PLOS ONE: High Mannose-Binding Antiviral lectine PFL de Pseudomonas fluorescens Pf0-1 Favorise la mort cellulaire des cellules du cancer gastrique MKN28 via Interaction avec-Integrin

Résumé

anti-VIH famille des lectines Novel qui montre une stricte spécificité de liaison pour glycanes riches en mannose a été trouvé dans les organismes inférieurs. L'orthologue bactérien a été identifié dans le génome de Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 et le gène codant pour une lectine putative a été clone, exprimé en Escherichia coli
et purifié par une filtration sur gel de l'étape. Glycan dépistage du tableau de la lectine recombinante, appelée PFL, a révélé que PFL reconnaît préférentiellement les glycanes riches en mannose avec Man α1-3 qui a été fortement exposée à la position D2. En revanche, le masquage de cet homme α1-3 avec α1-2 Man avec facultés affaiblies de façon spectaculaire interactions lectine-hydrate de carbone. Réduire disaccharide terminal, GlcNAc-GlcNAc de glycanes riches en mannose était également essentiel pour PFL contraignant. PFL a montré une activité anti-virus de la grippe puissante en inhibant l'entrée dans les cellules du virus, à des doses de concentration nanomolaire faible. A concentration micromolaire ou plus, PFL a montré une cytotoxicité accompagnant la perte de l'adhérence cellulaire contre les cellules humaines de cancer gastrique MKN28. La molécule de la surface cellulaire à laquelle a été liée PFL co-précipité avec de la biotine marquée PFL et identifié comme étant intégrine α2 par le peptide empreinte de masse MALDI-TOF. Curieusement, lors du traitement avec exogène PFL, α2 intégrine sur la surface cellulaire a subi une internalisation rapide dans le cytoplasme et accumulé à la région périnucléaire, conjointement avec le PFL lié. La perte d'adhérence cellulaire résultant déclencherait une voie de signalisation qui induit la mort cellulaire anoikis-like. Ces événements ont effectivement été inhibées par le prétraitement de PFL avec mannnan, indiquant l'implication des glycanes riches en mannose sur la mort cellulaire PFL-induite qui a été déclenchée par des interactions a2 PFL-intégrine

Citation:. Sato Y, Morimoto K, Kubo T, Yanagihara K, Seyama T (2012) haut Mannose-Binding Antiviral lectine PFL de Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 Favorise la mort cellulaire des cellules du cancer gastrique MKN28 via Interaction avec α2-intégrine. PLoS ONE 7 (9): e45922. doi: 10.1371 /journal.pone.0045922

Editeur: Roger Chammas, Universidade de São Paulo, Brésil

Reçu: 7 mai 2012; Accepté le 27 Août 2012; Publié 20 Septembre, 2012 |

Droit d'auteur: © Sato et al. Ceci est un article en accès libre distribué sous les termes de la licence Creative Commons Attribution, qui permet une utilisation sans restriction, la distribution et la reproduction sur tout support, à condition que l'auteur et la source originelle sont crédités

Financement:. Cette recherche a été soutenu en partie par une subvention en aide pour jeunes scientifiques (B) de la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) (numéro Grant 24790101). Les bailleurs de fonds ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier, ou de la préparation du manuscrit

Intérêts concurrents:.. Les auteurs ont déclaré aucun conflit d'intérêts existent

Introduction

lectines haute mannose contraignant qui ciblent les glycanes spécifiques sur une surface du virus sont prometteurs agents viraux inactivant potentiels qui pourraient être utilisés pour la prévention et le contrôle des infections virales [1], [2]. De nombreuses lectines qui reconnaissent spécifiquement les glycanes riches en mannose se trouvent à partir de diverses taxonomie, y compris les bactéries, les algues, les plantes et les animaux, et dont certains se sont révélés présenter une activité anti-VIH [3]. Nous avons récemment découvert une famille de lectine anti-VIH roman distribué dans les organismes inférieurs, y compris les bactéries, les cyanobactéries et les algues marines [4]. Ils présentent des caractéristiques communes, telles que la séquence multiplication de domaine N-terminal hautement conservé et reconnaissances exclusifs d'oligosaccharides riches en mannose. Certains lectines dans cette famille tels que OAA cyanobactérie de Oscillatoria agardhii
[4] et les algues rouges ESA-2 à partir de Eucheuma SERRA
[5] ont montré pour inhiber l'entrée du VIH dans les cellules hôtes avec EC _{50 de bas de gamme nanomolaire par lie directement à l'enveloppe gp120. En outre, une algue rouge lectine KAA-2 à partir de Kappaphycus alvarezii
, qui appartient aussi à cette famille inhibe l'infection de diverses souches de virus de la grippe avec EC 50 des niveaux nanomolaires faibles d'une manière de souche indépendante, par le biais la reconnaissance de haute oligosaccharide mannose sur la glycoprotéine d'enveloppe virale hémagglutinine (HA) [6].}

en plus de l'activité antivirale, l'ESA-2 présente diverses activités biologiques telles que l'activité mitogene pour les souris et les lymphocytes humains et in vitro
inhibition des cellules tumorales de croissance [7], [8]. Bien que les propriétés biologiques de cette famille de lectine deviennent apparents, les propriétés des orthologues bactériennes de Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 et Herpetosiphon aurantiacus
encore restent à être clarifiées.

la présente étude, nous avons cloné le gène orthologue de lectine de P. fluorescens
Pf0-1 et la protéine codée lectine (PFL) a été exprimée dans Escherichia coli
. PFL fonctionnel a été purifié avec succès avec un rendement élevé et caractérisé en ce qui concerne ses activités biologiques telles que l'activité antivirale et anti-tumorale. Comme prévu de similarité structurale intense de PFL avec d'autres membres de cette famille de lectine, PFL présentait une spécificité exclusive pour une grande oligosaccharide mannose et une puissante activité antivirale contre le virus de la grippe. En outre, PFL induit la mort cellulaire de anoikis comme des cellules de cancer gastrique MKN28 par interaction avec la surface cellulaire α2 intégrine.

Matériaux Matériaux et méthodes

culture Stab de P. fluorescens
Pf0-1 a été généreusement fourni par le Dr Mark W. Silby (University of Massachusetts Dartmouth, États-Unis). Les virus grippaux et rénales canines (MDCK) Madin-Darby ont été généreusement fournis par le Dr T. Sakaguchi (Université d'Hiroshima, Japon): Les virus de la grippe ont été cultivées dans le liquide chorio de 10 jours d'âge des œufs de poule. des cellules MDCK ont été cultivées dans un milieu Eagle modifié par Dulbecco (DMEM) supplémenté avec 10% de sérum de fœtus bovin et de la pénicilline-streptomycine. Une lignée de cellules de cancer de l'estomac, MKN28 a été gracieusement fournie par le professeur Suzuki (Université médicale de Fukushima, Fukushima, Japon). La lignée cellulaire a été maintenue dans un milieu RPMI-1640 (GIBCO, Grand Island, NY) supplémenté avec 10% de sérum fœtal bovin (FBS, Gibco), 100 Ul /ml de pénicilline G sodique et 100 mg /ml de sulfate de streptomycine. Une autre lignée de cellules de cancer de l'estomac, GCIY, a été achetée auprès RIKEN CELL BANK (Ibaraki, Japon) et on le maintient de la même manière que celle décrite ci-dessus. cellule hépatocyte humain normal primaire (ACBRI 3716) a été acheté chez DS Pharma Biomedical (Osaka, Japon) et maintenu en CS-C kit moyen R (DS Pharma biomédicale).

Test d'Hémagglutination

Hémagglutination essai a été réalisé en utilisant une suspension à 2% (v /v) d'érythrocytes de lapin traités par la trypsine comme décrit précédemment [9]. En bref, le lapin érythrocytaire natif suspension a été traitée avec 0,5% de trypsine dans une solution saline et le mélange incubé à 37 ° C pendant 60 min. Après un lavage avec une solution saline, 2% d'erythrocytes traités à la trypsine suspension a été préparée dans du sérum physiologique. activité hémagglutination a été exprimée comme un titre, l'inverse de la plus forte dilution de 2 fois présentant hémagglutination positive.

Gene clonage et l'expression de la lectine PFL

L'ADN génomique de P. fluorescens
Pf0-1 a été utilisé comme matrice pour le clonage de gène d'un gène PFL. Dans un premier temps, une amorce ensemble d'oligonucléotides, 5'-GGCAGGTCTCCCGAAACTTCAAG-3 'et 5'-AGTCGAACGCCTGAACCTGTTGA-3', qui hybride avec amont et en aval de la région codante PFL, respectivement, ont été utilisés, et la PCR a été réalisée en utilisant le premier ADN STAR la polymerase (Takara). En utilisant le fragment amplifié par PCR en tant que matrice, la PCR subséquente a été réalisée avec une amorce directe, 5'-CACCATGTCTAAATACGCAGTGGCA-3 ', qui a la séquence CACC supplémentaire au codon d'initiation ATG du gène PFL, et une amorce inverse, 5'-TTACTCTATCTGCCCACGGAAG -3 '(TTA, correspondant au codon d'arrêt du gène RFL). Les fragments amplifiés ont été ligaturées dans le vecteur d'expression pET101 /D-TOPO. Le plasmide recombinant a été transformé en Escherichia coli
cellules TOP10 (Invitrogen). Les clones recombinants obtenus ont été confirmés comme étant une construction correcte par séquençage d'ADN. Les clones fonctionnels ont été transformés dans Escherichia coli
BL21 Star (DE3) cellules pour l'expression inductible du gène PFL. IPTG à une concentration finale de 0,8 mM a été ajouté à la culture transformée pour induire l'expression PFL. Après 6 heures d'incubation à 37 ° C, les cellules ont été récoltées par centrifugation à 8000 tours par minute pendant 20 minutes.

Purification de lectine PFL

Les cellules bactériennes récoltées ont été remises en suspension dans 20 mM de tampon phosphate ( pH 7,0) contenant du NaCl 0,15 M (PBS) et ont été rompues par sonication. Après centrifugation à 8000 tpm pendant 20 minutes, une aliquote du surnageant a été soumis à une colonne Superose 12 (GE Healthcare) équilibrée avec du PBS. On élue la colonne avec du PBS à un débit de 0,8 ml /min en mode isocratique. L'éluat a été contrôlé par absorption à 280 nm et examinés pour l'activité d'hemagglutination, et les fractions actives ont été réunies.

Détermination du poids moléculaire de PFL

Le poids moléculaire du PFL a été déterminée par MALDI-TOF analyse MS avec un spectromètre de masse Autoflex (Bruker, Japon) après la calibration avec un kit standard de masse peptidique (Bruker, Japon) en utilisant l'acide sinapinique comme matrice.

séquence d'ADN analyse
séquences

nucléotidiques ont été déterminées par la méthode de terminaison de chaîne didésoxy en utilisant une version 3.1 kit de séquençage BigDye Terminator cycle (Applied Biosystems). Le séquençage d'ADN a été effectué en utilisant un analyseur génétique ABI 310 (Applied Biosystems).

Analyse tableau Glycan

PFL a été marqué avec Alexa Fluor 488 selon les instructions du fabricant (Invitrogen, Eugene, OR). une spécificité de liaison Glycan de PFL a été déterminée par les microarrays glycanes imprimés (version 5.0) selon la procédure standard de COREH du Consortium pour Glycomics fonctionnels (CFG) (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp ). La fluorescence relative moyenne en réplicats de six a été calculé en faisant la moyenne de quatre valeurs après avoir enlevé les valeurs les plus élevées et les plus basses pour éliminer certains des faux résultats avec des points très hautes ou basses. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne (SEM), et% CV est le coefficient de variation (SD /moyenne) calculée en%.

Activité anti-grippe de PFL

in vitro
l'activité anti-influenza PFL est déterminée par le rouge neutre (NR) essai d'absorption du colorant. Diverses concentrations de PFL ont été préparées avec du DMEM contenant 10 pg /ml de trypsine dans une microplaque à 96 puits. A chaque puits, le virus a été ajouté sous forme d'une multiplicité d'infection d'environ 0,001 particules infectieuses par cellule. Après incubation à 37 ° C pendant 48 h, 100 ul de colorant NR (150 pg /ml dans du DMEM) ont été ajoutés et mis à incuber pendant encore 2 heures. NR tinctoriale incorporée dans les cellules a été extrait par addition de 100 pi de 1% d'acide acétique /50% d'éthanol. Les puits ont été mesurées à 540 nm avec un lecteur de microplaques (1420 multilabel compteur, PerkinElmer, MA, USA) en tant que facteur de survie de l'effet cytopathique du virus.

Immunofluorescence coloration de immunofluorescence Microscopie était réalisée pour visualiser l'inhibition de l'entrée du virus grippal par PFL. En bref, des cellules MDCK cultivées sur le verre de recouvrement ont été infectées avec A /Udorn /72 à une multiplicité d'infection d'environ 0,001 particules infectieuses par cellule, en présence ou en absence de 200 nM PFL dans du DMEM contenant 10 pg /ml de trypsine. Après 24 h après l'infection, les cellules infectées ont été fixées avec 80% d'acétone pendant 5 min. Après lavage avec du PBS, les cellules ont été incubées avec un anticorps monoclonal de souris anti-HA (Hytest, Turku, Finlande) à 37 ° C pendant 1 h. Après lavage avec du PBS, les cellules ont été incubées avec un anticorps isothiocyanate de fluorescéine (FITC) de chèvre conjuguée à une IgG anti-souris (anticorps Secondaires, Compiègne, France) à 37 ° C pendant 1 h. Après un nouveau lavage PBS, les cellules ont été montées en utilisant du Vectashield avec 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) et ont été observées sous microscopie à fluorescence (Olympus BX51, Olympus, Japon).

ELISA

l'interaction directe avec des PFL glycoprotéine d'enveloppe virale HA a été dosée en utilisant un dosage immnosorbent lié à une enzyme (ELISA). PFL (5 pg /ml) dans un tampon de carbonate (pH 9,6) a été appliquée sur des plaques ELISA de 96 puits (BD Biosciences, Bedford, MA). Les puits ont été lavés trois fois avec du PBS contenant 0,1% de Tween 20 (PBST) et bloqué avec 3% de lait écrémé à 37 ° C pendant 1 h. Après lavage avec du PBST, en faisant varier les concentrations de préparation d'un vaccin contre la grippe HA (Astellas, Tokyo, Japon) ont été ajoutés à chaque puits et mis en incubation à 37 ° C pendant 1 h. Après lavage avec du PBST, les puits ont été incubées avec des anticorps de souris anti-HA monoclonal (Hytest) à 37 ° C pendant 1 h, suivi d'une incubation avec la peroxydase de raifort (HRP) conjuguée à de chèvre anti-souris IgG (GE Healthcare, Royaume-Uni ) à 37 ° C pendant 1 h. Par la suite 3,3 ', 5,5'-tétraméthylbenzidine (TMB) (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MI) a été ajouté. La réaction a été arrêtée en utilisant le réactif TMB d'arrêt (Sigma-Aldrich) et l'absorbance à 450 nm a été mesurée en utilisant un lecteur de microplaques (1420 multilabel compteur, PerkinElmer).

Tumeur prolifération cellulaire par MTS test

la prolifération cellulaire a été quantifiée par un test au MTS classique en utilisant 96 la prolifération cellulaire CellTiter dosage (Promega, Madison, WI). Les cellules ensemencées sur microplaque à 96 puits ont été incubées pendant 72 h avec diverses concentrations de PFL en milieu approprié avec 10% de FBS. Les cellules ont été ensuite mises en incubation avec 20 ul de réactif MTS pendant 1 h à 37 ° C et mesurée avec un lecteur de microplaques (1420 Multilabel counter, PerkinElmer) à 490 nm. L'effet de mannane de levure sur cytotoxicité de PFL a été déterminée en incubant les cellules avec 5 uM PFL en présence de diverses concentrations de mannane de levure dans un milieu RPMI 1640 avec 10% de FBS pendant 72 h, et la viabilité cellulaire a été mesurée comme décrit ci-dessus.

Isolement de PFL molécule de liaison (s) sur MKN28 cellule

PFL a été marqué avec de la biotine en utilisant le kit de marquage à la biotine (technologies moléculaires DOJINDO, Japon) selon les instructions du fabricant. Pour confluentes MKN28 cellules sur lamelles, biotinylé-PFL (200 ug) a été ajouté et incubé pendant 2 h à température ambiante. Après un lavage avec du PBS froid, les cellules ont été raclées et lysées dans 800 ul de tampon RIPA (50 mM de Tris-HCl, pH 7,6, NaCl 150 mM, 1% de Nonidet P40, 0,5% de désoxycholate de sodium, le cocktail inhibiteur de protease, 0,1% de SDS ). Ensuite, 100 ul de billes de capture de biotine-avidine (Adar Biotech, Israël) ont été ajoutés au lysat cellulaire et incubées pendant une nuit à 4 ° C sous agitation douce. Les billes ont été lavées trois fois avec 50 mM de Tris-HCl, pH 7,5. les protéines capturées sur les perles ont été éluées avec 50 ul de tampon échantillon SDS-PAGE (Tris 62,5 mM, pH 6,8, 2% de SDS, 10% de glycerol, 1% de mercaptoéthanol, 0,003% de bleu de bromophénol) pendant 15 min à 90 ° C et soumis à SDS-PAGE. La bande de protéine spécifique pour la fraction de traitement PFL a été analysé par MALDI-TOF après digestion dans le gel avec de la trypsine. En bref, les bandes de protéines colorées ont été CBB découpées et décolorés avec 25 mM de bicarbonate d'ammonium contenant 50% d'acétonitrile. L'alkylation réductrice est effectuée avec 50 mM de TCEP (tris [2-carboxyéthyl] phosphine) dans 25 mM de bicarbonate d'ammonium, suivie d'une incubation avec 50 mM iodoacetoamide pendant 1 h. Après séchage avec de l'acétonitrile, la protéine dans le gel a été digéré avec 10 ul de TPCK-trypsine (100 ug /ml) dans 50 mM de bicarbonate d'ammonium. La digestion a été purifié avec pointe Zip (Millipore, Japon) et repéré sur une cible MALDI. Un pi de solution de matrice (α-cyano-4-hydroxycinnapic matrice d'acide [Bruker, Japon] dans de l'acétone-éthanol [01:02]) a ensuite été ajouté à la place. analyse MALDI-TOF MS a été réalisée par un spectromètre de masse Autoflex (Bruker, Japon) après la calibration avec un peptide de masse kit standard (Bruker, Japon). La masse des données de peptide d'impression de doigt a été fouillé par le logiciel Mascot (matrice Science, Japon).

localisation cellulaire de PFL et intégrine α2

MKN28 cellules ont été cultivées sur des lamelles dans une plaque à 6 puits . Les cellules en croissance sur des lamelles ont été traitées avec 30 pg /ml de conjugué-Alexa488 PFL dans un milieu RPMI 1640 et mises en incubation pendant des périodes de temps différentes. Après lavage avec du PBS, les cellules ont été fixées avec 80% d'acétone pendant 5 min. Après lavage avec du PBS, les cellules ont été incubées avec un anticorps monoclonal de souris anti-intégrine α2 /anticorps CD49b (R & D Systems, MN) à 37 ° C pendant 1 h. Après lavage avec du PBS, les cellules ont été incubées avec un anticorps de chèvre conjugué à Alexa568-anti-souris IgG (Life Technologies, Japon) à 37 ° C pendant 1 h. Après un nouveau lavage PBS, les cellules ont été montées en utilisant du Vectashield avec du DAPI (Vector Laboratories) et ont été observés au microscope confocal à balayage laser microscope (IX70, Olympus, Japon). En employant l'autre lignée cellulaire de cancer gastrique GCIY et des cellules d'hépatocytes humains normaux ACBRI 3716, localisation cellulaire de l'intégrine α2 et Alexa488-PFL ont été examinées de la même manière que celle décrite ci-dessus, et observés au microscope à fluorescence (Olympus BX51). L'effet de mannane de levure sur la localisation cellulaire de PFL intégrine α2 a été évaluée comme suit. Les cellules confluentes cultivées sur des lamelles couvre-MKN28 dans une plaque à 6 puits ont été traitées avec 20 pg /ml de Alexa488-PFL dans du RPMI 1640 en présence ou en absence de 700 pg /ml de mannane de levure pendant 4 h. Les cellules ont été fixées, visualisé en utilisant α2 anti-intégrine /anticorps CD49b tel que décrit ci-dessus, et observés au microscope à fluorescence (Olympus BX51). Effet de diverses lectines sur la localisation cellulaire de l'intégrine α2 a été examinée de manière similaire, en faisant incuber les cellules MKN28 avec 20 pg /ml de chaque lectine dans un milieu RPMI 1640 pendant 4 h.

Résultats

le clonage moléculaire, l'expression et la purification de PFL

Nous avons déjà trouvé le génome de P. fluorescens
Pf0-1 contient une possible homologue d'anticorps anti-VIH famille des lectines qui a été récemment trouvé dans les organismes inférieurs, y compris les bactéries, les cyanobactéries et les algues marines [4]. Sur la base de la séquence nucléotidique de la lectine hypothétique P. fluorescens
Pf0-1 sur la base de données, les ensembles d'amorces ont été conçues pour amplifier le gène de la lectine. gène de la lectine putative a été clone avec succès par le système de clonage TOPO directionnel, et la protéine de codage a été exprimé de manière hétérologue dans E. coli
BL21 (DE3). La protéine lectine exprimée a été purifiée jusqu'à homogénéité par une simple filtration sur gel de l'étape sur colonne Superose 12 (Fig. 1A). Le pic actif avec une activité d'hemagglutination a donné une seule bande de protéine de 13 kDa sur SDS-PAGE (Fig. 1B). Enfin, à partir de 1 litre E. coli de la culture, à haut rendement de la lectine purifiée (240 mg) a été obtenu. La lectine purifiée a été nommé PFL et utilisé pour un examen plus approfondi. La masse moléculaire de PFL (13.883,7) déterminée par MALDI-TOF MS était en accord avec la masse calculée (13.881,1) à partir de la séquence d'acides aminés déduite et que la valeur estimée par la mobilité sur SDS-PAGE.

Le déduit la séquence d'acides aminés de la PFL hébergeait deux domaines homologues, chacun consistant en des moitiés N- et C-terminales ayant une identité de séquence de 62% entre elles. PFL présentait une homologie de séquence élevée à cyanobactérie lectine OAA de Oscillatoria agardhii
, algues rouges lectine ESA-2 à partir de Eucheuma SERRA
et lectine bactérienne MBHA de Myxococcus Xanthus
(Fig . 2B), qui constituent une famille nouvelle de lectine anti-HIV. La masse moléculaire de PFL et OAA étaient similaires, 13.883,7 13.924,1 et, respectivement, et les deux lectines étaient composés de 132 acides aminés. Les deux PFL et OAA ont une propriété commune dans sa duplication de séquence, mais OAA affiche plus haut degré d'identité de séquence interne de 75% entre les deux domaines répétés. En revanche, l'ESA-2 et MBHA sont composées de quatre domaines homologues répétés en tandem de 67 acides aminés. Les degrés de similitude entre OAA, ESA-2 et MBHA PFL dans leurs parties N-terminales (chacun de 132 résidus) des séquences d'acides aminés ont été de 62,1, 61,4 et 62,1% pour les acides aminés identiques, respectivement

la spécificité de liaison de glucide de PFL

pour déterminer la spécificité de liaison de glucide de PFL, l'analyse de réseau glycanes a été réalisée au Consortium pour Glycomics fonctionnels en utilisant la version de tableau imprimé 5.0. Des 611 types d'oligosaccharides testés, PFL (10 pg /ml) ont montré une spécificité exclusive pour les glycanes riches en mannose de type tel que représenté sur la Fig. 3. La liste complète des oligosaccharides testés et les résultats peuvent être consultés en ligne à (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp).

PFL fortement lié aux glycanes M6 (216 ) et glycane M8 (212), qui ont tous deux un homme α1-3 exposé sur le bras D2, avec les niveaux similaires de valeurs RFU élevées, 43471 et 40759, respectivement. En revanche, le masquage de cet homme α1-3 avec α1-2 Man altérée de façon spectaculaire l'interaction entre PFL et les glycanes. Cela était particulièrement évident par la comparaison des glycanes M6 (216) et glycane M7 (211), où l'Homme α1-2 supplémentaire à bras D2 réduit la puissance de liaison d'environ 53%. De même, la puissance de liaison de PFL à glycane M9 (213) a diminué (RFU = 8535) par rapport à son homologue glycane M8 (212) manque D2 borne α1-2 Man, montrant que 21% de la puissance. Fait intéressant, le retrait du terminal disaccharide réducteur, GlcNAc-GlcNAc de glycanes riches en mannose très fortement diminuée PFL contraignante. Par exemple, l'activité de liaison PFL est presque complètement aboli les glycanes 316 et 317 ayant aucune séquence GlcNAc-GlcNAc alors que ceux glycanes homologue 212 et 213, respectivement, ont présenté la puissance beaucoup plus élevée. L'importance de la borne GlcNAc-GlcNAc a été confirmée par la comparaison des glycanes 217 et 315, bien que l'ampleur de la dépréciation du PFL liaison a été limitée. Cette lectine était dépourvue de monosaccharide de liaison, y compris le mannose. En outre, PFL n'a pas interagi avec l'Homme α1-6 Man (314) et mannotriose (214), qui sont des constituants de la partie ramifiée de glycanes riches en mannose. Pentasaccharide noyau de N-glycane (50) n'a pas été reconnu par PFL, mais son homologue fucosylé (485) affiche interaction faible (RFU = 746). Ces profils de liaison des oligosaccharides PFL étaient très semblables à ceux des OAA, ESA-2 et KAA-2 qui appartiennent à un roman anti-VIH famille des lectines dans les organismes inférieurs [4] - [6].

Anti- virus de la grippe activité de PFL

Anti-activité grippale du virus de PFL a été évaluée avec deux souches de virus de la grippe, A /Udorn /72 (H3N2) et A /Beijing /262/95 (H1N1) par le colorant absorption NR essai. PFL effet cytopathique a inhibé efficacement provoqué par les deux souches de virus de la grippe, avec EC _{50 19,4 ± 1,5 nM et 4,5 ± 0,4 nM, respectivement (Fig. 4A). Pour confirmer que PFL a inhibé l'étape initiale d'entrée de virus de la grippe dans les cellules, la distribution des antigènes viraux dans les cellules infectées a été observée en présence ou en l'absence de PFL en utilisant la microscopie à immunofluorescence. Figue. La figure 4B montre la distribution de l'antigène viral après post-infection 24 h avec A /Udorn /72 détectée par un anticorps spécifique anti-hémagglutinine. PFL efficacement inhibé l'entrée du virus de la grippe dans les cellules tandis que les virus étaient capables de pénétrer et de se répliquer dans les cellules hôtes en l'absence de PFL. Un PNA galactose lectine spécifique de Arachis hypogaea
n'a pas réussi à inhiber l'entrée du virus dans les cellules. Ces résultats indiquent la présence de glycanes riches en mannose à la surface du virus à la position critique pour l'entrée du virus dans les cellules. Pour tester si PFL lierait directement à la glycoprotéine d'enveloppe virale HA, un test ELISA a été réalisée avec disponible dans le commerce préparation d'un vaccin contenant HA de A /California /7/09 (H1N1), A /Victoria /210/09 (H3N2), et B /Brisbane /60/08 en tant que composant majeur. Comme il est démontré sur la Fig. 4C, on a observé dose-dépendante la liaison de HA à PFL.}

PFL mort cellulaire induite par des cellules de cancer gastrique humain MKN28

In vitro
effet anti-tumoral de PFL cellule de cancer gastrique MKN28 a été évaluée par un test MTS classique. Comme on le voit sur la Fig. 5A (panneau de gauche), PFL a montré un effet dépendant de la dose sur la prolifération des cellules MKN28. À 72 h après le traitement PFL, la viabilité cellulaire a diminué de manière significative à des doses de 0,5 pm ou plus. En revanche, aux faibles doses de 0,1-0,3 uM, la prolifération cellulaire a été légèrement stimulée. La mort cellulaire induite par PFL de cellules MKN28 est accompagnée d'une perte d'adhérence des cellules au fond des plaques de culture, comme le montre la Fig. 5B où amas éversée de cellules ont été observées sous forme de lignes brunâtres. La mort cellulaire induite par PFL a été effectivement inhibée en présence de mannane de levure, une glycoprotéine portant haut oligosaccharides de mannose (Fig. 5A, panneau de droite). Ceci indique les glycanes riches en mannose sur des cellules MKN28 sont à associer PFL induite par la signalisation cellulaire conduisant finalement à la mort cellulaire. En revanche, les cellules d'hépatocytes humains normaux (ACBRI 3716) étaient relativement résistantes au traitement PFL par rapport aux MKN28 cellules (Fig. 5A, panneau de gauche).

Isolement de molécule (s) PFL liaison sur la cellule de cancer gastrique humain MKN28

pour résoudre le mécanisme moléculaire par lequel PFL induit la mort cellulaire de cellules MKN28, molécule (s) de surface cellulaire à laquelle a été étudiée PFL liée. PFL biotinylé a été incubée pendant 2 heures avec des cellules MKN28 et les cellules ont été lysées avec un tampon RIPA contenant 0,1% de SDS. La molécule (s) de surface de la cellule à laquelle la biotine PFL liés ont été co-précipités avec des billes revêtues d'avidine. Les protéines piégées sur des billes ont ensuite été éluées avec un tampon échantillon SDS-PAGE et analysées sur SDS-PAGE (Fig. 6A). Bien que plusieurs bandes non spécifiques ont été détectées, on a observé une bande de 150 kDa qui spécifiquement détectée dans la fraction traitée PFL. Cette bande a été en outre soumis à une digestion dans le gel de la trypsine, suivie par MALDI-TOF analyse spectrométrique de masse. Les peptides obtenus de masse de données d'empreintes digitales (Fig. 6B) ont été recherchées pour la base de données et la protéine a été identifiée comme intégrine α2, avec des scores de la probabilité sur la base de 57 (p < 0,05).

Localisation cellulaire de manière exogène ajouté PFL et intégrine α2

Les comportements de PFL lui-même et α2 intégrine lors du traitement avec PFL ont été examinés à l'aide d'un microscope à fluorescence confocale. Dans cette expérience, marqué par fluorescence PFL (Alexa488-PFL) a été utilisé pour suivre PFL localisation. Un Alexa488-PFL a été mis en incubation avec les cellules MKN28 pour 1, 5 et 24 heures à des doses de 30 pg /ml. α2 intégrine ont été détectés avec le /anticorps monoclonal CD49b de α2 anti-intégrine suivie par 2 anticorps Alexa568 conjugué. Fait intéressant, Alexa488-PFL lié à la surface cellulaire et initiée à l'intériorisation cytoplasme en 1 h (Fig. 7). α2 intégrine qui a été principalement localisée sur la surface cellulaire à l'état d'équilibre a également subi l'intériorisation, et surtout, la localisation de l'intégrine α2 coïncidait bien avec PFL. Après 5 heures d'incubation, les deux PFL et intégrine α2 ont été co-localisés et accumulés dans la région périnucléaire et une incubation supplémentaire essentiellement n'a pas modifié l'emplacement des deux protéines. Il est donc probable qu'une fois PFL liée à l'intégrine α2, les deux protéines ont jamais été recyclé à la surface cellulaire. trafic intracellulaire rapide du complexe α2 PFL-intégrine a eu lieu lamelles même sur le collagène I Coated (données non présentées). De même, la redistribution de l'intégrine α2 lors du traitement avec PFL a été observé dans une autre lignée cellulaire de cancer gastrique, GCIY, mais pas dans les cellules d'hépatocytes humains normaux, ACBRI 3716 (Fig. 8). Dans ACBRI 3716 cellules, intériorisation de PFL n'a pas été observé peut-être par l'expression moindre de intégrine α2 sur la surface cellulaire.

Implication des glycanes riches en mannose sur l'interaction α2 PFL-intégrine

Pour tester si cellulaire la redistribution de l'intégrine α2 provoquée par PFL peuvent résulter d'une interaction spécifique avec des PFL glycanes riches en mannose sur la molécule d'intégrine α2, nous avons évalué l'effet de mannane de levure sur PFL induite intériorisation intégrine α2 utilisant des cellules MKN28. En l'absence de mannane de levure, les deux protéines ont subi une intériorisation significative (fig. 9A, panneaux supérieurs). En revanche, en présence de mannane de levure, PFL n'a pas réussi à se lier à la surface cellulaire et le trafic intracellulaire subséquente de PFL a été complètement aboli (Fig. 9A, en bas à droite). Accepter de cette observation, l'intégrine α2 n'a pas changé sa localisation dans la présence de mannane de levure (Fig. 9A, en bas à gauche). Ces résultats indiquent clairement que PFL lié à l'intégrine α2 par la reconnaissance des glycanes riches en mannose sur intégrine α2. Pour confirmer davantage l'exigence de glycanes riches en mannose à l'intégrine α2 redistribution, nous avons testé l'effet de différentes lectines sur la localisation cellulaire de l'intégrine α2. Comme on le voit sur la Fig. 9B, d'autres lectines avec différentes spécificités telles que le galactose liaison PNA de Arachis hypogaea
, fucose liaison AOL à partir de Aspergillus oryzae
, MAM liant l'acide sialique de Maackia amurensis
, D-GlcNAc liaison UDA de Urtica dioica
n'a pas affecté l'emplacement de l'intégrine α2. Fait intéressant, les lectines même haute liaison mannose tels qu'un mannose monocotylédones (Man) liant le lectine, GNA de Galanthus nivalis
n'a pas montré de changement significatif sur intégrine α2. En revanche, la liaison haute mannose légumineuse lectine concanavaline a (ConA) déformé la disposition des intégrine α2 comme PFL fait.

Discussion

Dans cette étude, nous avons évalué l'activité biologique de la lectine bactérienne roman PFL de P. fluorescens
Pf0-1 qui appartient à la récente anti-VIH famille des lectines trouvés dans les organismes inférieurs. Présence de l'augmentation des souches de virus de la grippe résistants aux médicaments ainsi que les nouveaux souches de virus hautement pathogènes tels que le virus H5N1 aviaire nous a conduit à explorer PFL comme un agent anti-grippe roman. PFL a montré une activité anti-virus de la grippe puissant et le mécanisme par lequel PFL inhibe la réplication du virus a été l'inhibition de l'étape initiale de l'entrée du virus dans les cellules. Il est très probable que PFL exerce une activité anti-grippe en se liant sélectivement à des glycanes riches en mannose sur l'enveloppe virale HA, comme démontré dans un dosage ELISA [9]. En fait, le site occurrence spécifique de haute oligosaccharide mannose a montré à la région de HA à proximité du site de liaison du récepteur [10].

Pour explorer l'effet anti-tumoral de PFL, nous avons utilisé la lignée cellulaire de cancer gastrique humain MKN28 qui est issue d'un type tumeur intestinale modérément différencié. Le rouge des algues lectine ESA-2, qui appartient à la même famille des lectines avec PFL présentait un effet anti-tumeur à la fois in vitro
et in vivo
[7], [8]. ESA-2 est une protéine dérivée de l'algue comestible et prévu pour exercer un effet anti-tumoral sur le cancer du tractus gastro-intestinal par administration orale. Il est notable que PFL promu la mort cellulaire des cellules MKN28, exclusivement par le biais d'une reconnaissance des glycanes riches en mannose sur molécule α2 intégrine, qui est situé principalement sur la surface de la cellule à l'état stable. intégrines hétérodimères agissent non seulement comme molécule d'ancrage pour attacher des cellules à une matrice extracellulaire appropriée (ECM), mais aussi en tant que capteurs de l'environnement de l'ECM [11].

• PLOS ONE: Honokiol Induit calpaïne-Mediated Glucose-Regulated Protein-94 Clivage et Apoptose dans les cellules humaines du cancer gastrique et réduit la croissance tumorale
• Types de cancer de l'estomac