PLoS ONE: высокоманнозный-Binding Антивирусная лектина ПФЛ из Pseudomonas Шогезсепз Pf0-1 Содействует гибель клеток рака желудка клетки MKN28 через взаимодействие с ALPHA 2-Integrin

Абстрактный
<р> Novel анти-ВИЧ семейства лектин, который показывает строгий способностью к специфическому связыванию с высоким содержанием маннозы гликанам было обнаружено в низших организмах. Бактериальный ортолог был идентифицирован в геноме <ЕМ> синегнойной Шогезсепз
Pf0-1 и ген, кодирующий предполагаемый лектин был клонирован, выраженный в кишечной палочки
и очищали с помощью одной фильтрации шаг гель. Glycan скрининг массив рекомбинантного лектин, названный ПФЛ, показало, что ПФЛ преимущественно признает высоким содержанием маннозы гликаны с α1-3 Человек, который был высоко экспонировались на позиции D2. В противоположность этому, маскировка этого α1-3 Человек с α1-2 Человек резко обесцененных лектин-углеводных взаимодействий. Сокращение терминала дисахарид, GlcNAc-GlcNAc высоких маннозы гликанах также имеет важное значение для ПФЛ связывания. ПФЛ показал сильную активность вируса против гриппа путем ингибирования проникновения вирусов в клетки при дозах низкой концентрации наномолярной. При микромолярном концентрации или выше, PFL показал цитотоксичности сопровождающее потерю адгезии клеток против рака желудка MKN28 клеток человека. Молекула клеточной поверхности, к которой PFL Связанную совместно осаждают с помощью меченных биотином PFL и идентифицирован как интегрин α2 с помощью масс-дактилоскопии пептида с использованием MALDI-TOF масс-спектрометрии. Интересно, что при обработке экзогенным PFL, интегрин α2 на поверхности клетки подвергались быстрой интернализации в цитоплазму и накапливается в перинуклеарном области вместе со связанным PFL. Полученный в результате потери присоединения клеток вызовет сигнального пути, что индуцированное anoikis, как гибель клеток. Эти события были эффективно тормозится за счет предварительной обработки ПФЛ с mannnan, что указывает на вовлечение с высоким содержанием маннозы гликанах на ПФЛ-индуцированной гибели клеток, что было вызвано ПФЛ-интегрина альфа2 взаимодействий
<р> Образец цитирования:. Сато Y, Моримото K, Кубо T, Yanagihara K, Seyama T (2012) высокоманнозный-Binding Антивирусная лектина ПФЛ от Pseudomonas Шогезсепз
Pf0-1 содействует гибель клеток рака желудка клетки MKN28 через взаимодействие с ALPHA 2-интегрина. PLoS ONE 7 (9): e45922. DOI: 10.1371 /journal.pone.0045922
<р> Редактор: Роджер Хаммас, Universidade-де-Сан-Паулу, Бразилия
<р> Поступило: 7 мая 2012; Принято: 27 августа 2012 года; Опубликовано: 20 сентября, 2012
<р> Copyright: © Сато и др. Это статья с открытым доступом распространяется в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution, которая позволяет неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе, при условии, что оригинальный автор и источник кредитуются

Финансирование:. Это исследование была частично поддержана грантом-в-помощь для молодых ученых (B) из Японского общества содействия развитию науки (JSPS) (грант номер 24790101). Доноры не играет никакой роли в дизайн исследования, сбора и анализа данных, решение о публикации или подготовки рукописи
<р> Конкурирующие интересы:.. Авторы заявили, что не существует никаких конкурирующих интересов

Введение
<р> высокоманнозный-связывающий лектин, которые нацелены на конкретные гликанов на поверхности вируса являются перспективными потенциальными вирусные инактивирующих агентов, которые могут быть использованы для профилактики и контроля вирусных инфекций [1], [2]. Многочисленные лектины, которые специфически распознают высоким содержанием маннозы гликаны найдены из различных систематике включая бактерии, водоросли, растений и животных, а некоторые из которых, как было показано проявлять анти-ВИЧ активностью [3]. Недавно мы обнаружили новую лектина семейство анти-ВИЧ распространяется в низших организмах, включая бактерии, цианобактерии и морских водорослей [4]. Они демонстрируют общие характеристики, такие как последовательность умножения высококонсервативной N-концевого домена и эксклюзивные с высоким содержанием маннозы олигосахаридов признаний. Некоторые лектины в этой семье, такие как цианобактерии OAA от Oscillatoria agardhii
[4] и красный водорослевые ESA-2 от Eucheuma Серра
[5] показано, ингибирует проникновение ВИЧ в клетки-хозяева с EC <подразделам> 50s низкого диапазона наномолярной путем непосредственного связывания с gp120 конверт. Кроме того, красный водорослевые лектин КАА-2 от Kappaphycus alvarezii
, которая также принадлежит к этому семейству подавляет инфекцию различных штаммов вируса гриппа с EC <суб> 50s низких уровней наномолярными в штамме-независимым способом, через признание высокоманнозного олигосахаридов на вирусный гликопротеин оболочки гемагглютинина (HA) [6].
<р> Кроме сильнодействующего противовирусной активностью, ЕСС-2 показаны различные виды биологической активности, такие как митогенной активности для мышиных и человеческих лимфоцитов и в пробирке
ингибирование роста опухолевых клеток [7], [8]. Хотя биологические свойства этого лектина семьи становятся очевидными, свойства бактериальных ортологов от Pseudomonas Шогезсепз
Pf0-1 и Herpetosiphon aurantiacus
еще предстоит уточнить.
<Р> В в настоящем исследовании мы клонировали ген ортолог лектин из P. Шогезсепз
Pf0-1 и выражалась белка, кодируемого лектин (ПФЛ) в кишечной палочки
. Функциональная ПФЛ был успешно очищен с высоким выходом и характеризуется с точки зрения его биологической активности, таких как активность противовирусной и противоопухолевой. Как и предсказывалось от интенсивного структурного сходства ПФЛ с другими членами этого семейства лектин, ПФЛ выставлены исключительную специфичность в отношении высокоманнозного олигосахарида и мощным противовирусной активностью против вирусов гриппа. Кроме того, ПФЛ индуцированной anoikis, как гибель клеток раковых клеток желудка MKN28 через взаимодействие с клеточной поверхности интегринов α 2.

Материалы и методы исследования

Материалы
<р> Stab культура П. Fluorescens
Pf0-1 была любезно предоставлена ​​Dr. Mark W. Silby (Университет штата Массачусетс Дартмут, США). Вирусы гриппа и почки собаки (MDCK) клетки Madin-Darby были любезно предоставлены доктором T. Сакагучи (Hiroshima University, Япония): Вирусы гриппа были выращены в хориоаллантоидной жидкости 10-дневных куриных яиц. MDCK клетки культивировали в модифицированной по способу Дульбекко среде Игла (DMEM), дополненной 10% фетальной бычьей сыворотки и пенициллин-стрептомицина. Линию клеток рака желудка, MKN28 был любезно предоставлен профессором Сузуки (Фукусима медицинского университета, Фукусима, Япония). Клеточная линия поддерживалась в среде RPMI-1640 (Gibco, Гранд-Айленд, Нью-Йорк), с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS, GIBCO), 100 МЕ /мл пенициллина G натрия и 100 мг /мл стрептомицина сульфата. Еще одна линия клеток рака желудка, GCIY, был приобретен у RIKEN CELL BANK (Ибараки, Япония) и поддерживается таким же образом, как описано выше. Первичный нормальный человек гепатоцитов клетки (ACBRI 3716) был приобретен у DS Pharma Biomedical (Осака, Япония) и поддерживается в CS-C среде набора R (DS Pharma биомедицинской).

гемагглютинации гемагглютинации Пробирной
<р> анализ проводили с использованием 2% (об /об) суспензии трипсина обработанных эритроцитах кролика, как было описано ранее [9]. Если коротко, то кролик родной эритроцит суспензию обрабатывали 0,5% трипсина в физиологическом растворе, и смесь инкубировали при 37 ° С в течение 60 мин. После промывания солевым раствором, 2% трипсин обработанной суспензии эритроцитов готовили в физиологическом растворе. Была выражена гемагглютинации активность как титр, обратной высшей 2-кратным разведением, проявляющего положительный результат гемагглютинации.

Джин Клонирование и экспрессия лектина ПФЛ
<р> геномную ДНК из P. Fluorescens
Pf0-1 использовали в качестве матрицы для гена клонирования гена PFL. Во-первых, набор праймеров олигонуклеотида, '5'-AGTCGAACGCCTGAACCTGTTGA-3 и', которая гибридизуется с выше по течению и ниже по течению от кодирующей области PFL, соответственно, были использованы 5'-GGCAGGTCTCCCGAAACTTCAAG-3, а ПЦР проводили с использованием ДНК Prime СТАР полимеразы (TAKARA). Используя амплифицированный ПЦР-фрагмента в качестве матрицы, последующий ПЦР проводили с прямой праймер, 5'-CACCATGTCTAAATACGCAGTGGCA-3 ', которая имела CACC дополнительную последовательность к ATG старт-кодоном гена PFL, и обратный праймер, 5'-TTACTCTATCTGCCCACGGAAG -3 '(ТТА, что соответствует стоп-кодона гена РФЛ). Усиленные фрагменты были лигированы в вектор экспрессии, pET101 /D-TOPO. Рекомбинантная плазмида была преобразована в кишечной палочки
клетки ТОР10 (Invitrogen). Полученные рекомбинантные клоны были подтверждены, чтобы быть правильной конструкцией путем секвенирования ДНК. Функциональные клоны были преобразованы в <ЕМ> кишечной палочки
BL21 Star (DE3) для индуцируемой экспрессии гена PFL. IPTG при конечной концентрации 0,8 мМ добавляют в трансформированном культуру, чтобы индуцировать экспрессию PFL. После 6 часов инкубации при 37 ° С, клетки собирали центрифугированием при 8000 оборотах в минуту в течение 20 мин.

Очистка лектина PFL
<р> Собранный бактериальные клетки повторно суспендируют в 20 мМ фосфатном буфере ( рН 7,0), содержащем 0,15 М NaCl (PBS), и разрушали путем обработки ультразвуком. После центрифугирования при 8000 оборотов в минуту в течение 20 минут, аликвоту супернатанта подвергали суперозой 12 колонка (GE Healthcare), уравновешенную PBS. Колонку элюировали PBS, при скорости потока 0,8 мл /мин ПРОВОДИМОГО изократическом режиме. Элюат контролировали по поглощению при 280 нм и исследовали на гемагглютинации активности, и активные фракции объединяли.

Молекулярный вес Определение PFL
<р> Молекулярная масса PFL определяли с помощью MALDI-TOF МС-анализ с масс-спектрометра Autoflex (Bruker, Япония) после калибровки с пептидной масса стандартного набора (Bruker, Япония) с использованием синапиновая кислота в качестве матрицы.

последовательность ДНК анализ
<р> нуклеотидные последовательности были определены методом терминации дидезокси цепи с использованием BigDye Терминатор версии 3.1 циклического секвенирования набора (Applied Biosystems). Секвенирование ДНК проводили с использованием ABI 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

Glycan массив анализ
<р> PFL метили Alexa Fluor 488 в соответствии с инструкциями изготовителя (Invitrogen, Eugene, OR). Glycan специфичность связывания ПФЛ определяли с помощью печатных гликанов микрочипов (версия 5.0) в соответствии со стандартной процедурой CoreH Консорциума по функциональной Glycomics (CFG) (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp~~HEAD=pobj ). Средняя относительная флуоресценция в повторах шести рассчитывали путем усреднения четырех значений после удаления максимальных и минимальных значений для устранения некоторых ложных ударов с очень высокими или низкими точками. Столбики ошибок обозначают стандартную ошибку среднего (SEM), и% CV является коэффициент вариации (SD /среднее) рассчитывается как%.

Защита от гриппа Активность ПФЛ

В пробирке
анти-гриппа активность ПФЛ была определена нейтрального красного (NR) анализа поглощения красителя. Различные концентрации PFL готовили с использованием DMEM, содержащей 10 мкг /мл трипсина в 96-луночный микропланшет. В каждую лунку, вирус был добавлен в качестве множественности инфекции приблизительно 0,001 инфекционных частиц на клетку. После инкубации при температуре 37 ° С в течение 48 ч, добавляли 100 мкл красителя NR (150 мкг /мл в DMEM), и дополнительно инкубировали в течение 2 ч. NR краситель включены в клетки экстрагируют добавлением 100 мкл 1% кислоты /50% этанола уксусной. Лунки измеряли при 540 нм с помощью планшет-ридере (1420 MultiLabel счетчик, PerkinElmer, Массачусетс, США) как фактор выживания от влияния вируса цитопатического.

иммунофлюоресценции микроскопией
<р> Иммунофлуоресценции окрашивание выполняется для визуализации начального ингибирования вируса гриппа путем ПФЛ. В кратком изложении, MDCK клетки, выращенные на покровном стекле были заражены /Udorn /72 при множественности инфекции около 0,001 инфекционных частиц на клетку, в присутствии или в отсутствие 200 нМ PFL в среде DMEM, содержащей 10 мкг /мл трипсина. Через 24 ч после инфицирования инфицированные клетки фиксировали 80% ацетоном в течение 5 мин. После промывания PBS клетки инкубировали с моноклональными анти-мышиного HA-антителом (HyTest, Turku, Finland) при 37 ° С в течение 1 ч. После промывания PBS клетки инкубировали с флуоресцеинизотиоцианатом (FITC) -conjugated козий против мышиного IgG антитела (Anticorps Secondaires, Compiègne, Франция) при 37 ° С в течение 1 ч. После дальнейшего PBS промывания клетки были установлены с использованием Vectashield с 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) (Vector Laboratories, Burlingame, CA), и наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Olympus BX51, Olympus, Япония).

ELISA анализ
<р> Прямое взаимодействие ПФЛ с вирусной гликопротеина оболочки HA анализировали с использованием immnosorbent анализа связанный с ферментом (ELISA). PFL (5 мкг /мл) в карбонатном буфере (рН 9,6), наносили на 96-луночные ELISA планшетах (BD Biosciences, Bedford, MA). Лунки промывали три раза ЗФР, содержащим 0,1% Tween20 (PBST) и блокировали 3% обезжиренного молока при температуре 37 ° С в течение 1 ч. После промывки PBST, различные концентрации препарата вакцины гриппа НА (Astellas, Токио, Япония), были добавлены в каждую лунку и инкубировали при 37 ° С в течение 1 ч. После промывки PBST лунки инкубировали с мышиной анти-HA моноклональных антител (HyTest) при 37 ° С в течение 1 ч с последующей инкубацией с пероксидазы хрена (HRP) антимышиного IgG антитела (GE Healthcare, Великобритания ) при 37 ° С в течение 1 ч. Впоследствии 3,3 ', добавляли 5,5'-тетраметилбензидин (ТМВ) субстрат (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Мичиган). Реакцию останавливали с помощью ТМВ стоп-реагента (Sigma-Aldrich) и оптическую плотность при 450 нм измеряли с использованием микропланшет-ридера (1420 MultiLabel счетчик, PerkinElmer).

Опухоль пролиферации клеток МТС анализа
<р> пролиферация клеток определяли количественно с помощью обычного анализа MTS с использованием Celltiter 96 клеток анализа пролиферации (Promega, Madison, WI). Клетки высевали на 96-луночный микропланшет инкубируют в течение 72 часов с различными концентрациями PFL в соответствующей среде с добавлением 10% FBS. Клетки затем инкубировали с 20 мкл реагента MTS в течение 1 ч при 37 ° С и измеряли с помощью микропланшет-ридера (1420 MultiLabel счетчик, PerkinElmer) при длине волны 490 нм. Влияние дрожжевой маннан на цитотоксичность PFL определяли путем инкубации клеток с 5 мкМ PFL в присутствии различных концентраций дрожжей маннан в среде RPMI 1640 с добавлением 10% FBS в течение 72 ч, и жизнеспособность клеток измеряли, как описано выше.

Выделение ПФЛ связывания молекулы (s) на MKN28 клеток
<р> PFL метили биотином с использованием биотин маркировки набора (DOJINDO молекулярные технологии, Япония) в соответствии с инструкциями производителя. Для конфлюэнтны MKN28 клеток на покровных стеклах, биотинилированный-PFL (200 мкг) и инкубировали в течение 2 ч при комнатной температуре. После промывки холодным PBS клетки соскабливают и лизируют в 800 мкл RIPA буфере (50 мМ Трис-HCl, рН 7,6, 150 мМ NaCl, 1% Nonidet Р40, 0,5% дезоксихолат натрия, ингибиторов протеаз, 0,1% ДСН ). Затем добавляли 100 мкл биотин-авидин захвата бусин (Адар Biotech, Израиль) был добавлен к клеточного лизата и инкубируют в течение ночи при температуре 4 ° С при осторожном перемешивании. Гранулы промывали три раза 50 мМ Трис-HCl, рН 7,5. Захваченные белки на шариках элюировали с 50 мкл SDS-PAGE образца буфера (62,5 мМ Трис, рН 6,8, 2% SDS, 10% глицерина, 1% меркаптоэтанола, 0,003% бромфенол синий) в течение 15 мин при температуре 90 ° C и подвергали SDS-PAGE. Белок полосы, характерные для фракции лечения ПФЛ анализировали с помощью MALDI-TOF MS после того, как в геле переваривании трипсином. Вкратце, СВВ окрашивали полосы белка вырезали и обесцвечивают с помощью 25 мМ бикарбоната аммония, содержащего 50% ацетонитрила. Восстановительное алкилирование проводили с 50 мМ TCEP (трис [2-карбоксиэтил] фосфин) в 25 мМ бикарбоната аммония с последующей инкубацией с 50 мМ iodoacetoamide в течение 1 ч. После дегидратации с помощью ацетонитрила, белок в геле, расщепляли с 10 мкл ТРСК-трипсином (100 мкг /мл) в 50 мМ бикарбоната аммония. Переваривание очищали с Zip наконечником (Millipore, Япония) и наносили на MALDI мишени. Один мкл матричного раствора (α-циано-4-hydroxycinnapic матрицы кислоты [Bruker, Япония] в смеси ацетон-этанол [1:02]) затем добавляют к этому месту. анализ MALDI-TOF MS осуществляли с помощью масс-спектрометра Autoflex (Bruker, Япония) после калибровки с использованием пептидного масс-стандартным комплектом (Bruker, Япония). Масса данных отпечатки пальцев пептид искали программным обеспечением Mascot (Matrix Science, Япония).

Клеточная локализация ПФЛ и интегрина α2
<р> MKN28 клетки культивировали на покровных в 6-луночного планшета , Клетки, растущие на покровных стеклах, обрабатывали 30 мкг /мл Alexa488 конъюгирован-PFL в среде RPMI 1640 и инкубируют в течение различных периодов времени. После промывания PBS, клетки фиксировали 80% ацетоном в течение 5 мин. После промывания PBS клетки инкубировали с мышиными моноклональными анти-интегрин ALPHA 2 /CD49b антитела (R &Amp; D Systems, MN) при 37 ° С в течение 1 ч. После промывания PBS клетки инкубировали с Alexa568-конъюгированного козьего антитела против мышиного IgG антитела (технологии жизни, Япония) при 37 ° С в течение 1 ч. После дальнейшего PBS промывания клетки были установлены с помощью Vectashield с DAPI (Vector Laboratories) и наблюдались при конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (IX70, Olympus, Япония). Используя другую клетку рака желудка линии GCIY и нормальные человеческие гепатоцитов клетки ACBRI 3716, клеточные локализаций интегрина α 2 и Alexa488-PFL исследуют таким же образом, как описано выше, и наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Olympus BX51). Влияние дрожжевой маннан на клеточной локализации PFL и интегрина α 2 оценивали следующим образом. Сливной MKN28 клетки, выращенные на покровных стеклах в 6-луночный планшет обрабатывали 20 мкг /мл Alexa488-PFL в среде RPMI 1640, в присутствии или в отсутствие 700 мкг /мл дрожжевого маннан в течение 4 ч. Клетки фиксировали, визуализировали с использованием анти-интегрин ALPHA 2. /CD49b антитела, как описано выше, и наблюдали под флуоресцентным микроскопом (Olympus BX51). Влияние различных лектинов на клеточной локализации интегрина α 2 исследовали таким же образом, путем инкубации клеток MKN28 с 20 мкг /мл каждого лектина в среде RPMI 1640, в течение 4 ч.

Результаты

Молекулярное клонирование, экспрессия и очистка ПФЛ
<р> ранее мы обнаружили геном P. Шогезсепз
Pf0-1 содержит возможную гомолог анти-ВИЧ семьи лектин, который недавно был найден у низших организмов, включая бактерии, цианобактерии и морских водорослей [4]. На основе нуклеотидной последовательности гипотетической лектина P. Шогезсепз
Pf0-1 на базе данных, набор праймеров были разработаны для амплификации гена лектина. ген лектина Предполагаемые успешно клонировали системы клонирования ТОРО направленной, и гетерологично выражается белок кодирования в E. палочка
BL21 (DE3). Выраженный лектин белок был очищен до гомогенного состояния с помощью одной фильтрации шаг гель на суперозой 12 колонке (фиг. 1А). Активный пик с гемагглютинации активностью давала одну полосу белка в 13 кД на SDS-PAGE (фиг. 1б). Наконец, из 1 помета E. была получена Coli
культура, высокий выход очищенного лектина (240 мг). Очищенный лектин был назван ПФЛ и использоваться для дальнейшего изучения. Молекулярная масса ПФЛ (13883,7) определяется MALDI-TOF MS был в согласии с вычисленной массе (13881.1) из аминокислотной последовательности и что оценочная стоимость по подвижности на SDS-PAGE.
<Р> Выведенная аминокислотная последовательность PFL таил двух гомологичных доменов, каждый из которых состоит из N- и с-концевых половин с 62% идентичности последовательности между ними. ПФЛ проявляли высокую степень гомологии последовательности с цианобактерий лектин OAA от Oscillatoria agardhii
, красный водорослевые лектин ESA-2 от Eucheuma Серра
, и бактериальный лектин МБГА от Myxococcus Ксанф
(рис . 2B), которые представляют собой новое семейство лектин анти-ВИЧ. Молекулярная масса PFL и OAA были похожи, 13883,7 и 13924,1, соответственно, и оба лектины состоят из 132 аминокислот. Оба ПФЛ и ОПД имеют общее свойство в его повторению последовательности, но OAA показывает более высокую степень внутренней идентичности последовательности с 75% между двумя повторяющимися доменами. В отличие от этого, ESA-2 и МБГА состоят из четырех тандемно повторяющихся гомологичных доменов 67 аминокислот. Степень сходства OAA, ESA-2 и MBHA с PFL в их N-концевых участков (каждый 132 остатки) из аминокислотных последовательностей были 62,1, 61,4, и 62,1% для идентичных аминокислот, соответственно.
<Н3> Углеводы-специфичность связывания ПФЛ

для определения углеводами специфичности связывания ПФЛ, гликан анализ массива был выполнен в консорциуме для функциональных Glycomics с использованием распечатаны массива версии 5.0. Из 611 видов олигосахаридов тестируемых, PFL (10 мкг /мл), показал исключительную специфичность к высоким содержанием маннозы гликанам типа, как показано на рис. 3. Весь список олигосахарида испытания и результаты можно найти в Интернете по адресу (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp).
<Р> ПФЛ сильно связаны с M6 гликана (216 ) и M8 гликан (212), оба из которых имеют открытую α1-3 человека на руке D2, с аналогичными уровнями высоких значений РФС, 43471 и 40759, соответственно. В противоположность этому, маскировка этого α1-3 Человек с α1-2 Человек резко нарушается взаимодействие между ПФЛ и гликанов. Это было наиболее очевидным при сравнении M6 гликана (216) и М7 гликана (211), где дополнительный α1-2 Человек на D2 руку уменьшилась связывания потенцию примерно до 53%. Аналогичным образом, связывание потенции ПФЛ М9 гликана (213) был снижен (РФС = 8535) по сравнению с его коллегой М8 Гликан (212) D2 терминала не хватает α1-2 Человек, показывая только 21% от потенции. Интересно отметить, что удаление восстанавливающего терминального дисахарида, GlcNAc-GlcNAc высоких маннозы гликанах значительно резко уменьшилась ПФЛ связывания. Например, связывание потенцию ПФЛ была почти полностью отменена к гликанов 316 и 317, не имеющих последовательности GlcNAc-GlcNAc в то время как те, аналог гликанам 212 и 213, соответственно, обладают гораздо более высокой активностью. Важность терминала GlcNAc-GlcNAc было дополнительно подтверждено сравнением гликанах 217 и 315, хотя степень обесценения ПФЛ связывания была ограничена. Этот лектин был лишен моносахарида-связывающим включая маннозы. Кроме того, ПФЛ не взаимодействуют с человеком α1-6 Человек (314) и mannotriose (214), которые являются составными частями разветвленной части с высоким содержанием маннозы гликанов. Пентасахаридной ядро ​​N-гликанов (50) не был признан ПФЛ, но его фукозилированные аналог (485) отображается слабое взаимодействие (РФС = 746). Эти олигосахарид связывающие профили PFL были тесно аналогичны OAA, ESA-2 и Каа-2, которые принадлежат к новому анти-ВИЧ семейства лектинов в низших организмах [4] - [6].

Анти- вирус гриппа активность PFL
<р> Анти-вирус гриппа активность ПФЛ оценивали с двумя штаммов вируса гриппа, A /Udorn /72 (H3N2) и A /Beijing /262/95 (H1N1) путем поглощения красителя NR анализ. ПФЛ эффективно тормозится цитопатический эффект, вызванный вирусом гриппа обоих штаммов с ЕС <югу> 50-х годов 19,4 ± 1,5 нМ и 4,5 ± 0,4 нМ, соответственно (рис. 4а). Для того, чтобы подтвердить, что ПФЛ ингибирует начальную стадию проникновения вирусов гриппа в клетки, наблюдалось распространение вирусных антигенов в инфицированных клетках, в присутствии или в отсутствие PFL с использованием иммунофлуоресцентного микроскопии. Инжир. 4В показывает распределение вирусного антигена через 24 ч после инфицирования с A /Udorn /72, обнаруженной специфической анти-гемагглютинина антителом. PFL эффективно ингибирует проникновение вирусов гриппа в клетках, тогда как вирусы были способны проникать и размножаться в клетках-хозяевах при отсутствии PFL. Галактоза специфический лектин из ПНК Арахисовое hypogaea
не удалось ингибировать проникновение вирусов в клетки. Эти результаты свидетельствуют о наличии с высоким содержанием маннозы гликанов на поверхности вируса в положении критической для входа вируса в клетки. Для того, чтобы проверить, будет ли PFL непосредственно связываться с вирусной гликопротеина оболочки HA, анализ методом ELISA проводили с коммерчески доступным препаратом вакцины, которые содержат HA от А /Калифорния /7/09 (H1N1), A /Victoria /210/09 (H3N2), и Б /Brisbane /60/08 в качестве одного из основных компонентов. Как показано на рис. 4C, наблюдалось дозозависимое связывание ГА с ПФЛ.

PFL индуцированной гибели клеток желудка человека клетки рака MKN28

В пробирке
противоопухолевого эффекта ПФЛ на клетку рака желудка MKN28 оценивали с помощью традиционных аналитических MTS. Как показано на рис. 5A (левая панель), PFL, показал дозозависимый эффект на пролиферацию MKN28 клетки. На 72 ч после PFL обработки жизнеспособность клеток значительно снижалась при дозах 0,5 мкМ или выше. В отличие от этого, в низких дозах 0,1-0,3 мкМ, пролиферации клеток было слегка стимулировала. PFL-индуцированной клеточной гибели клеток MKN28 сопровождался потерей клеточной адгезии к нижней части культурального планшета, как показано на рис. 5В, где наблюдались вывернутые скопление клеток в виде коричневатых линий. ПФЛ-индуцированная гибель клеток эффективно ингибируется в присутствии дрожжей маннан, гликопротеин подшипником высоким содержанием маннозы олигосахариды (рис. 5, а, правая панель). Это указывает на высокие маннозы гликаны на клетки MKN28 которые включают в ПФЛ-индуцированной клеточной сигнализации, что в конечном итоге приводит к гибели клеток. В противоположность этому, нормальные клетки человека гепатоцитов (ACBRI 3716) были относительно устойчивы к обработке ПФЛ по сравнению с MKN28 клетками (рис. 5А, левая панель).

Выделение PFL-связывающей молекулы (ов) на человека клетку рака желудка MKN28
<р> для решения молекулярный механизм, с помощью которого PFL индуцирует гибель клеток MKN28 клетки, молекулой клеточной поверхности (ей), к которому PFL связаны были исследованы. Биотинилированные PFL инкубировали в течение 2 ч с MKN28 клетки и клетки лизируют с RIPA буфером, содержащим 0,1% ДСН. Молекула (ы) с клеточной поверхностью, к которой биотин-PFL Bound были совместно осаждают покрытые авидином бусин. Белки запертые на шариках были затем элюировали буфером SDS-PAGE образца и анализировали с помощью SDS-PAGE (рис. 6, а). Хотя некоторые неспецифические полосы были обнаружены, мы наблюдали 150 кДа, который специфически обнаружен в ПФЛ обработке фракции. Эта группа дополнительно подвергали в геле переваривании трипсином с последующей MALDI-TOF масс-спектрометрического анализа. Полученные пептидные данные массовые снятия отпечатков пальцев (. 6В) Поиск по базе данных, и белок был идентифицирован как интегрин α2, с вероятностью оценки на основе из 57 (р &л; 0,05).

Клеточная локализация экзогенно добавлена ​​ПФЛ и интегрин α2

поведение самого ПФЛ и интегрина α 2 при обработке ПФЛ были исследованы с помощью конфокальной флуоресцентного микроскопа. В этом эксперименте, флуоресцентный меченных PFL (Alexa488-ПФЛ) был использован для отслеживания локализации PFL. Alexa488-PFL инкубировали с клетками в течение MKN28 1, 5 и 24 ч при дозе 30 мкг /мл. Интегрина α2 были обнаружены с анти-интегрин ALPHA 2 /CD49b моноклональных антител с последующим Alexa568-конъюгированного 2 антителом. Интересно отметить, что Alexa488-PFL связывается с поверхностью клетки и инициировали интернализации в цитоплазму в течение 1 ч (рис. 7). Интегрин α2, который был преимущественно локализован на поверхности клеток в стационарном состоянии также подверглись интернализации, и, что важно, локализация интегрина α 2 совпадали хорошо с ПФЛ. Через 5 часов инкубации, как PFL и интегрина α2 были совместно локализованы и аккумулируются в перинуклеарном области и дальнейшей инкубации в основном не изменяют расположение обоих белков. Поэтому вероятно, что когда-то PFL связан с интегрином а2, оба белка никогда не возвращают обратно на поверхность клетки. Быстрое внутриклеточное оборот ПФЛ-интегрина ALPHA 2 комплекса произошло даже на коллаген I покрывающей слипы (данные не показаны). Аналогичным образом, наблюдалось перераспределение интегрина а2 при обработке PFL в другой желудочной линии раковых клеток, GCIY, но не в нормальных клетках гепатоцитов человека, ACBRI 3716 (рис. 8). В ACBRI 3716 клетки, интернализация ПФЛ не наблюдалось, возможно, по меньшей экспрессии интегрина а2 на поверхности клеток.

Участие с высоким содержанием маннозы гликанах на ПФЛ-интегрина взаимодействия
ALPHA 2 <р> Чтобы проверить, является ли сотовая перераспределение интегрина а2 вызванное ПФЛ могут возникнуть в результате специфического взаимодействия ПФЛ с высоким содержанием маннозы гликанах на молекулу интегрина а2, мы оценивали влияние дрожжевой маннан на ПФЛ-индуцированной интегрин ALPHA 2 интернализации с использованием MKN28 клеток. При отсутствии дрожжей маннан, оба белка подверглись существенным интернализации (фиг. 9A, верхние панели). В отличие от этого, в присутствии дрожжей маннан, PFL не удалось связать с клеточной поверхности, и последующее внутриклеточное оборот PFL была полностью отменена (рис. 9а, внизу справа). Соглашаясь этого наблюдения, интегрина а2 не изменило его локализацию в присутствии дрожжей маннан (рис. 9А, внизу слева). Эти результаты ясно показывают, что ПФЛ связаны с интегрином а2 через признание с высоким содержанием маннозы гликанах на интегрина а2. Для дальнейшего подтверждения требования с высоким содержанием маннозы гликанах для интегрина перераспределения а2, мы протестировали влияние различных лектинов на клеточной локализации интегрина α 2. Как показано на рис. 9В, другие лектины с различной специфичностью, такими как галактоза-связывающий ПНА от Арахисовое hypogaea
, фукозу связывание AOL от Aspergillus огугае
, МАМ сиаловой кислоты связывания с Maackia амурский <бр> D-GlcNAc-связывающий UDA от крапива двудомная
не влияет на расположение интегрина а2. Интересно, что даже с высоким содержанием маннозы связывания лектины, такие как однодольных маннозы (Man) -связывающим лектин, ГНА от подснежник белоснежный
не показали каких-либо существенных изменений на интегрина а2. В противоположность этому, высокоманнозный связывание легумин ConcanavalinA (КонА) искажается расположение интегрина а2 как ПФЛ сделал.

Обсуждение
<р> В этом исследовании мы оценивали биологическую активность нового бактериального лектина ПФЛ от P. Шогезсепз
Pf0-1, которая принадлежит недавно найденной анти-ВИЧ семейства лектинов у низших организмов. Появление увеличения штаммов вируса гриппа с лекарственной устойчивостью, а также возникающие высоко патогенный штаммы вируса, такие как птичий H5N1 привел нас к исследовать ПФЛ в качестве нового противоракового средства против гриппа. PFL показал сильную активность вируса против гриппа и механизм, с помощью которого PFL угнетается репликацию вируса ингибирование начальной стадии вхождения вируса в клетки. Скорее всего, что ПФЛ оказываемое противоопухолевую активность гриппа путем селективного связывания с высоким содержанием маннозы гликанах на оболочке вируса HA, как показано в ELISA [9] анализа. На самом деле, сайт конкретного случая высокой маннозы олигосахаридов показал в области ГА вблизи участка связывания с рецептором [10].
<Р> Чтобы исследовать эффект противоопухолевый ПФЛ, мы использовали клетку рака желудка линии человеческого MKN28, который происходит от умеренно дифференцированной опухоли кишечника типа. Красный водорослевые лектин ESA-2, который принадлежит к тому же семейству лектинов с ПФЛ выставлялись противоопухолевый эффект и в пробирке
и В естественных условиях
[7], [8]. ЕСС-2 представляет собой белок, полученный из съедобных морских водорослей и, как ожидается, оказывают противоопухолевое действие на рак желудочно-кишечного тракта при пероральном введении. Следует отметить, что ПФЛ способствует гибели клеток MKN28 клетки, исключительно через признание с высоким содержанием маннозы гликанов на интегрин молекулы ALPHA 2, которая преимущественно локализованы на клеточной поверхности в стационарном состоянии. Гетеродимерный интегрины действуют не только крепежным молекулы для прикрепления клеток к соответствующему внеклеточного матрикса (ЕСМ), а также в качестве датчиков ЕСМ среды [11].

• PLoS ONE: Honokiol Индуцирует кальпаином-опосредованной глюкозо-Регулируется Белково-94 Расщепление и Апоптоз в клет…
• Типы желудка cancer