PLoS One: Nagy mannóz-Binding vírusellenes lektin PFL Pseudomonas fluorescens Pf0-1 elősegítheti a sejt pusztulását Gyomorrák Cell MKN28 kölcsönhatás révén α2-Integrin

absztrakt katalógusa

Új HIV elleni lektin család, amely azt mutatja, hogy szigorú kötési specificitása magas mannóztartalmú glikánok találtuk alacsonyabb szervezetekre. A bakteriális ortológ már azonosították genomjában Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 és a gén kódoló egy vélt lektin klónoztuk kifejezve Escherichia coli
és tisztíthatjuk egy lépéssel gélszűréssel. Glikán tömb szűrés a rekombináns lektin nevezett PFL, azt mutatta, hogy a PFL előszeretettel felismeri magas mannóz glikánjainak a α1-3 férfi, aki nagyon ki vannak téve a D2 helyzetbe. Ezzel szemben a maszkolás ennek α1-3 Ember α1-2 Man drámaian csökkent lektin-szénhidrát kölcsönhatások. Redukáló terminális diszacharid, GlcNAc-GlcNAc magas mannóz glikánjainak is elengedhetetlen PFL-kötésben. PFL mutatott erős anti-influenza-vírus aktivitás gátlásával a vírus belépését sejtekbe dózisokban alacsony nanomoláris koncentráció. Mikromoláris koncentráció vagy magasabb, PFL mutatott citotoxicitást kísérő veszteség a sejt adhézió elleni humán gyomorrák MKN28 sejteket. A sejt felületi molekula, amelynek PFL kötődött együttesen kicsapott biotin-jelölt PFL és azonosított integrin α2 tömeges peptid ujjlenyomat-MALDI-TOF tömegspektrometria. Érdekes módon való kezelés után exogén PFL, integrin α2 a sejt felszínén ment gyors internalizációját a citoplazmába és a felhalmozott a perinukleáris régióban, valamint a kötött PFL. A keletkező sejt tapadás okozna jelátviteli indukált anoikis-szerű sejthalált. Ezeket az eseményeket hatékonyan gátolható előkezelése PFL a mannnan, jelezve bevonásával magas mannóztartalmú glikánok on PFL-indukált sejthalált hogy váltotta ki PFL-integrin α2 kölcsönhatások.

bevezető hivatkozás: Sato Y, Morimoto K., Kubo T, Yanagihara K, Seyama T (2012) Nagy mannóz-Binding vírusellenes lektin PFL-re Pseudomonas fluorescens katalógusa Pf0-1 elősegítheti a sejt pusztulását gyomorrák Cell MKN28 kölcsönhatás révén α2-integrin. PLoS ONE 7 (9): e45922. doi: 10,1371 /journal.pone.0045922 katalógusa

Vágó: Roger Chammas, Universidade de São Paulo, Brazília katalógusa

Beérkezett: május 7, 2012; Elfogadva: augusztus 27, 2012; Megjelent: szeptember 20, 2012 katalógusa

Copyright: © Sato et al. Ez egy nyílt hozzáférésű cikk feltételei szerint terjeszthető a Creative Commons Nevezd meg! Licenc, amely engedélyezi a korlátlan használatát, a forgalmazás és a reprodukció bármilyen adathordozón, feltéve, hogy az eredeti szerző és a forrás jóváírásra. Katalógusa

Forrás: A kutatás részben támogatta egy Grant-in-Aid Fiatal tudósok (B) a Japán Társaság a Promotion of Science (JSP) (Grant szám 24790101). A finanszírozók nem volt szerepe a tanulmány tervezés, adatgyűjtés és elemzés, döntés, hogy közzéteszi, vagy a készítmény a kézirat. Katalógusa

Érdekütközés: A szerzők kijelentették, hogy nem ellentétes érdekek léteznek. Katalógusa

Bevezető

Nagy mannóz-kötő lektinek, hogy a cél konkrét glikánjainak a vírus felszíni ígéretes potenciális vírus inaktiváló szerek lehetne használni a megelőzési és ellenőrzési vírusfertőzések [1], [2]. Számos lektinek, hogy specifikusan felismerik a magas mannóztartalmú glikánok találhatók a különböző taxonómia beleértve baktériumok, algák, növények és állatok, és néhány, amelyekről kimutatták, hogy mutat anti-HIV aktivitását [3]. Nemrég találtam egy új HIV elleni lektin család szét kisebb szervezetek, beleértve a baktériumokat, cianobaktériumok és tengeri algák [4]. Ezek mutatnak közös jellemzőkkel rendelkezik, mint például a szekvencia szaporodását erősen konzervált N-terminális domént és kizárólagos magas mannóztartalmú oligoszacharid felismerések. Egyes lektinek ebben a családban, mint a cianobaktérium OAA be a Oscillatoria agardhii katalógusa [4] és a vörös alga ESA-2 Eucheuma serra katalógusa [5] kimutatták, hogy gátolja a HIV belép a fogadó sejtek EC _{50-es évek alacsony nanomoláris tartományban közvetlenül kötelezőek boríték gp120. Továbbá, egy vörös alga lektin KAA-2 Kappaphycus alvarezii katalógusa, amely szintén ebbe a család gátolja a fertőzés különböző törzsek EC 50-es évek alacsony nanomoláris szint törzs-független módon, a elismerésének magas mannóztartalmú oligoszacharid a vírus burok glikoprotein hemagglutinin (HA) [6].}

Ezt a hatásos antivirális aktivitás, az ESA-2 ábra különböző biológiai aktivitásokkal, mint például mitogén aktivitás egér és humán limfociták és in vitro
növekedés gátlását a tumorsejtek [7], [8]. Bár biológiai tulajdonságait a lektin család már nyilvánvaló, a tulajdonságait bakteriális ortológjait be a Pseudomonas fluorescens katalógusa Pf0-1 és Herpetosiphon aurantiacus katalógusa kell még tisztázni. Katalógusa

a jelen tanulmányban már klónozott a ortológját lektin gén P. fluorescens
Pf0-1 és a kódolt lektin protein (PFL) expresszáltunk a Escherichia coli katalógusa. Funkcionális PFL sikeresen tisztítjuk nagy hozammal és jellemeztük szempontjából a biológiai tevékenységek, mint a vírusellenes és tumorellenes aktivitást. Ahogy várható intenzív szerkezeti hasonlóság PFL más tagjai ennek lektin család, PFL kiállított kizárólagos specificitása magas mannóz oligoszacharidok és hatásos antivirális aktivitást influenzavírusok ellen. Továbbá PFL indukált anoikis-szerű sejt halálát gyomorrák sejt MKN28 kölcsönhatás révén sejtfelszíni integrin α2.

Anyagok és módszerek

Anyagok

Stab kultúra P. fluorescens katalógusa Pf0-1 nagylelkűen melyet Dr. Mark W. Silby (University of Massachusetts Dartmouth, USA). Influenzavírusok és Madin-Darby kutya vese (MDCK) sejteket bőségesen melyet Dr. T. Sakaguchi (Hiroshima University, Japán): az influenza vírust növesztettünk chorioallantois folyadék 10 napos csirke tojás. MDCK sejteket tenyésztettünk Dulbecco-féle módosított Eagle-tápközeg (DMEM), amelyet 10% magzati borjúszérummal és penicillin-sztreptomicin. A gyomorrák sejtvonal MKN28 volt szíves rendelkezésünkre Prof. Suzuki (Fukushima Medical University, Fukushima, Japán). A sejtvonalat RPMI-1640 tápközegben (Gibco, Grand Island, NY), kiegészítve 10% magzati borjúszérummal (FBS, Gibco), 100 NE /ml penicillin G nátrium és 100 mg /ml sztreptomicin-szulfátot. Egy másik gyomorrák sejtvonal GCIY, vásároltunk a RIKEN CELL BANK (Ibaraki, Japán) és karbantartani, ugyanolyan módon, mint fentebb leírtuk. Elsődleges normális emberi májsejt cella (ACBRI 3716) vásároltunk a DS Pharma Biomedical (Osaka, Japán) és fenntartani a CS-C közepes készlet R (DS Pharma Biomedical). Katalógusa

hemagglutinációs vizsgálat katalógusa

hemagglutináció vizsgálatot végeztünk egy 2% -os (v /v) szuszpenziójához tripszin-kezelt nyúl eritrociták korábban leírtak szerint [9]. Röviden, a nyúl natív eritrocita-szuszpenziót kezeljük 0,5% -os tripszinnel sóoldatban, és az elegyet inkubáljuk 37 ° C-on 60 percig. Mosás után a sóoldat, a 2% -os tripszin-kezelt eritrocita-szuszpenziót készítettünk fiziológiás sóoldatban. Hemagglutináló aktivitását fejeztük ki titer, a kölcsönös a legmagasabb 2-szeres hígítást mutató pozitív hemagglutináció.

Gene klónozása és expressziója lektin PFL

genomiális DNS-t P. fluorescens
Pf0-1 használtuk templátként a gén klónozására PFL gént. Az első, egy oligonukleotid primer készlet, 5'-GGCAGGTCTCCCGAAACTTCAAG-3 'és 5'-AGTCGAACGCCTGAACCTGTTGA-3', amely hibridizál upstream és downstream a PFL kódoló régió, illetve használtunk, és a PCR-t Prime-STAR-DNS polimeráz (TAKARA). Használata az amplifikált PCR-fragmens, mint a sablon, az ezt követő PCR-t végeztünk egy forward primert, 5'-CACCATGTCTAAATACGCAGTGGCA-3 ', amely CACC további szekvencia ATG startkodon a PFL gén, és egy reverz primert, 5'-TTACTCTATCTGCCCACGGAAG -3 '(TTA; megfelelő stop kodonját az RFL gén). Az amplifikált fragmenseket ligáljuk pET101 /D-TOPO expressziós vektorba. A rekombináns plazmidot transzformáljuk Escherichia coli
TOP10 sejtek (Invitrogen). A kapott rekombináns klónokat megerősítette, hogy egy helyes konstrukció DNS-szekvenálással. A funkcionális klónokat Escherichia coli BL21 katalógusa csillag (DE3) sejteket indukálható kifejeződését PFL gént. IPTG a végső koncentráció 0,8 mM adtunk az transzformált kultúra indukálására PFL kifejezést. 6 óra elteltével 37 ° C-on, a sejteket centrifugálással összegyűjtöttük 8000 rpm, 20 percig.

tisztítása lektin PFL katalógusa

A betakarított baktérium sejteket újra szuszpendáljuk 20 mM foszfát-pufferben ( pH = 7,0), amely 0,15 M NaCl (PBS), és szonikálással roncsoljuk. Centrifugálás után 8000 rpm-en 20 percen keresztül, egy aliquot részt a felülúszót alá, Superose 12 oszlopon (GE Healthcare) PBS-sel ekvilibrált. Az oszlopot PBS-sel áramlási sebességgel 0,8 ml /perc egy izokratikus üzemmódban. Az eluátumot abszorpcióval 280 nm-nél, és megvizsgáltuk az hemagglutináló aktivitását, és az aktív frakciókat összegyűjtjük.

Molekulasúly meghatározása PFL

A molekulatömege PFL határoztuk meg MALDI-TOF MS elemzés egy Autoflex tömegspektrométer (Bruker, Japán) a kalibrálás után egy peptid tömeg standard készlet (Bruker, Japán) alkalmazásával szinapinsav sav, mint egy mátrix.

DNS szekvencia analízis

nukleotidszekvenciák úgy határoztuk meg, didezoxi-lánc-terminátor módszert a a BigDye Terminator Version 3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems). DNS-szekvenálást végeztünk ABI 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

Glycan tömb elemzése

PFL jelöltük Alexa Fluor 488, a gyártó utasításai szerint (invitrogen, Eugene, OR). Glikán kötési specificitását PFL határoztuk meg a nyomtatott glikán microarray (5.0 verzió) szerint szabványos eljárás CoreH A konzorcium Funkcionális glikomikai (CFG) (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp ). Az átlagos relatív fluoreszcencia ismételjük hat volt átlagolásával számítottuk ki négy értéket eltávolítása után a legmagasabb és a legalacsonyabb értékeket kiküszöbölhetjük a hamis találatok nagyon magas vagy alacsony pontokat. A hiba sávok a standard hibát az átlag (SEM), és a CV% a variációs koefficiens (SD /átlag) kiszámítani%. Katalógusa

Anti-influenza aktivitása PFL katalógusa

In vitro
anti-influenza aktivitását PFL úgy határoztuk meg, a semleges vörös (NR) festék felvételét vizsgálatban. Különböző koncentrációjú PFL készítettünk DMEM, amely 10 ug /ml tripszin egy 96-lyukú mikrotiter. Minden üreghez vírust adtunk hozzá fertőzési multiplicitással körülbelül 0,001 fertőző részecske per sejt. Inkubálás után 37 ° C-on 48 órán át, 100 ul NR festékkel (150 ng /ml DMEM-ben) adtunk hozzá, és további 2 órán keresztül inkubáljuk. NR festék beépül a sejtekbe extraháljuk hozzáadásával 100 ul 1% ecetsav /50% -os etanol. A lyukakat mértük 540 nm-nél egy mikrotiterlemez-leolvasó (1420 multilabel számláló, Perkin-Elmer, MA, USA), mint tényező a túlélő a vírus citopátiás hatást.

Immunfluoreszcens mikroszkópia

Immunfluoreszcens festés volt végzett, hogy szemléltesse a belépési gátlását influenzavírus által PFL. Röviden, MDCK-sejteket növesztettünk fedőlemez fertőztünk A /Udorn /72 egy fertőzési multiplicitással körülbelül 0,001 fertőző részecske per sejt jelenlétében vagy távollétében 200 nmol PFL tartalmazó DMEM-ben 10 ng /ml tripszin. 24 óra eltelte után a fertőzés után a fertőzött sejteket fixáltuk 80% -os acetonnal 5 percig. A mosást követően a PBS-sel a sejteket inkubáltuk, egér monoklonális anti-HA antitest (HyTest, Turku, Finnország) 37 ° C-on 1 órán át. Mosás után PBS-sel, majd a sejteket inkubáljuk, fluoreszcein-izotiocianát (FITC) konjugált kecske anti-egér IgG antitest (Anticorps Secondaires, Compiègne, Franciaország) 37 ° C-on 1 órán át. Miután további PBS mosás után a sejteket szerelt alkalmazásával Vectashield 4 ', 6-diamidino-2-fenil-(DAPI) (Vector Laboratories, Burlingame, CA), és figyeltek alatt fluoreszcens-mikroszkóp (OLYMPUS BX51, Olympus, Japán).

ELISA assay

közvetlen kölcsönhatása PFL virális burok glikoproteint HA vizsgáltuk alkalmazásával enzim-kapcsolt immnosorbent assay (ELISA). PFL (5 ng /ml), karbonát-pufferrel (pH = 9,6) vontunk be 96 lyukú ELISA-lemezeken (BD Biosciences, Bedford, MA). A lyukakat háromszor mostuk PBS-sel, amely 0,1% Tween-20 (PBST), és blokkoltuk 3% -os sovány tejben 37 ° C-on 1 órán át. Mosás után PBST, különböző koncentrációjú influenza HA vakcina készítmény (Astellas, Tokió, Japán) adunk az egyes lyukakhoz, és inkubáljuk 37 ° C-on 1 órán át. Mosás után PBST az üregeket inkubáltuk az egér anti-HA monoklonális antitest (HyTest) 37 ° C-on 1 órán keresztül, majd inkubáltuk tormaperoxidázzal (HRP) konjugált kecske anti-egér IgG antitest (GE Healthcare, UK ) 37 ° C-on 1 órán át. Ezt követően 3,3 ', 5,5'-tetrametil-benzidin (TMB) szubsztrát (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MI) adunk hozzá. A reakció leállítására TMB leállító reagenst (Sigma-Aldrich), és az abszorbancia 450 nm-en mértük egy mikrotiterlemez-leolvasó (1420 multilabel számláló, PerkinElmer).

tumorsejtek proliferációját el MTS vizsgálati eljárással

sejtproliferációt mennyiségileg egy hagyományos, MTS esszé használatával CellTiter 96 sejtszaporodási esszé (Promega, Madison, WI). A sejteket oltottunk 96 lyukú mikrolemez inkubáltuk 72 órán különböző koncentrációjú PFL megfelelő tápközegben, amely 10% FBS-t. Ezután a sejteket inkubáltuk 20 ul MTS reagenst 1 órán át 37 ° C-on és mérjük mikrolemez-leolvasóval (1420 multilabel számláló, Perkin-Elmer), 490 nm-en. A hatás a élesztő mannán szóló cytotoxity a PFL oly módon határoztuk meg, hogy a sejteket 5 uM PFL jelenlétében különböző koncentrációjú élesztő mannán RPMI 1640, 10% FBS-sel 72 órán át, majd a sejtek életképességét mértük a fent leírtak szerint.

izolálása PFL kötő molekula (ok) on MKN28 sejt

PFL volt biotinnal biotin jelölő reagenskészlet (Dojindo molekuláris technológiák, Japán) alkalmazásával a gyártó utasításai szerint. Összefolyó MKN28 sejtek fedőlemezeket, biotinilezett-PFL (200 ug) adtunk, és 2 órán keresztül inkubáljuk szobahőmérsékleten. Mosás után hideg PBS-sel, majd a sejteket lekapartuk, és lizáltuk 800 ul RIPA-pufferben (50 mM Tris-HCI, pH = 7,6, 150 mM nátrium-klorid, 1% Nonidet P40, 0,5% nátrium-dezoxikolát, proteáz inhibitor koktél, 0,1% SDS ). Ezt követően 100 ul biotin-capture avidin gyöngyöket (Adar Biotech, Izrael) adtunk a sejtlizátumot, és inkubáltuk egy éjszakán át 4 ° C-on enyhe keverés közben. A gyöngyöket háromszor mossuk 50 mM Tris-HCI, pH = 7,5. Rögzített fehérjék gyöngyöket eluáljuk 50 ul SDS-PAGE minta-pufferben (62,5 mM Tris, pH = 6,8, 2% SDS, 10% glicerin, 1% merkapto-etanolt, 0,003% brómfenolkék) 15 percen át 90 ° C-on, és alávetni SDS-PAGE. A fehérje sávot specifikus PFL kezelés frakciót analizáltuk MALDI-TOF MS után in-gél tripszines emésztés. Röviden, a CBB megfestett fehérjét sávokat kivágtuk majd a festéket eltávolítjuk és 25 mM ammónium-hidrogén-karbonát, amely 50% acetonitrilt tartalmaz. A reduktív alkilezést végeztük 50 mM TCEP (trisz [2-karboxi-etil] foszfin) 25 mM ammónium-hidrogén-karbonát, majd inkubáltuk 50 mM iodoacetoamide 1 órán át. Miután kiszáradás acetonitril, a fehérje a gél-gyel emésztettük 10 ul TPCK-tripszint (100 ng /ml) 50 mM ammónium-hidrogén-karbonát. Az emésztést tisztítottuk Zip Tip (Millipore, Japán) és cseppentettünk egy MALDI cél. Egy ul mátrix oldat (α-ciano-4-hydroxycinnapic sav mátrix [Bruker, Japán], aceton és etanol [01:02]) adunk hozzá, hogy a helyszínen. MALDI-TOF MS analízist végeztünk egy Autoflex tömegspektrométer (Bruker, Japán) a kalibrálás után egy peptid tömeg standard készlet (Bruker, Japán). A tömeges peptid ujjlenyomat adatok keresték a Mascot szoftver (Matrix Science, Japán). Katalógusa

Cellular lokalizációja PFL és integrin α2 katalógusa

MKN28 sejteket fedőlemezen egy 6 lyukú lemezen . A sejteket növekvő fedőlemezen kezeltük 30 ng /ml Alexa488 konjugált-PFL RPMI 1640, és inkubáltuk különböző időszakok. Mosás után PBS-sel, majd a sejteket fixáltuk 80% -os acetonnal 5 percig. A mosást követően a PBS-sel a sejteket inkubáltuk, egér monoklonális anti-integrin α2 /CD49b ellenanyag (R &D Systems, MN) 37 ° C-on 1 órán át. Mosás után PBS-sel a sejteket inkubáltuk Alexa568-konjugált kecske anti-egér IgG antitest (Life Technologies, Japán) 37 ° C-on 1 órán át. Miután további PBS mosás után a sejteket szerelt alkalmazásával Vectashield DAPI-val (Vector Laboratories) és figyeltek alatt konfokális lézer pásztázó mikroszkópot (IX70; Olympus, Japán). Alkalmazásával a másik gyomorrák sejtvonal GCIY és normál humán hepatocita sejtek ACBRI 3716, celluláris lokalizációt integrin α2 és Alexa488-PFL vizsgáltuk azonos módon, mint a fent leírt, és a megfigyelt fluoreszcens mikroszkóp alatti (OLYMPUS BX51). A hatás a élesztő mannán celluláris lokalizációját PFL és az integrin α2 értékeltük az alábbiak szerint. Az összefolyó MKN28 növesztett sejteket fedőlemezen egy 6 mérőhelyes lemez kezeltük 20 ng /ml Alexa488-PFL RPMI 1640 jelenlétében vagy távollétében 700 ng /ml élesztő mannán 4 órán át. A sejteket rögzítettük, láthatóvá anti-integrin α2 /CD49b ellenanyag a fent leírtak szerint, és a megfigyelt fluoreszcens mikroszkóp alatti (OLYMPUS BX51). Hatása különböző lektinek celluláris lokalizációját integrin α2 vizsgáltuk hasonló módon, inkubálva a MKN28 sejteket 20 ng /ml-t mindkét lektin RPMI 1640 4 órán át.

Eredmények

molekuláris klónozás, a véleménynyilvánítás és tisztítása PFL katalógusa

korábban már találtak genomjának P. fluorescens katalógusa Pf0-1 tartalmaz egy lehetséges homológ anti-HIV-lektin család, amit nemrég találtak kisebb szervezetek, beleértve a baktériumokat, cianobaktériumok és tengeri algák [4]. Ennek alapján a nukleotidszekvenciája hipotetikus lektin a P. fluorescens katalógusa Pf0-1 az adatbázisban, primer készleteket erősítésére tervezték, a lektin gént. A vélt lektin gént sikeresen klónoztuk irányított TOPO klónozó rendszert és a kódoló fehérje heterológ kifejezve E. coli
BL21 (DE3). Az expresszált lektin fehérjét tisztították homogenitásig egyetlen lépésben gélszűréssel Superose 12 oszlopon (1A.). Az aktív csúcs hemagglutináló aktivitását adott egyetlen fehérje sávot 13 kD-os SDS-PAGE (ábra. 1B). Végül 1 alom E. coli
kultúra, magas hozamú tisztított lektin (240 mg) kapunk. A tisztított lektin nevezték PFL és további vizsgálatra. A molekulatömege PFL (13883,7) által meghatározott MALDI-TOF MS volt egyetértésben a számított tömeg (13881,1) ebből levezetett aminosav-szekvenciát, és hogy becsült érték a mobilitási az SDS-PAGE.

A levezetett aminosavszekvenciáját PFL hordozott két homológ domént, amelyek mindegyike az N- és C-terminális felét 62% -os szekvencia azonosságot közöttük. PFL mutatott nagyfokú szekvencia homológiát cianobaktérium lektin OAA be a Oscillatoria agardhii katalógusa, vörös alga lektin ESA-2 Eucheuma serra katalógusa, és bakteriális lektin MBHA be a Myxococcus Xanthus katalógusa (ábra . 2B) tartalmazza, amely új HIV-ellenes lektin család. A molekulatömege PFL és OAA hasonlóak voltak, 13883,7 és 13924,1, illetve, és mindkét lektinek álltak össze 132 aminosav. Mindkét PFL és OAA közös tulajdon szekvenciáját párhuzamos de OAA megjeleníti nagyobb mértékű belső szekvencia azonosságot 75% a két megismételt területeken. Ezzel ellentétben, az ESA-2 és MBHA állnak négy tandem ismétlődő homológ doménjeit 67 aminosav. A fok hasonlóságának OAA, ESA-2 és MBHA a PFL azok N-terminális részek (mindegyik 132 aminosav) az aminosav-szekvenciák voltak 62,1, 61,4, és 62,1% az azonos aminosavakat, ill.

szénhidrát-kötőspecificitását PFL katalógusa

Annak meghatározására, szénhidrát-kötőspecificitását PFL, glikán array vizsgálatot végeztünk a konzorcium funkcionális glikomikai segítségével nyomtatott tömb 5.0 verzió. A 611 típusú oligoszacharidok tesztelt, PFL (10 ug /ml) azt mutatta kizárólagos specificitása magas mannóz típusú glükánt ábrán látható. 3. A teljes listát oligoszacharid tesztelt és az eredmények megtalálhatók online (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp). Katalógusa

PFL erősen kötődik M6 glikán (216 ) és az M8 glikán (212), mindkettő egy kitett α1-3 ember a D2 kar, a hasonló szintű magas RFU értéket, 43471 és 40759, ill. Ezzel szemben a maszkolás ennek α1-3 Ember α1-2 Man drámaian csökkent a kölcsönhatás PFL és a glikánok. Ez leginkább az összehasonlítása M6 glikán (216) és az M7 glikán (211), ahol a további α1-2 Man at D2 kar csökkent a kötési energiája körülbelül 53%. Hasonlóképpen, kötelező potenciáját PFL M9 glikán (213) csökkent (RFU = 8535), míg a párja M8 glikán (212) hiányzik D2 terminál α1-2 Man, amely csak a 21% -át a potenciát. Érdekes, hogy megszűnik a redukáló terminális diszacharid, GlcNAc-GlcNAc magas mannóz glikánjainak sokkal drasztikusan csökkent PFL-kötésben. Például a PFL kötő potenciát majdnem teljesen eltörölte a glikánok 316 és 317 nem rendelkező GlcNAc-GlcNAc szekvenciát mivel ezek megfelelője glikánok 212 és 213, illetve mutatott sokkal magasabb potencia. Különösen fontos a terminál GlcNAc-GlcNAc alátámasztottuk továbbá azzal, összehasonlításával glikánok 217 és 315, bár a mértéke károsodása PFL-kötő korlátozott volt. Ez lektin mentes volt monoszacharid-kötő például a mannóz. Továbbá PFL nem kölcsönhatásba Man α1-6 Man (314) és az mannotriose (214), amelyek összetevői a elágazó részének magas mannóztartalmú glikánok. Pentaszacharidját lényege N¹glikán (50) nem ismerte el PFL de fukoziiált megfelelője (485) jelenik meg a gyenge kölcsönhatás (RFU = 746). Ezek oligoszacharid-kötő profilok PFL voltak nagyon hasonlóak az OAA, ESA-2 és KAA-2, melyek egy új HIV elleni lektin család kisebb szervezetek [4] - [6]. Katalógusa

Anti- influenza vírus aktivitása PFL katalógusa

Anti-influenzavírus aktivitása PFL értékeltük két influenzavírus-törzsek, a /Udorn /72 (H3N2) és a /Beijing /262/95 (H1N1) által NR festék felvételét próba. PFL hatékonyan gátolta sejtkárosító hatás okozta mindkét influenza vírustörzsek, EC _{50-es 19,4 ± 1,5 nM és 4,5 ± 0,4 nM (4A.). Annak igazolására, hogy PFL gátolta a kezdeti lépés az influenza vírus belépését a sejtekbe, eloszlása ​​a virális antigének a fertőzött sejtekben volt megfigyelhető a jelenlétében vagy hiányában PFL alkalmazásával immunfluoreszcencia mikroszkópos. Ábra. 4B mutatja eloszlása ​​a virális antigén után 24 órával a fertőzés az A /Udorn /72 által észlelt specifikus anti-hemagglutinin antitest. PFL hatékonyan gátolta influenza vírus belépését a sejtekbe, míg a vírusok képesek voltak áthatolni és szaporodik a gazdasejtben hiányában PFL. A galaktóz specifikus lektin PNA-re Arachis hypogaea
nem gátolta a vírus belépését a sejtekbe. Ezek az eredmények azt sugallják, jelenlétében magas mannóztartalmú glikánok a vírus felületi abban a pozícióban, kritikus a vírus belépését sejtekbe. Annak tesztelésére, hogy a PFL lenne közvetlenül kötődnek a vírus burok glikoprotein HA, egy ELISA assay-t a kereskedelmi forgalomban kapható vakcina készítmény, amely tartalmaz származó HA A /California /7/09 (H1N1), A /Victoria /210/09 (H3N2), és B /Brisbane /60/08, mint a fő összetevője. Ahogy látható. 4C, dózisfüggő HA kötődését PFL volt megfigyelhető.}

PFL indukált sejthalált humán gyomorrák sejt MKN28

In vitro
tumorellenes hatását PFL on gyomorrák sejt MKN28 értékeltük hagyományos MTS vizsgálattal. Ábrán látható. 5A (bal panel), PFL mutatott dózis-függő hatása a proliferációját MKN28 sejt. 72 óra utáni PFL-kezelés, a sejtek életképessége szignifikánsan csökkent dózisban 0,5 jiM vagy magasabb. Ezzel szemben az alacsony dózisú 0,1-0,3 uM, sejtburjánzás enyhén stimulálta. PFL-indukált sejthalált a MKN28 sejtek kísérte veszteséget sejtadhézió, hogy az alján a kultúra lemez, ábrán látható módon. 5B ahol kihajló klaszter a sejtet figyeltünk barnás vonalak. PFL-indukált sejthalált hatékonyan gátolta a jelenlétében élesztő mannán, egy glikoprotein viselő magas mannóztartalmú oligoszacharidokat (ábra. 5A, jobb panel). Ez azt jelzi, a magas mannóztartalmú glikánok on MKN28 sejteket bevonja a PFL-indukált Cell Signaling, hogy végső soron sejthalálhoz. Ezzel szemben, a normál humán hepatocita sejtek (ACBRI 3716) viszonylag ellenálló a PFL kezelés összehasonlítva MKN28 sejtek (ábra. 5A, bal panel).

izolálása PFL-kötő molekula (k) emberi gyomorrák sejt MKN28

a címet a molekuláris mechanizmus, amely révén PFL sejthalált indukál a MKN28 sejt, sejt felületi molekula (ek), amely PFL kötött vizsgáltuk. A biotinilezett PFL-on inkubáltuk 2 órán MKN28 sejteket, és a sejteket lizáltuk RIPA pufferben, amely 0,1% SDS. A sejtfelszíni molekula (ek), amely biotin-PFL Bound együttadása kicsapjuk avidinnel bevont gyöngyöket. A fehérjéket csapdába gyöngyöket ezt követően eluáljuk SDS-PAGE minta pufferben és elemeztük SDS-PAGE (ábra. 6a). Bár számos nem-specifikus sávok detektáltunk, azt figyeltük meg egy 150 kD-os sávot, amely specifikusan kimutatható PFL kezelt frakcióból. Ez a sáv tovább vetjük alá in-gél emésztését tripszinnel, majd MALDI-TOF tömegspektrometriai analízis. A kapott tömeges peptid ujjlenyomat-adatok (6B.) Adtunk keresett adatbázis és a fehérjét azonosítottak integrin α2, azzal a valószínűsége alapján pontszámok 57 (p < 0,05).

sejten exogén módon hozzáadott PFL és integrin α2 katalógusa

A viselkedés a PFL maga és az integrin α2 kezelés hatására PFL vizsgáltuk egy konfokális fluoreszcens mikroszkóp. Ebben a kísérletben, a fluoreszcens-jelzett PFL (Alexa488-PFL) használtunk, hogy nyomon PFL lokalizáció. Egy Alexa488-PFL inkubáltunk MKN28 sejteket 1, 5 és 24 órán át dózisú 30 ug /ml. Integrin α2 detektáltuk az anti-integrin α2 /CD49b monoklonális antitesttel, majd Alexa568 konjugált 2. antitest. Érdekes, Alexa488-PFL kötődik a sejt felszínén, és kezdeményezte internalizációs a citoplazmába 1 órán belül (ábra. 7). Az integrin α2 amely túlnyomórészt helyi sejtfelszíni egyensúlyi állapotban is átesett internalizáció, és a legfontosabb, a lokalizáció integrin α2 egybeesett jól PFL. 5 óra elteltével inkubálás mind a PFL és az integrin α2 voltak co-lokalizált és felhalmozódott perinukleáris régióban, és további inkubálás alapvetően nem változtatja meg a helyét mindkét fehérje. Ezért valószínű, hogy ha egyszer a PFL kötve integrin α2, mindkét fehérjét még sohasem visszavezetjük a sejt felszínén. Rapid intracelluláris kereskedelem PFL-integrin α2 komplex történt még kollagén I bevonatú fedőlemezeket (az adatokat nem mutatjuk be). Hasonlóképpen, újraelosztása integrin α2 kezelés hatására PFL volt megfigyelhető másik gyomorrák sejtvonal, GCIY, de nem a normális emberi hepatocita sejtek, ACBRI 3716 (ábra. 8). Ebben ACBRI 3716 sejtekben internalizálódása PFL nem volt megfigyelhető esetleg a kisebb kifejezése integrin α2 sejtfelszíni. Katalógusa

bevonása magas mannóz glikánjainak a PFL-integrin α2 kölcsönhatás katalógusa

Annak tesztelésére, hogy a sejt- újraelosztása integrin α2 okozta PFL eredhet specifikus kölcsönhatás a PFL magas mannóz glikánjainak az integrin α2 molekula, értékeltük a hatását élesztő mannán a PFL-indukált integrin α2 internalizáció segítségével MKN28 sejteket. Hiányában élesztő mannán, mindkét fehérje esett jelentős internalizációs (ábra. 9A, felső panelek). Ezzel ellentétben, a jelenlétében az élesztő mannán, PFL nem kötődött a sejtfelszíni, és az ezt követő intracelluláris kereskedelem PFL teljesen megszüntették (ábra. 9A, jobb alsó). Beleegyezik, hogy ez a megfigyelés, integrin α2 nem változtatott lokalizáció jelenlétében élesztő mannán (ábra. 9A, bal alsó). Ezek az eredmények világosan jelzik, hogy a PFL kötve integrin α2 elismerésén keresztül magas mannóz glikánjainak az integrin α2. Ahhoz, hogy tovább erősítse a követelménynek magas mannóz glikánjainak integrin α2 újraelosztás, már tesztelték hatását különböző lektinek a sejten integrin α2. Ábrán látható. 9B más lektinek különböző sajátosságait, mint a galaktóz-kötő PNA-re Arachis hypogaea katalógusa, fruktóz-kötő AOL-re Aspergillus oryzae katalógusa sziálsav-kötő MAM-re Maackia amurensis
, D-GlcNAc-kötő UDA származó Urtica dioica
nem befolyásolta a helyét az integrin α2. Érdekes, hogy még a nagy mannóz kötő lektinek, mint egy egyszikű mannóz (Man) kötő lektin, GNA Galanthus nivalis katalógusa nem mutatott jelentős változást az integrin α2. Ezzel szemben a nagy mannóz kötő lektin hüvelyes ConcanavalinA (ConA) torzította elrendezése integrin α2 mint PFL tette. Katalógusa

Vita katalógusa

Ebben a tanulmányban értékelték a biológiai aktivitását új bakteriális lektin PFL-re P. fluorescens katalógusa Pf0-1 tartozik, hogy a közelmúltban találtak a HIV-ellenes lektin család kisebb szervezetekre. Előfordulása növekszik a gyógyszer-rezisztens törzsek, valamint a feltörekvő erősen patogén vírus törzsek, mint például a madárinfluenza H5N1 vezetett bennünket, hogy vizsgálja PFL mint új anti-influenza szerként. PFL mutatta, erős anti-influenza-vírus aktivitás, és a mechanizmus, amely által a PFL gátolta a vírus replikációját volt gátlását a kezdeti lépés a vírus belépését sejtekbe. Ez a legvalószínűbb, hogy a PFL gyakorolt ​​anti-influenza-aktivitás szelektív kötődés magas mannóztartalmú glikánok a virális burok HA, amint azt ELISA vizsgálattal [9]. Tény, hogy a helyspecifikus előfordulása magas mannóztartalmú oligoszacharid látható a régióban a HA közel a receptorkötő hely [10].

Hogy vizsgálja tumorellenes hatását PFL, mi alkalmazott humán gyomorrák sejtvonal MKN28 amely származik egy közepesen differenciált intesztinális típusú daganat. A vörös alga lektin ESA-2, amely ugyanabban a lektin család PFL mutatott tumorellenes hatást mind in vitro katalógusa és in vivo katalógusa [7], [8]. ESA-2 egy származó fehérje az ehető tengeri moszat és várható, hogy gyakoroljon daganatellenes hatást a gyomor-bél traktus rák orális beadással. Figyelemre méltó, hogy a PFL elősegítette sejt halálát MKN28 sejt, kizárólag a elismeréseként magas mannóztartalmú glikánok on integrin α2-molekula, amely túlnyomórészt található sejtfelszíni egyensúlyi állapotban. Heterodimer integrin jár nem csak mint rögzítési molekula csatolni sejteket egy megfelelő extracelluláris mátrix (ECM), hanem például érzékelők az ECM környezet [11].

• PLoS One: Honokiol indukál Calpain glükózfelhasználással szabályozott fehérje-94 hasítása és apoptózis humán gyomorkarcinóma sejtek és csökkenti a tumor növekedés
• Típusú gyomorrák