Buch vun der Woch anti-HIV lectin Famill déi e strenge weist verbindlech Spezifizitéit fir héich mannose glycans gouf am ënneschten Organismen fonnt. D'bakteriell orthologue huet am Nepgen vun identifizéiert ginn Pseudomonas fluorescens VerfÜgung Pf0-1 an der Gentherapie eng putative lectin coding war gekloonten, ausgedréckt an Escherichia belaascht VerfÜgung an Dir sidd ee Schrëtt gelies filtration. Glycan vill Kontroll vun der recombinant lectin, Limburg PFL, huet opgedeckt, datt PFL erkennt zéien héich mannose glycans mat α1-3 Man déi héich um D2 Positioun ausgesat war. Am Géigesaz, baut vun dëser α1-3 Man mat α1-2 Man dramatesch leider lectin-rechnen Interaktiounen. Reduktioun Uschloss disaccharide, GlcNAc-GlcNAc vun héich mannose glycans war och wichteg fir PFL-verbindlech. PFL zougedréckt engem mächtegst Virus Aktivitéit anti-influenza vun de Virus Element an Zellen am Dosis vun niddereg nanomolar Konzentratioun inhibiting. Op micromolar Konzentratioun oder méi héich, zougedréckt PFL engem cytotoxicity accordéiert Verloscht vun der Zell Haftung géint mënschlech Zellen gastric Kriibs MKN28. D'Zell Uewerfläch Protein zu deem PFL gebonnen war Co-Trick mat biotin-Label PFL an als integrin α2 vun peptide Mass fingerprinting benotzt MALDI-Ënnerportal Mass spectrometry identifizéiert. Intriguingly, op Behandlung mat exogenous PFL, integrin α2 op der Zell Uewerfläch mécht rapid internalization zu der Zytoplasma an drëtten zu perinuclear Regioun, zesumme mat der Verbindlechkeet PFL. Déi doraus resultéierend Verloscht vun Zell onvergläichleche géif e sécher Passerelle Iwwerleeung, datt anoikis-wëll Zell Doud entschlof. Dës Evenementer huet effektiv vun pretreatment vun PFL inhibited mat mannnan, beweist d'Bedeelegung vun héich mannose glycans op PFL-entschlof Zell Doud vum PFL-integrin α2 Interaktioune ausgeléist gouf VerfÜgung Fro:. Sato Y, Morimoto K, Kubo T, Yanagihara K, Seyama T (2012) High Mannose-verbindlech Antiviral Lectin PFL vun Pseudomonas fluorescens VerfÜgung Pf0-1 Zell Doud vun Gastric Cancer Zell MKN28 via Zesummespill mat α2-Integrin förderen. PLoS NËMMEN 7 (9): e45922. Doi: 10.1371 /journal.pone.0045922 VerfÜgung Redakter: Roger Chammas, Universidade de São Paulo, Brasilien VerfÜgung Arnaque: 7. Mee 2012; Akzeptéiert: 27. August 2012; Publizéiert: 20. September 2012 VerfÜgung Copyright: © Sato et al. Dëst ass eng oppen-Zougang Artikel ënnert de Bedingunge vun der Lizenz BY Creative Commons verdeelt, déi bereet benotzen Genehmegungen, Distributioun, an Reproduktioun vun all mëttelgrouss, gëtt d'Original Auteur an d'Quell Kaiser sinn VerfÜgung Funding:. Dëst Fuerschung ënnerstëtzt gouf am Kader vun enger Grant-zu-Hëllef fir Young Wëssenschaftler (B) aus der Japan Society fir d'Promotioun vun Science (JSPS) (Grant Nummer 24790101). D'funders hu keng Roll am Etude Design, Daten Kollektioun an Analyse, Décisioun, oder Virbereedung vun der mëttelalterlech Handschrëft ze publizéieren VerfÜgung Wettsträit Interessen:.. D'Auteuren hunn deklaréiert, datt keng Competitioun Interessen existéieren VerfÜgung Héich mannose-verbindlech lectins déi spezifesch glycans op engem Virus Uewerfläch Zil- verspriecht Potential Haren-inactivating Agenten, datt fir d'Preventioun an der Kontroll vun Virus Aids gebraucht ginn [1], [2]. Vill lectins datt héich mannose glycans speziell erkenne sinn aus verschiddenen Lieserbréif och Bakterien, Algen, Planzen an Déieren, an e puer vun deenen ze weise Aktivitéit anti-HIV gewise gi muss fonnt [3]. Mir hu fonnt kuerzem eng Verfilmung anti-HIV lectin Famill am ënneschten Organismen anerem Bakterien verdeelt, cyanobacteria an Séifaart Algen [4]. Si weise gemeinsam Charakteristiken, wéi entsteet ëmmer méi héich conserved N-Uschloss Domain an exklusiv héich mannose oligosaccharide recognitions. Verschidde lectins zu dëser Famill wéi cyanobacterial OAA vun Oscillatoria agardhii VerfÜgung [4] a rout algal ESA-2 vun Eucheuma Serra VerfÜgung [5] APESS der HIV Element an der Provider Zellen ze inhibit mat CE 50s vun niddereg nanomolar Gamme vun direkt bindend gp120 zu fonnt. Doriwwer eraus, e roude algal lectin KAA-2 vun Kappaphycus alvarezii VerfÜgung, déi och zu där Famill gehéiert bremst Wonn vun verschiddenen influenza Virus analyséieren mat CE 50s vun niddereg nanomolar Niveauen an enger Deformatioun-onofhängeg Manéier, duerch d'Unerkennung vun héich mannose oligosaccharide op d'Haren Enveloppe glycoprotein hemagglutinin (ophaalen) [6]. VerfÜgung Nieft der mächtegst antiviral Aktivitéit, ESA-2 weist verschidde biologesch Aktivitéiten wéi mitogenic Aktivitéit fir Maus a mënschlech lymphocytes a kënschtlech VerfÜgung Wuesstem inhibition vun entholl Zellen [7], [8]. Obwuel biologescher Eegeschafte vun dëser lectin Famill offensichtlech sinn erwächt, aus den Eegeschaften vun bakteriell orthologues fluorescens Pseudomonas VerfÜgung Pf0-1 a Herpetosiphon aurantiacus VerfÜgung nach Souzesoen gin bleiwen. VerfÜgung An de Moment studéieren, hunn mir d'orthologue lectin Gentherapie vun P gekloonten. fluorescens VerfÜgung Pf0-1 an der kodéiert lectin FAQ (PFL) war am Escherichia belaascht VerfÜgung ausgedréckt. Funktionell PFL war an héije Rendement erfollegräich sidd a wat vun hir biologesch Aktivitéiten wéi antiviral an Anti-entholl Aktivitéit charakteriséiert. Wéi aus den intensive strukturell Ähnlechkeet vun PFL mat anere Membere vun dëser lectin Famill virausgesot, Schatzkummer PFL exklusiv Spezifizitéit fir héich mannose oligosaccharide a mächtegst antiviral Aktivitéit géint Aha. Ausserdeem, PFL anoikis-wëll Zell Doud vun gastric Kriibs Zell MKN28 via dÉxistenz Zell Uewerfläch integrin α2 entschlof. VerfÜgung spontan VerfÜgung epilepteschen Kultur vun P. fluorescens VerfÜgung Pf0-1 war vun Dr. Mark W. Silby (Universitéit vu Massachusetts Dartmouth, USA) generéis gëtt. Aha an Madin-Darby canine Nier (MDCK) Zellen sech generéis vum Dr. T. Sakaguchi (Hiroshima University, Japan) gëtt: D'Aha waren an der chorioallantoic Valoriséierung vun 10-Dag-al Poulet Eeër ugebaut. MDCK Zellen sech am Dulbecco d'geännert Eagle mëttelfristeg (DMEM) ergänzt mat 10% An et Bovine serum an penicillin-streptomycin ugebaut. A Mo. Kriibs Zell Linn, MKN28 war Audit vum Prof. Suzuki (péckt Medical University, péckt, Japan) gëtt. D'Zell Linn war zu RPMI-1640 mëttelfristeg (GIBCO, Grand Island, NY) ergänzt mat 10% An et Bovine serum (FBS, GIBCO), 100 IU /ML penicillin G Natrium, an 100 mg /ML streptomycin sulfate haten. Aner Mo. Kriibs Zell Linn, GCIY, war aus RIKEN CELL BANK (Ibaraki, Japan) an haten an déi selwecht Manéier kaaft wéi uewe beschriwwen. Primärschoul normale Mënsch hepatocyte Zell (ACBRI 3716) war vun DS Pharma Biomedical (Rekorder, Japan) an haten an CS-C mëttelfristeg Kit R (DS Pharma Biomedical) kaaft. VerfÜgung Hemagglutination Assay VerfÜgung Hemagglutination assay war mat engem 2% (v /v) Ophiewe vun trypsin-behandelt Kanéngchen erythrocytes standing wéi virdru beschriwwen [9]. Kuerz, war Kanéngchen gebierteg erythrocyte Ophiewe mat 0,5% trypsin zu Salins an d'Mëschung bei 37 ° C fir 60 min incubated behandelt. Nom Wäschen mat Salins, 2% trypsin-behandelt erythrocyte Ophiewe war zu Salins virbereet. Hemagglutination Aktivitéit war als titer, déi béide Säite vun der héchster 2-fantastesch dilution suer- positive hemagglutination ausgedréckt. VerfÜgung Gene Biologie an Ausdrock vun lectin PFL VerfÜgung Frankräich DNA vun P. fluorescens VerfÜgung Pf0-1 war wéi e Skelett fir Gentherapie Klone vun PFL Gentherapie benotzt. Um éischte, engem oligonucleotide primer virbereet, 5'-GGCAGGTCTCCCGAAACTTCAAG-3 'an 5'-AGTCGAACGCCTGAACCTGTTGA-3 ", déi mat Offloss a gouf vun der PFL coding Regioun hybridized, goufen respektiv, benotzt ginn, an den Hinnen alleguer war benotzt Premier STAR DNA gesuergt polymerase (TAKARA). Benotzen d'Implikatioune Hinnen alleguer ofgesprengt als Skelett, war d'IP Hinnen alleguer mat engem Stiermer primer gesuergt, 5'-CACCATGTCTAAATACGCAGTGGCA-3 ", déi bis ATG Start codon vun der PFL Gentherapie CACC zousätzlech leien haten, an ëmgedréint primer, 5'-TTACTCTATCTGCCCACGGAAG -3 "(TTA; entspriechend codon vun der RFL Gentherapie ze stoppen). Implikatioune Fragmenter waren an pET101 /D-anerer Sprooch Ausdrock Vecteure Jonglenster. D'recombinant plasmid war vun transforméiert Escherichia belaascht VerfÜgung TOP10 Zellen (Invitrogen). Déi kritt recombinant clones confirméiert korrekt bauen vun DNA sequencing gin. Déi funktionell clones waren an transforméiert Escherichia belaascht VerfÜgung BL21 Star (DE3) Zellen fir inducible Ausdrock vun der PFL Gentherapie. IPTG mat engem Finale Konzentratioun vun 0,8 mm huet an der transforméiert Kultur notéiert der PFL Ausdrock ze induce. No 6 h incubation bei 37 ° C, goufen d'Zellen vun centrifugation bei 8.000 Ziichter fir 20 min recoltéiert. VerfÜgung Offäll vun lectin PFL VerfÜgung D'recoltéiert bakteriell Zellen vun 20 mm phosphate gefiermt resuspended waren ( pH 7.0) mat 0,15 M NaCl (PBS) a sech duerch sonication erofgaangen. No centrifugation fir 20 min bei 8.000 Ziichter, eng aliquot vun der supernatant war haut 12 Kolonne (GE Gesondheetswiesen) mat PBS equilibrated zu Superose. D'Kolonn war bei engem Flux Taux vun 0,8 mat PBS eluted ml /min duerch eng isocratic Modus. D'eluate war vun Tellur am 280 nm iwwerwaacht a fir hemagglutination Aktivitéit iwwerpréift, an déi aktiv ufale hinzeginn goufen. VerfÜgung cuisine Gewiicht Entschlossenheet vun PFL VerfÜgung D'molekulare Gewiicht vun PFL war vun MALDI-Ënnerportal sech MS Analyse mat enger Autoflex Mass Spektrometer (Bruker, Japan) no der Eechung mat engem peptide Mass Standard Kit (Bruker, Japan) benotzt sinapinic Seier als Matrixentgasung. VerfÜgung DNA Haaptrei Analyse VerfÜgung Nukleotid Message mat enger Versioun BigDye Terminator 3,1 Cycle Sequencing Kit sech duerch d'dideoxy Kette terminator Method sech (Obwuel Biosystems). DNA sequencing war mat engem Abi 310 genetesch Organer (Obwuel Biosystems) gesuergt. VerfÜgung Glycan vill Analyse VerfÜgung PFL mat Alexa Fluor 488 Fortgeschratten war no den Hiersteller d'Instruktioune (Invitrogen, Eugene, OR). Glycan bindend Spezifizitéit vun PFL war fir Fonctionnement Glycomics (CFG) vun der gedréckter glycan microarrays (Versioun 5.0) laut der Norm Prozedur vun CoreH vun der Consortium alles (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp ). D'Moyenne relativ fluorescence zu gefaart vu sechs war vun averaging véier Wäerter berechent no héchsten an déifst Wäerter leeën mat Ganz héich oder niddreg Punkten puer vun deenen falschen Hits eliminéiert. De Feeler Baren vertrieden Standard Feeler vun der heeschen (Sem), an% CV ass souguer gemaach ginn vun Variant (Fils /heeschen) als% berechent. VerfÜgung Anti-Influenza Aktivitéit vun PFL VerfÜgung An kënschtlech VerfÜgung anti-influenza Aktivitéit vun PFL war vun der neutral rout (Reen) Hoerfaarw Notzong assay alles. Verschidde Konzentratioune vun PFL sech bereet mat DMEM mat 10 μg /ml trypsin zu engem 96-Meter microplate. Fir all gutt, war Virus wéi eng Zuel vun Wonn vu ronn 0,001 ustiechend Deelecher pro Zell notéiert. Nom fir 48 h op 37 ° C incubating, 100 μl vu gudde Verhalt Hoerfaarw (150 μg /ml zu DMEM) ugebaut a weider fir 2 h incubated. Gudde Verhalt Hoerfaarw an d'Zellen Uerden war vun der Zousätzlech vun 100 μl vun 1% acetic Seier /50% Ethanol ofgebaut. De Wells sech um 540 nm mat engem microplate Lieser gemooss (1420 multilabel Konter, PerkinElmer, MA, USA) als e Faktor Effet vum Virus cytopathic Eos. VerfÜgung Immunofluorescence Microscopy VerfÜgung Immunofluorescence staining war standing der Entrée inhibition vun influenza Virus vun PFL ze visualiséieren. Kuerz, op Cover Glas ugebaut MDCK Zellen sech bei enger Zuel vun Wonn vu ronn 0,001 ustiechend Deelecher pro Zell, an d'Presenz oder Feele vun 200 nm PFL zu DMEM mat 10 μg /ml trypsin mat A /Udorn /72 infizéiert. No 24 h Post Wonn, waren d 'Krankheet Zellen fir 5 min mat 80% acetone fest. Nom Wäschen mat PBS, goufen d'Zellen mat Maus monoclonal anti- ophaalen antibody (HyTest, Turku, Finnland) bei 37 ° C fir 1 h incubated. No mat PBS wäschen, goufen d'Zellen mat fluorescein isothiocyanate (FITC) -conjugated Geess anti-Maus IgG antibody (Anticorps Secondaires, Compiègne, Frankräich) bei 37 ° C fir 1 h incubated. No weideren PBS wäschen, goufen d'Zellen mat Vectashield mat 4 'Descher, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (Vecteure Laboratoiren, Burlingame, CA) a sech ënner engem fluorescence-microscope (OLYMPUS BX51, Olympus, Japan) observéiert. VerfÜgung Elisa assay VerfÜgung Direct Interaktioun vun PFL mat Haren Enveloppe glycoprotein ophaalen war mat enger Aktivitéit-Hausnummeren assayed immnosorbent assay (Elisa). PFL (5 μg /ml) am kënne Prellbock (pH 9.6) gouf op 96 gutt Elisa Placke (BD Biosciences, Bedford, MA) bedeckt. De Wells waren dräi Mol gewäsch mat PBS 0,1% Tween20 (PBST) a konnt mat 3% z'iesse Mëllech bei 37 ° C fir 1 h mat. Nom Wäschen mat PBST, verännerlech Konzentratioune vun influenza ophaalen Impfungen Virbereedung (Astellas, Tokyo, Japan) sech un all derbäi gutt a bei 37 ° C fir 1 h incubated. No mat PBST wäschen, sech de Wells mat Maus anti-ophaalen monoclonal antibody (HyTest) bei 37 ° C fir 1 h duerch incubation mat Päerd-banne peroxidase (HRP) -conjugated Geess anti-Maus IgG antibody (GE Gesondheetswiesen, UK duerno incubated bei) 37 ° C fir 1 h. Duerno 3,3 ", 5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) Realitéiten (Fläch-Aldrich, Saint-Louis, MI) ugebaut. D'Reaktioun war TMB stoppen reagent (Fläch-Aldrich) an absorbance bei 450 nm gestoppt benotzt gouf mat engem microplate Lieser (1420 multilabel Konter, PerkinElmer) gemooss. VerfÜgung entholl Zell Prolifératioun vun MTS assay VerfÜgung Zell Prolifératioun gouf vun engem konventionell MTS assay CellTiter 96 Zell Prolifératioun laachen assay benotzt (Promega, Madison, allem). Zellen rakommen op 96-Meter microplate sech fir 72 h mat verschiddenen Konzentratioune vun PFL an entspriechend mëttelfristeg mat 10% FBS incubated. D'Zellen sech dann mat 20 μl vun MTS reagent fir 1 h op 37 ° C an gemooss mat engem microplate Lieser (1420 multilabel Konter, PerkinElmer) op 490 nm incubated. Den Effet vun Happ mannan op cytotoxity vun PFL war fir 72 h duerch incubating d'Zellen mat 5 μM PFL an der Präsenz vun verschiddenen Konzentratioune vun Happ mannan zu RPMI 1640 mat 10% FBS alles, an Zell Nuetsvolen war ëmschriwwen virun gemooss. Isolatioun vun PFL bindend Protein (s) op MKN28 Zell VerfÜgung PFL mat biotin benotzt biotin Etikette Kit (Dojindo molekulare Technologien, Japan) laut der Fabrikatioun d'Instruktioune ausgezeechent gouf. Fir Spuenien wär MKN28 Zellen op Cover trieden, biotinylated-PFL (200 μg) ugebaut a fir 2 h bei Raumtemperatur incubated. No der Keelt PBS wäschen, goufen d'Zellen knappen ugefaangen an zu 800 μl vun Ripa Prellbock (50 mm Tris-HCl, pH 7,6, 150 mm NaCl, 1% Nonidet P40, 0,5% Natrium deoxycholate, protease inhibitor Cocktail, 0,1% SDS lysed ). Duerno, 100 μl vun biotin-knipsen avidin Glaspärelen (Adar Biotech, Israel) war fir d'Zell lysate notéiert an Nuecht op 4 ° C mat sanft Onroue incubated. D'Glaspärelen huet dräimol mat 50 mm Tris-HCl, pH 7.5 gewäsch. Agefaangene Proteinen op Glaspärelen sech mat 50 μl vun SDS-PAGE Prouf Prellbock (62.5 mm Tris, pH 6,8, 2% SDS, 10% glycerol, 1% mercaptoethanol, 0,003% bromphenol blo) eluted fir 15 min bei 90 ° C an deen zu SDS-PAGE. D'FAQ Band spezifesch fir PFL Behandlung Ëmwandlung war an der Verdauung mat trypsin zu-gelies vun MALDI-Ënnerportal MS analyséiert. Kuerz, goufen d'CBB Kierchefënster FAQ Bands Géigewier an destained mat 25 mm ammonium bicarbonate 50% acetonitrile mat. D'reductive alkylation war iodoacetoamide fir 1 h mat 50 mm mat 50 mm TCEP (Tris [2-carboxyethyl] phosphine) vun 25 mm ammonium bicarbonate, gefollegt vun incubation gesuergt. No eppes mat acetonitrile, war d'FAQ am gelies mat 10 μl vun TPCK-trypsin (100 μg /ml) vun 50 mm ammonium bicarbonate verdaut. Der Verdauung war mat Zip Tipp (Millipore, Japan) sidd an op engem MALDI Zil- iewer. One μl vun Matrixentgasung Léisung (α-cyano-4-hydroxycinnapic Seier Matrixentgasung [Bruker, Japan] zu acetone-Ethanol [1:2]) ugebaut dann un der Plaz. MALDI-Ënnerportal MS Analyse gouf vun engem Autoflex Mass Spektrometer (Bruker, Japan) no der Eechung mat engem peptide Mass Standard Kit (Bruker, Japan) duerchgefouert. D'peptide Mass Fanger Dréckerei Donnéeën war vun der Maskottchen Software (MATRIX Science, Japan) gesichte. VerfÜgung bewosst Lokalisatioun vun PFL an integrin α2 VerfÜgung MKN28 Zellen sech cultured op coverslips zu enger 6-gutt zappen . D'Zellen op coverslips wuessen sech mat 30 μg /behandelt ml Alexa488 conjugated-PFL zu RPMI 1640 a fir anerer Zäit Perioden incubated. No mat PBS wäschen, goufen d'Zellen fir 5 min mat 80% acetone fest. bei 37 ° C fir 1 h; folgenden wäschen mat PBS, goufen d'Zellen mat Maus monoclonal anti-integrin α2 /CD49b antibody (D Systemer, Punktzuel R &) incubated. No mat PBS wäschen, goufen d'Zellen mat Alexa568-conjugated Geess anti-Maus IgG antibody (Life Technologien, Japan) bei 37 ° C fir 1 h incubated. No weideren PBS wäschen, goufen d'Zellen mat Vectashield mat DAPI (Vecteure Laboratoiren) Descher an huet ënner confocal Laser Scannen microscope observéiert (IX70; Olympus, Japan). Vun astellen an de selwechte Wee Wéinst gastric Kriibs Zell Linn GCIY an normale Mënsch hepatocyte Zellen ACBRI 3716, bewosst localizations vun integrin α2 an Alexa488-PFL sech den uewen beschriwwen iwwerpréift, an ënner engem fluorescence microscope (OLYMPUS BX51) observéiert. Den Effet vun Happ mannan op bewosst Lokalisatioun vun PFL an integrin α2 war wéi follegt bewäert. Spuenien wär MKN28 Zellen op coverslips zu enger 6-gutt zappen ugebaut goufen, fir 4 h mat 20 μg /ml vun Alexa488-PFL zu RPMI 1640 an der Presenz oder Feele vun 700 μg /ml Happ mannan behandelt. D'Zellen sech fest, visualized mat anti-integrin α2 /CD49b antibody wéi uewe beschriwwen, an ënner engem fluorescence microscope (OLYMPUS BX51) observéiert. Effet vun verschiddenen lectins op bewosst Lokalisatioun vun integrin α2 war an engem ähnleche Wee iwwerpréift, déi vun der MKN28 Zellen incubating mat 20 μg /ml vun all lectin zu RPMI 1640 fir 4 h. VerfÜgung molekulare Klonen, Ausdrock an Offäll vun PFL VerfÜgung Mir hu fonnt virdrun de Nepgen vun P. fluorescens VerfÜgung Pf0-1 eng méiglech homologue vun Anti-HIV lectin Famill enthält déi viru kuerzem am ënneschten Organismen och Bakterien, cyanobacteria an Séifaart Algen fonnt huet [4]. Baséiert op der Nukleotid Haaptrei vun hypothetesch lectin vun P. fluorescens VerfÜgung Pf0-1 op der Datebank, goufen primer baut entworf lectin Gentherapie zu Meenungsfreiheet nennt. Putative lectin Gentherapie war vun Direktional anerer Sprooch Klone System erfollegräich gekloonten, an der coding FAQ war heterologously zu E ausgedréckt. belaascht VerfÜgung BL21 (DE3). D'ausgedréckt lectin FAQ gouf vun engem eenzege Schrëtt gelies filtration op 12 Kolonn Superose zu homogeneity sidd (Figebam. 1A). Déi aktiv Héichpunkt mat hemagglutination Aktivitéit huet en eenheetlechen FAQ Band vun 13 kDa op SDS-PAGE (Figebam. 1B). Endlech, vun 1 Dreck E. belaascht VerfÜgung Kultur, héije Rendement vun sidd lectin (240 mg) kritt. D'sidd lectin war PFL genannt a fir weider Examen benotzt. D'molekulare Mass vun PFL (13883.7) bestëmme MALDI-Ënnerportal MS war am Accord mat der berechent Mass (13881.1) vun der Mëllechstrooss Aminosaier Haaptrei an datt geschate Wert vun der Mobilitéit op SDS-PAGE. VerfÜgung D'Mëllechstrooss Aminosaier Haaptrei vun PFL harbored zwee homologous Beräicher, all aus den dräi an C-Uschloss Wäert mat 62% leien Identitéit tëscht hinnen. PFL Schatzkummer héich leien homology zu cyanobacterial lectin OAA vun Oscillatoria agardhii VerfÜgung, rout algal lectin ESA-2 vun Eucheuma Serra VerfÜgung, an bakteriell lectin MBHA vun Myxococcus xanthus VerfÜgung (Lalumi 2B.), deen eng Verfilmung anti-HIV lectin Famill domat. D'molekulare Mass vun PFL an OAA sech ähnlech, 13883,7 an 13924,1, respektiv, a béid lectins goufen vun 132 Aminosaier Saieren komponéiert. Béid PFL an OAA hunn eng gemeinsam Proprietéit zu sengem Haaptrei Verdueblung mä OAA Plakater héich Ofschloss vun intern Haaptrei Identitéit mat 75% tëschent den zwou widderholl Beräicher. Am Géigesaz, ESA-2 an MBHA sinn aus véier tandemly widderholl homologous Beräicher vun 67 Aminosaier Saieren. De Grad vun Ähnlechkeet vun OAA, ESA-2 an MBHA mat PFL an hir N-Uschloss Portiounen (all 132 Reschter) vun der Aminosaier Message goufen 62,1, 61,4, an 62,1% fir derselwechter Héicht Saieren, bzw.. VerfÜgung Glucid-verbindlech Spezifizitéit vun PFL VerfÜgung rechnen-verbindlech Spezifizitéit vun PFL, glycan vill Analyse war fir Fonctionnement Glycomics benotzt gedréckt vill Versioun 5.0 um Consortium standing ze bestëmmen. Vun der 611 Handwierker oligosaccharides getest, PFL (10 μg /ml) zougedréckt exklusiv Spezifizitéit fir héich mannose Typ glycans wéi zu Lalumi gewisen. 3. De ganze Lëscht vun oligosaccharide getest an d'Resultat kann online bei (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp) fonnt ginn. VerfÜgung PFL staark zu M6 glycan gebonnen (216 ) an M8 glycan (212), souwuel vun deenen eng ausgesat α1-3 Man op der D2 Aarm hunn, mat der ähnlechen Niveau vun héich RFU Wäerter, 43471 an 40759, bzw.. Am Géigesaz, baut vun dëser α1-3 Man mat α1-2 Man leider dramatesch der Interaktioun tëscht PFL an der glycans. Dëst war déi evident vun engem Verglach vun M6 glycan (216) an M7 glycan (211), wou déi zousätzlech α1-2 Man op D2 Aarm der bindend as ofgeholl ongeféier zu 53%. Den Zerfall, war obligatoresch as vun PFL zu M9 glycan (213) ofgeholl (RFU = 8535) am Verglach mat sengem Kolleg M8 glycan (212) subtil D2 Uschloss α1-2 Man, nëmme 21% vun de as weist. Spannen, Entfernung vun der Reduzéierung Uschloss disaccharide, GlcNAc-GlcNAc vun héich mannose glycans vill drastesch manner PFL-verbindlech. Zum Beispill war déi PFL obligatoresch as bal komplett un d'glycans ofgeschaf 316 an 317 dass keen GlcNAc-GlcNAc Haaptrei hierkommen déi Amtskolleg 212 an 213 glycans, respektiv, vill méi héich as Schatzkummer. D'Wichtegkeet vun Uschloss GlcNAc-GlcNAc war weider duerch de Verglach vun glycans 217 an 315 confirméiert, obwuel d'Ausmooss vun Handicap vun PFL-verbindlech limitéiert war. Dëst lectin war ouni monosaccharide-verbindlech dorënner mannose. Desweideren, PFL huet sech net mat Man α1-6 Man (314) an mannotriose (214), wéi Atomer vun der gemuert Deel vun héich mannose glycans sinn. Pentasaccharide Kär vun N-glycan (50) huet sech net duerch PFL unerkannt mä seng fucosylated Kolleg (485) ugewisen schwaach Interaktioun (RFU = 746). Dës oligosaccharide bindend Profiler vun PFL waren enk gläicht deenen vun OAA, ESA-2 an KAA-2 dass am ënneschten Organismen zu engem Roman anti-HIV lectin Famill gehéieren [4] -. [6] VerfÜgung anti- influenza Virus Aktivitéit vun PFL VerfÜgung Anti-influenza Virus Aktivitéit vun PFL war mat zwee influenza Virus analyséieren évaluéiert, a /Udorn /72 (H3N2) an a /Peking /262/95 (H1N1) vun de gudde Verhalt Hoerfaarw Notzong assay. PFL effektiv inhibited cytopathic Effekt déitlech souwuel influenza Virus analyséieren, mat CE 50s vun 19,4 ± 1,5 nm, an 4.5 ± 0,4 nm, bzw. (Figebam. 4A). Fir ze bestätegen, datt PFL den initial Schrëtt vun influenza Virus Entrée an d'Zellen inhibited, Verdeelung vun Haren antigens vun der Krankheet Zellen war an der Presenz oder Feele vun PFL benotzt immunofluorescence microscopy observéiert. Figebam. 4B weist Verdeelung vun de Haren antigen no 24 h Post Wonn mat A /Udorn /72 duerch spezifesch anti-hemagglutinin antibody fonnt. PFL inhibited effizient Element influenza Virus an d'Zellen hierkommen d'Viren konnt sech an der Provider Zellen an d'Feele vun PFL zu Lëtzebuerg ageréckt an behaapten. A galactose spezifesch lectin PNA vun Arachis hypogaea VerfÜgung gescheitert Virus Entrée an d'Zellen ze inhibit. Dës Resultater proposéiere der Präsenz vun héich mannose glycans op de Virus Surface bei der Positioun kritescher fir Virus Element an Zellen. Ze testen ob PFL direkt Haren Enveloppe kruet géif glycoprotein Ha, eng Elisa assay mat kommerziell sinn Impfungen Virbereedung Leeschtung war déi ophaalen enthale aus A /California /7/09 (H1N1), A /Victoria /210/09 (H3N2), an B /Brisbane /60/08 als e grousse Volet. Als zu Lalumi bewisen. 4C, Morphium-ofhängeg vun Ha zu PFL bindend observéiert gouf. VerfÜgung PFL entschlof Zell Doud vum Mënsch Zell gastric Kriibs MKN28 VerfÜgung An kënschtlech VerfÜgung anti-entholl Effet vun PFL op gastric Kriibs Zell MKN28 war duerch konventionell MTS assay bewäert. Als zu Lalumi gewisen. 5A (lénks Rot), zougedréckt PFL enger Portioun-ofhängeg Effekt op d'Prolifératioun vu MKN28 Zell. Um 72 h Post PFL-Behandlung war Zell Nuetsvolen ofgeholl vill um Dosis vun 0,5 μM oder méi héich. Am Géigesaz, um niddereg Dosis vun 0.1-0.3 μM, war Zell Prolifératioun gehumpelt stimuléiert. D'PFL-entschlof Zell Doud vun MKN28 Zellen war duerch e Verloscht vun Zell Haftung fir ënnen Kultur zappen begleet, wéi zu Lalumi gewisen. 5B wou everted Stärekoup vun Zellen als getarnt Linnen observéiert goufen. D'PFL-entschlof Zell Doud war an der Präsenz vun Happ mannan, engem glycoprotein Träger héich mannose oligosaccharides (Figebam. 5A, riets Rot) wierksam inhibited. Dëst bedeit d'héich mannose glycans op MKN28 Zellen sinn an PFL-entschlof Zell sécher bezitt dat schlussendlech Doud zu Zell Haaptfiguren. Am Géigesaz, huet relativ normal mënschlech hepatocyte Zellen (ACBRI 3716) resistent PFL Behandlung Verglach mat MKN28 Zellen (Figebam. 5A, lénks Rot). VerfÜgung Isolatioun vun PFL-verbindlech Protein (s) op mënschlech Zell gastric Kriibs MKN28 VerfÜgung de molekulare Mechanismus fir Adress vun deem PFL Zell Doud vun MKN28 Zell induces, Zell Uewerfläch Protein (s) fir déi PFL niewent propagéieren. Biotinylated PFL war fir 2 h mat MKN28 Zellen an d'Zellen incubated sech mat Ripa gefiermt lysed 0,1% SDS mat. D'Zell Uewerfläch Protein (s) fir déi biotin-PFL niewent Co-Trick mat avidin-Beschichtete Glaspärelen. D'Proteinen op Glaspärelen setzt sech dono mat SDS-PAGE Prouf gefiermt an analyséiert op SDS-PAGE (Figebam. 6A) eluted. Obwuel e puer Net-spezifesche Gruppen fonnt goufen, gesi mir eng 150 kDa Band déi speziell zu PFL Réckstänn traitéiert Ëmwandlung. Dëse Band war weider ze Verdauung vun trypsin zu-gelies vun MALDI-Ënnerportal Mass spectrometric Analyse duerno ënnerworf. Déi kritt peptide Mass fingerprinting Donnéeën (. Lalumi 6B) huet fir Datebank gesichte an d'FAQ war den integrin α2 identifizéiert, mat der Wahrscheinlechkeet baséiert Fändelen vun 57 (p &Si besteet; 0,05). VerfÜgung bewosst Lokalisatioun vun exogenously dobäi PFL an integrin α2 VerfÜgung D'Verhaalen vun PFL selwer an integrin α2 op Behandlung mat PFL sech mat engem confocal unisse microscope iwwerpréift. An dësem Experiment, war unisse-Label PFL (Alexa488-PFL) benotzt PFL Lokalisatioun ze suivéieren. An Alexa488-PFL war fir 1, 5 an 24 h op Dosis vun 30 μg /ml mat MKN28 Zellen incubated. Integrin α2 sech mat der anti-integrin α2 /CD49b monoclonal antibody gefollegt vun Alexa568-conjugated 2. antibody fonnt. Spannen, Alexa488-PFL zu der Zell Uewerfläch gebonnen a internalization zu Zytoplasma bannent 1 h (Figebam. 7) ageleet. Integrin α2 déi op Zell Surface bei roueger Staat Kannerbetreiung en der huet mécht och internalization, a wichteg, d'Lokalisatioun vun integrin α2 coincided gutt mat PFL. No 5 h incubation, souwuel PFL an integrin α2 sech Co-en der an perinuclear Regioun a weider incubation alldeeglech beäntweren net de Standuert vu béiden Proteinen ofzeänneren gemaach. Et ass also wahrscheinlech, datt eemol PFL zu integrin α2 gebonnen, hu béid Proteinen ni zréck der Zell Uewerfläch verwäert ginn. Rapid intracellular intervenéiert vun PFL-integrin α2 komplex ass och op collagen ech Beschichtete Cover Ausrutscher (Donnéeën net gewisen). Den Zerfall, Ëmverdeelung α2 op Behandlung mat PFL vun integrin war an aneren gastric Kriibs Zell Linn observéiert, GCIY, mä net am normale Mënsch hepatocyte Zellen, ACBRI 3716 (Figebam. 8). An ACBRI 3716 Zellen, internalization vun PFL war vun der grousser Distanz Ausdrock vun integrin α2 op Zell Uewerfläch net méiglech observéiert. VerfÜgung Zesummenaarbecht vun héich mannose glycans op PFL-integrin α2 Interaktioun VerfÜgung Fir Test ob bewosst Ëmverdeelung vun α2 déitlech PFL integrin aus engem spezifesche Interaktioun vun PFL mat héije mannose glycans op integrin α2 Protein féiere kann, hu mir den Effet vun Happ mannan op PFL-entschlof integrin α2 internalization benotzt MKN28 Zellen bewäert. An d'Flichte vun Happ mannan, mécht souwuel Proteinen bedeitendst internalization (Figebam. 9A, ieweschte Brieder). Am Géigesaz zu der Presenz vun Happ mannan, ausfale PFL zu Zell Uewerfläch bis festleeën, an der nächster intracellular intervenéiert vun PFL war komplett ofgeschaf (Figebam. 9A, manner riets). Onbedéngt zu dëser Beobachtung, α2 integrin rauszesichen seng Lokalisatioun Changement an der Präsenz vun Happ mannan (Figebam. 9A, manner lénks). Dës Resultater kloer dass PFL gebonnen un integrin α2 duerch d'Unerkennung vun héich mannose glycans op integrin α2. Fir weider d'Noutwendegkeete vun héich mannose glycans confirméieren fir integrin α2 Ëmverdeelung, hun mir den Effet vun verschiddenen lectins op bewosst Lokalisatioun vun integrin α2 getest. Als zu Lalumi gewisen. 9B, aner lectins mat verschiddene Charakteristika wéi galactose-verbindlech PNA vun Arachis hypogaea VerfÜgung, fucose-verbindlech AOL vun Aspergillus oryzae VerfÜgung, sialic Seier-verbindlech MAM vun Maackia amurensis An dëser Etude, hu mir de biologeschen Aktivitéit vun der Verfilmung bakteriell lectin bewäert PFL vun P. fluorescens VerfÜgung Pf0-1 dass am ënneschten Organismen zu rezent fonnt anti-HIV lectin Famill gehéiert. Optriede vun EPO-resistent influenza Virus analyséieren wéi och zouginn duerchaus pathogenic Virus analyséieren wéi Vullegripp H5N1 waarden gefouert eis PFL als Roman anti-influenza Agent ze entdecken. PFL zougedréckt a mächtegst Aktivitéit Virus anti-influenza an de Mechanismus vun deem PFL Virus Gedächtnis inhibited war inhibition vun der éischter Etapp vum Virus Element an Zellen. Et ass Wahrscheinlechkeet dass PFL anti-influenza Aktivitéit Nofolleg duerch ze héich mannose glycans op Haren Enveloppe ophaalen selektiv bindend, wéi an Elisa assay bewisen [9]. An Tatsaach, Site spezifesch Optriede vun héich mannose oligosaccharide huet op der Regioun vun ophaalen bei der receptor bindend Site gewise [10]. VerfÜgung Effekt anti-entholl vun PFL ze wëssen, Employé mir gastric Kriibs Zell Linn MKN28 Mënsch deen ass aus engem mëttelméisseg ënnerscheet intestinal Typ entholl entstanen. De roude algal lectin ESA-2 déi mat PFL zu der selwechter lectin Famill gehéiert Schatzkummer anti-entholl Effekt souwuel kënschtlech VerfÜgung a zu VIVO VerfÜgung [7], [8]. ESA-2 ass eng FAQ aus der iessen seaweed ofgeleet a erwaart Effekt anti-entholl op gastrointestinal TRACT Kriibs vum Elysée Verwaltung ze huele. Et ass ausserdeem, datt PFL Zell Doud vun MKN28 Zell gefördert, exklusiv duerch eng Unerkennung vun héich mannose glycans op integrin α2 Protein, déi bei roueger Staat op Zell Uewerfläch Kannerbetreiung wellkomm. Heterodimeric integrins Akt net nëmmen den Hafen Protein Zellen fir eng adäquat extracellular Matrixentgasung (ECM) mee och als detektéieren vun der ECM Ëmwelt ze leeën [11].
Aféierung VerfÜgung
spontan a Methode VerfÜgung
Resultater VerfÜgung
, d-GlcNAc-verbindlech UDA vun Urtica dioica VerfÜgung net de Standuert vun integrin α2 Afloss huet. Spannen, och héich mannose bindend lectins wéi enger monocot mannose (Man) -binding lectin, GNA vun Galanthus nivalis VerfÜgung hutt weisen keng wichteg Ännerung op α2 integrin. Am Géigesaz, Wettbewerbsverzerrungen héich mannose bindend legume lectin ConcanavalinA (ConA) d'Unuerdnung vun hutt α2 wëll PFL integrin. VerfÜgung Diskussioun VerfÜgung
Spermmikrobiom opgedeckt mat RNA Sequencing
Aart vun ieweschte Loftwee Bakterien kéint d'Asthma Schwieregkeet beaflossen
Wasserstoff Otem ass net vum Bikini Atoll
Et ass sécher rau Liewensmëttel fir Hausdéieren ze fidderen,
Eng vegan Diät kéint Darmmikroben erhéijen, déi Gewiichtsverloscht hëllefen
Änneren iewescht respiratorescht Mikrobiom bei Kanner am Zesummenhang mat der SARS-CoV-2 Empfindlechkeet
Kanner sinn immun virbereet op SARS-CoV-2
Op dmannst 30 nei Krankheeten sinn an de leschten 20 Joer opgetaucht a bedrohen elo zesummen dGesondheet vun Honnerte vu Millioune Leit. Fir vill vun dëse Krankheeten, et gëtt keng Behandlung, geheelt
Ganz Vibratioun hëlleft Entzündung ze reduzéieren,
dank dem Darmmikrobiom Ganz Vibratioun schéngt vill Symptomer vum Typ II Diabetis mellitus ze verbesseren, wou Glukos an destruktiv Entzündung opschéisst. DProzedur hëlleft dem Kierper Glukos als Ener
Vaginale Flëssentransplantatioun kann hëllefe fir widderhuelend bakteriell Vaginose ze behandelen
Bakteriell Vaginose ass e gemeinsamen an irksome Problem fir vill Fraen. Elo hunn dFuerscher dTransplantéierend Vaginale Flëssegkeeten vun enger gesonder Fra u Frae mat schwéierer bakterieller Vaginos