerkinElmer).

proliferación de células tumorales por MTS ensayo

la proliferación celular se cuantificó mediante un ensayo de MTS convencional utilizando CellTiter 96 de células ensayo de proliferación (Promega, Madison, WI). Las células sembradas en microplacas de 96 pocillos se incubaron durante 72 h con diversas concentraciones de PFL en un medio apropiado con 10% de FBS. Las células fueron incubadas con 20 l de reactivo MTS por 1 h a 37 ° C y se midió con un lector de microplacas (1420 contador Multilabel, PerkinElmer) a 490 nm. El efecto de manano de levadura en citotoxicidad de PFL se determinó incubando las células con 5 M PFL en presencia de diversas concentraciones de manano de levadura en medio RPMI 1640 con 10% de FBS durante 72 h, y la viabilidad celular se midió como se describe anteriormente.

Aislamiento de PFL unión molécula (s) en la célula MKN28

PFL se marcó con biotina usando el kit de marcaje con biotina (tecnologías moleculares Dojindo, Japón) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para confluentes MKN28 células sobre cubreobjetos, biotina-PFL (200 mg) y se incubó durante 2 horas a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS frío, las células se rasparon y se lisaron en 800 l de tampón RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, NaCl 150 mM, 1% Nonidet P40, 0,5% desoxicolato de sodio, cóctel inhibidor de la proteasa, 0,1% SDS ). Posteriormente, se añadieron 100 l de perlas de captura de biotina-avidina (Adar Biotech, Israel) al lisado celular y se incubaron durante la noche a 4 ° C con agitación suave. Las perlas se lavaron tres veces con 50 mM Tris-HCl, pH 7,5. proteínas de capturar en perlas se eluyeron con 50 l de tampón de muestra SDS-PAGE (Tris 62,5 mM, pH 6,8, 2% SDS, 10% de glicerol, 1% de mercaptoetanol, 0,003% de azul de bromofenol) durante 15 min a 90 ° C y se sometieron a SDS-PAGE. La banda de proteína específica para la fracción tratamiento PFL se analizó por MALDI-TOF MS después de la digestión en gel con tripsina. En pocas palabras, las bandas de proteína CBB teñidas se cortan y se destiñeron con 25 mM de bicarbonato de amonio que contiene 50% de acetonitrilo. La alquilación reductora se realizó con TCEP 50 mM (Tris [2-carboxietil] fosfina) en bicarbonato de amonio 25 mM, seguido de incubación con 50 mM iodoacetoamide por 1 h. Después de la deshidratación con acetonitrilo, la proteína en el gel se digirió con 10 l de TPCK-tripsina (100 g /ml) en 50 mM de bicarbonato de amonio. La digestión se purificó con punta Zip (Millipore, Japón) y manchado sobre una diana de MALDI. Una l de solución de matriz (α-ciano-4-hydroxycinnapic matriz de ácido [Bruker, Japón] en acetona-etanol [01:02]) se añadió entonces en el lugar. El análisis MALDI-TOF MS se llevó a cabo mediante un espectrómetro de masas Autoflex (Bruker, Japón) después de la calibración con un kit estándar de masas péptido (Bruker, Japón). Los datos de las huellas dactilares de masas péptido fue buscado por el software Mascot (Matrix Science, Japón).

Localización celular del PFL y la integrina α2

MKN28 células se cultivaron en cubreobjetos en una placa de 6 pocillos . Las células en crecimiento en cubreobjetos fueron tratados con 30 mg /ml Alexa488 conjugado PFL en RPMI 1640 y se incubaron durante diferentes períodos de tiempo. Después de lavar con PBS, las células se fijaron con 80% de acetona durante 5 min. Tras el lavado con PBS, las células se incubaron con anticuerpo monoclonal de ratón CD49b α2 anti-integrina /(R & D Systems, MN) a 37 ° C durante 1 h. Después de lavar con PBS, las células se incubaron con anticuerpo de cabra conjugado con Alexa568-anti-IgG de ratón (tecnologías de la vida, Japón) a 37 ° C durante 1 h. Después de lavado adicional PBS, las células se montaron utilizando Vectashield con DAPI (Vector Laboratories) y se observaron bajo microscopio de barrido confocal láser (IX70; Olympus, Japón). Mediante el empleo de la otra línea celular de cáncer gástrico GCIY y las células de hepatocitos humanos normales ACBRI 3716, localizaciones celulares de α2 integrina y Alexa488-PFL se examinaron de la misma manera como se describió anteriormente, y se observaron bajo un microscopio de fluorescencia (Olympus BX51). El efecto de manano de levadura en la localización celular de PFL y integrina α2 se evaluó como sigue. células confluentes MKN28 cultivadas en cubreobjetos en una placa de 6 pocillos se trataron con 20 g /ml de Alexa488-PFL en RPMI 1640 en presencia o ausencia de 700 mg de manano de levadura /ml durante 4 h. Se fijaron las células, se visualizaron usando el anticuerpo CD49b anti-α2 integrina /como se describe anteriormente, y se observaron bajo un microscopio de fluorescencia (Olympus BX51). Efecto de varias lectinas de localización celular de integrina α2 se examinó de manera similar, mediante la incubación de las células MKN28 con 20 g /ml de cada lectina en RPMI 1640 durante 4 h.

Resultados

clonación molecular, expresión y purificación de PFL

Hemos encontrado previamente el genoma de P. fluorescens
Pf0-1 contiene un posible homólogo de anti-VIH de la familia de lectina que se encontró recientemente en organismos inferiores incluyendo bacterias, cianobacterias y algas marinas [4]. Basándose en la secuencia de nucleótidos de lectina hipotético de P. fluorescens
Pf0-1 en la base de datos, conjuntos de cebadores fueron diseñados para amplificar el gen de la lectina. gen de la lectina putativo fue clonado con éxito por el sistema de clonación TOPO direccional, y la proteína heteróloga de codificación se expresó en E. coli
BL21 (DE3). La proteína lectina expresado se purificó hasta la homogeneidad por un solo paso de filtración en gel en una columna de Superose 12 (Fig. 1A). El pico activo con la actividad de hemaglutinación dio una única banda de proteína de 13 kDa en SDS-PAGE (Fig. 1B). Por último, a partir de 1 litro E. Se obtuvo coli Francia culture, de alto rendimiento de la lectina purificada (240 mg). La lectina purificada fue nombrado PFL y se utiliza un examen más detenido. La masa molecular de PFL (13.883,7) determinado por MALDI-TOF MS estaba de acuerdo con la masa calculada (13.881,1) a partir de la secuencia de aminoácidos deducida y que el valor estimado por la movilidad en SDS-PAGE.

La deduce secuencia de aminoácidos de PFL albergaba dos dominios homólogos, cada uno compuesto de las mitades de N- y C-terminales con 62% de identidad de secuencia entre ellos. PFL exhibió una alta homología de secuencia con OAA lectina de cianobacterias de Oscillatoria agardhii
, algas rojas lectina ESA-2 a partir de Eucheuma serra
, y lectina bacteriana MBHA de Myxococcus xanthus gratis (Fig . 2B), que constituyen una nueva familia de lectina anti-VIH. La masa molecular de PFL y OAA fueron similares, 13883.7 y 13924.1, respectivamente, y ambas lectinas se compone de 132 aminoácidos. Tanto PFL y OAA tienen una propiedad común en su secuencia de duplicación pero OAA pantallas de mayor grado de identidad de secuencia interna con 75% entre los dos dominios repetidos. Por el contrario, ESA-2 y MBHA están compuestos de cuatro dominios homólogos repetidos en tándem de 67 aminoácidos. Los grados de similitud de OAA, la ESA-2 y MBHA con PFL en sus porciones N-terminal (cada 132 residuos) de las secuencias de aminoácidos fueron 62,1, 61,4, y 62,1% para los aminoácidos idénticos, respectivamente.

especificidad de unión a carbohidratos de PFL

para determinar la especificidad de unión a carbohidratos de PFL, el análisis conjunto de glicanos se realizó en el Consorcio para funcional Glycomics utilizando matriz impresa versión 5.0. De los 611 tipos de oligosacáridos ensayados, PFL (10 mg /ml) mostró especificidad exclusiva para altas glicanos de tipo manosa como se muestra en la Fig. 3. La lista completa de oligosacáridos a prueba y los resultados se pueden encontrar en línea en (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp).

PFL ligada fuertemente a glicanos M6 (216 ) y glicano M8 (212), ambos de los cuales tienen un hombre α1-3 expuesto en el brazo D2, con los niveles similares de valores RFU altos, 43471 y 40759, respectivamente. En contraste, el enmascaramiento de este hombre con el hombre α1-3 α1-2 deteriora dramáticamente la interacción entre PFL y los glicanos. Esto fue más evidente por una comparación de M6 glicano (216) y glicano M7 (211), donde el hombre α1-2 adicional en el brazo D2 disminuyó la potencia de unión a aproximadamente 53%. Del mismo modo, la potencia de unión de PFL a glicano M9 (213) se redujo (RFU = 8,535) en comparación con su contraparte glicano M8 (212) que carece de terminales D2 α1-2 Man, que muestra sólo el 21% de la potencia. Curiosamente, la eliminación del disacárido reductor terminal, GlcNAc-GlcNAc de altas glicanos manosa disminuye mucho drásticamente PFL vinculante. Por ejemplo, la potencia de unión PFL fue casi completamente abolida a los glicanos 316 y 317 que no tienen secuencia de GlcNAc-GlcNAc, mientras que los glicanos homólogo 212 y 213, respectivamente, mostraron mucho más alta potencia. La importancia de la terminal de GlcNAc-GlcNAc se confirmó adicionalmente mediante la comparación de los glicanos 217 y 315, aunque el grado de deterioro de PFL de unión era limitado. Esta lectina estaba desprovista de monosacárido de unión incluyendo manosa. Por otra parte, PFL no interaccionan con Hombre Hombre α1-6 (314) y manotriosa (214), que son componentes de la parte ramificada de alto glicanos manosa. Pentasacárido núcleo de N-glicanos (50) no fue reconocida por PFL pero su contraparte fucosilado (485) que se muestra la interacción débil (RFU = 746). Estos perfiles de oligosacáridos de unión de PFL eran estrechamente similares a los de OAA, ESA-2 y KAA-2 que pertenecen a un nuevo anti-VIH de la familia de lectina en organismos inferiores [4] - [6].

Anti- virus de la gripe actividad del PFL

actividad del virus de la gripe de anti-PFL se evaluó con dos cepas de virus de la gripe, A /Udorn /72 (H3N2) y A /Beijing /262/95 (H1N1) por la absorción de colorante NR ensayo. PFL efectivamente inhibe el efecto citopático provocado por ambas cepas virus de la gripe, con CE _{50 años de 19,4 ± 1,5 nM, y 4,5 ± 0,4 nM, respectivamente (Fig. 4A). Para confirmar que PFL inhibe el paso inicial de la entrada del virus de la gripe en las células, se observó la distribución de los antígenos virales en las células infectadas en presencia o ausencia de PFL mediante microscopía de inmunofluorescencia. Higo. 4B muestra la distribución del antígeno viral después de 24 h después de la infección con A /Udorn /72 detectada por el anticuerpo específico anti-hemaglutinina. PFL inhibe eficazmente la entrada del virus de la gripe en las células mientras que los virus fueron capaces de penetrar y replicarse en las células huésped en ausencia de PFL. Un PNA galactosa lectina específica de Arachis hypogaea
no inhibir la entrada del virus en las células. Estos resultados sugieren la presencia de altos glicanos de manosa en la superficie del virus en la posición crítica para la entrada del virus en las células. Para probar si PFL sería unirse directamente a la envoltura viral de glicoproteína HA, un ensayo de ELISA se realizó con preparación de la vacuna disponible comercialmente que contiene HA de A /California /7/09 (H1N1), A /Victoria /210/09 (H3N2), y B /Brisbane /60/08 como un componente principal. Como se demuestra en la Fig. 4C, se observó unión de HA a PFL-dependiente de la dosis.}

PFL muerte celular inducida de células de cáncer gástrico humano MKN28

in vitro
efecto antitumoral del PFL en celular de cáncer gástrico MKN28 se evaluó mediante el ensayo de MTS convencional. Como se muestra en la Fig. 5A (panel izquierdo), PFL mostró un efecto dependiente de la dosis sobre la proliferación de células MKN28. En 72 h post PFL-tratamiento, la viabilidad celular se redujo significativamente a dosis de 0,5 M o superior. Por el contrario, a las dosis bajas de 0,1-0,3 M, la proliferación celular se estimuló ligeramente. La muerte celular inducida por PFL de células MKN28 fue acompañada por una pérdida de la adhesión celular a la parte inferior de placa de cultivo, como se muestra en la Fig. 5B, donde se observaron clúster vuelto hacia afuera de las células como líneas de color marrón. La muerte celular inducida por PFL se inhibió de manera efectiva en presencia de manano de levadura, una glicoproteína teniendo altas oligosacáridos de manosa (Fig. 5A, panel derecho). Esto indica que los altos glicanos de manosa sobre las células MKN28 se implican en la señalización celular inducida por PFL que en última instancia conduce a la muerte celular. En contraste, las células de hepatocitos humanos normales (ACBRI 3716) eran relativamente resistentes al tratamiento PFL en comparación con MKN28 células (Fig. 5A, panel izquierdo).

Aislamiento de molécula (s) PFL vinculante sobre células de cáncer gástrico humano MKN28

para abordar el mecanismo molecular por el cual PFL induce la muerte celular de células MKN28, molécula (s) de la superficie celular a la que PFL unidos se investigó. Biotinilado PFL se incubó durante 2 h con MKN28 células y las células se lisaron con tampón RIPA que contiene 0,1% de SDS. La molécula (s) de la superficie celular a la que la biotina-PFL unidos se co-precipita con perlas recubiertas con avidina. Las proteínas atrapadas en perlas se eluyeron posteriormente con tampón de muestra SDS-PAGE y se analizaron en SDS-PAGE (Fig. 6A). Aunque se detectaron varias bandas no específicas, se observó una banda de 150 kDa que detecta específicamente en PFL fracción tratada. Esta banda se sometió adicionalmente a la digestión en gel de tripsina seguido por el análisis de espectrometría de masas MALDI-TOF. Los datos de huellas másicas de péptidos obtenidos (Fig. 6B) Se realizaron búsquedas de base de datos y la proteína se identificó como la integrina α2, con puntuaciones basadas La probabilidad de 57 (p < 0,05).

Localización celular de forma exógena añadió PFL y integrina α2

Los comportamientos de sí mismo PFL y α2 integrina tras el tratamiento con PFL se examinaron usando un microscopio confocal de fluorescencia. En este experimento, se utilizó marcado fluorescente PFL (Alexa488-PFL) para rastrear la localización PFL. Un Alexa488-PFL se incubó con MKN28 células durante 1, 5 y 24 h a dosis de 30 mg /ml. α2 de integrina se detectaron con el anticuerpo monoclonal anti-α2 integrina /CD49b seguido de segundo anticuerpo conjugado con Alexa568. Curiosamente, Alexa488-PFL unido a la superficie celular y la internalización inició a citoplasma dentro de 1 h (Fig. 7). α2 integrina que se localiza predominantemente en la superficie celular en estado de equilibrio también se sometió a la internalización, y de manera importante, la localización de la integrina α2 coincidió bien con PFL. Después de 5 h de incubación, tanto PFL y integrina α2 fueron co-localizados y acumulan en la región perinuclear y una incubación adicional básicamente no alterar la localización de ambas proteínas. Por tanto, es probable que una vez PFL obligado a integrina α2, ambas proteínas nunca han sido reciclada de nuevo a la superficie celular. el tráfico intracelular rápida del complejo α2 PFL-integrina se produjo cubreobjetos incluso en colágeno I recubierto (datos no mostrados). Del mismo modo, se observó la redistribución de la integrina α2 tras el tratamiento con PFL en otra línea celular de cáncer gástrico, GCIY, pero no en células de hepatocitos humanos normales, ACBRI 3716 (Fig. 8). En 3716 ACBRI células, la internalización de PFL no se observó posiblemente por la menor expresión de la integrina α2 en la superficie celular.

La participación de altos glicanos de manosa en la interacción α2 PFL-integrina

Para probar si celular redistribución de la integrina α2 causada por PFL se pueda derivar de una interacción específica de PFL con altos glicanos de manosa en la integrina α2 molécula, hemos evaluado el efecto de manano de levadura en inducida por PFL internalización integrina α2 utilizando células MKN28. En ausencia de manano de levadura, ambas proteínas se sometieron a la internalización significativa (Fig. 9A, paneles superiores). Por el contrario, en presencia de manano de levadura, PFL no para unirse a la superficie celular, y el tráfico intracelular subsiguiente de PFL se abolió completamente (Fig. 9A, inferior derecha). Estando de acuerdo con esta observación, la integrina α2 no cambió su localización en la presencia de levaduras manano (Fig. 9A, abajo a la izquierda). Estos resultados indican claramente que PFL une a la integrina α2 a través del reconocimiento de los altos glicanos de manosa en la integrina α2. Para confirmar aún más el requisito de altos glicanos de manosa para la integrina redistribución α2, hemos probado el efecto de varias lectinas de localización celular de integrina α2. Como se muestra en la Fig. 9B, otras lectinas con especificidades diferentes, tales como la galactosa vinculante PNA de Arachis hypogaea
, fucosa vinculante de AOL Aspergillus oryzae
, fijación de ácido siálico de MAM Maackia amurensis
, D-GlcNAc-UDA unión de Urtica dioica
no afectó a la localización de la integrina α2. Curiosamente, a pesar de unión de alta manosa lectinas, tales como lectina de unión a manosa una monocotiledónea (Man), GNA de Galanthus nivalis
no mostraron ningún cambio significativo en la integrina α2. Por el contrario, la unión de alta manosa lectina leguminosa ConcanavalinA (Con A) distorsiona la disposición de la integrina α2 como lo hizo PFL.

Discusión

En este estudio, hemos evaluado la actividad biológica de la nueva lectina bacteriana PFL de P. fluorescens
Pf0-1 que pertenece a la familia contra el VIH lectina reciente que se encuentra en organismos inferiores. Ocurrencia de aumento de cepas del virus de la gripe resistentes a los medicamentos, así como nuevas cepas del virus altamente patógenos como el H5N1 aviar nos llevó a explorar PFL como un agente anti-nuevo de la influenza. PFL mostró que la actividad anti-virus influenza potente y el mecanismo por el cual PFL inhibe la replicación del virus fue la inhibición de la etapa inicial de la entrada del virus en las células. Lo más probable es que PFL ejerce actividad anti-influenza mediante la unión selectiva a las altas glicanos de manosa en la envoltura viral HA, como se demostró en ELISA ensayo [9]. De hecho, el sitio específico de ocurrencia alta de oligosacáridos de manosa ha mostrado en la región de HA cerca del sitio de unión al receptor [10].

Para explorar el efecto antitumoral de PFL, se empleó la línea celular de cáncer gástrico humano MKN28 cuales se origina a partir de un tumor de tipo intestinal moderadamente diferenciado. La lectina de algas rojas ESA-2, que pertenece a la misma familia de lectina con PFL exhibió efecto antitumoral tanto in vitro
y in vivo
[7], [8]. ESA-2 es una proteína derivada de la alga comestible y se espera que ejerza efecto anti-tumor en el cáncer del tracto gastrointestinal por administración oral. Es notable que PFL promueve la muerte celular de células MKN28, exclusivamente a través de un reconocimiento de altas glicanos de manosa en la molécula de integrina α2, que predominantemente situado en la superficie celular en el estado estacionario. integrinas heterodiméricas actúan no sólo como molécula de anclaje para fijar las células a una matriz extracelular apropiado (ECM), sino también como sensores del entorno de ECM [11].

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