PLoS ONE: Korkea Mannoosia Binding Antiviral Lectin PFL Pseudomonas fluorescens Pf0-1 Edistää solukuolema mahasyövän Cell MKN28 kautta Vuorovaikutus α2-Integrin

tiivistelmä

Novel HIV-lektiinin perhe, joka esittää tiukkaa sitoutumisspesifisyys runsaasti mannoosia glykaanien on löytynyt alhaisempi organismeihin. Bakteeri-ortologin on tunnistettu genomin Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 ja geeni koodaa oletetun lektiini kloonattiin, ilmaistu Escherichia coli
ja puhdistettiin yhdessä vaiheessa geelisuodatuksella. Glykaanin joukko seulonta Rekombinantti lektiinin, kutsutaan PFL, on paljastanut, että PFL tunnistaa edullisesti runsaasti mannoosia glykaaneja kanssa α1-3 Man, joka oli voimakkaasti altistuneiden D2 asemassa. Sen sijaan peittää tämän α1-3 Mies α1-2 Man dramaattisesti heikentynyt lektiini-hiilihydraatti vuorovaikutusta. Vähentäminen terminaali disakkaridi, GlcNAc-GlcNAc korkean mannoosia glykaanien oli myös välttämätöntä PFL-sitova. PFL osoitti voimakas anti-influenssaviruksen toimintaa estämällä viruksen pääsyn soluihin annoksilla alhainen nanomolaari- pitoisuuden. Mikromolaarisina pitoisuus tai korkeampi, PFL oli sytotoksisuutta mukana menetys soluadheesion ihmisen mahasyövän MKN28 soluja. Solun pinnan molekyyli, joka PFL sitoutui, kerasaostuvat biotiinileimatulla PFL ja tunnistettu integriini α2 peptidi massa sormenjälkien käyttäen MALDI-TOF-massaspektrometrialla. Kiehtovan, käsittelemällä eksogeenisen PFL, integriinin α2 solun pinnalla koki nopean sisäistämisen sytoplasmaan ja kertynyt perinuclear alueella yhdessä sitoutuneen PFL. Tuloksena menetys solun sitoutuminen johtaisi signalointireitin, joka indusoi anoikis kaltainen solukuolemaa. Näitä tapahtumia esti esikäsittelemällä PFL kanssa mannnan, osoittaa osallistuminen runsaasti mannoosia glykaanien PFL-solukuolema että laukaisi PFL-integriini α2 vuorovaikutuksia.

Citation: Sato Y, Morimoto K, Kubo T, Yanagihara K, Seyama T (2012) korkea Mannoosia Binding Antiviral Lectin PFL iältään Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 Edistää solukuolema mahasyövän Cell MKN28 kautta Vuorovaikutus α2-integriini. PLoS ONE 7 (9): e45922. doi: 10,1371 /journal.pone.0045922

Editor: Roger Chammas, Universidade de São Paulo, Brasilia

vastaanotettu: 7. 2012 Hyväksytty: 27 elokuu 2012; Julkaistu: 20 syyskuu 2012

Copyright: © Sato et al. Tämä on avoin pääsy artikkeli jaettu ehdoilla Creative Commons Nimeä lisenssi, joka sallii rajoittamattoman käytön, jakelun ja lisääntymiselle millä tahansa välineellä edellyttäen, että alkuperäinen kirjoittaja ja lähde hyvitetään.

Rahoitus: Tämä tutkimus tuettiin osittain Grant-in-Aid nuorten tutkijoiden (B) Japanin Society for Promotion of Science (JSPS) (Grant numero 24790101). Rahoittajat ollut mitään roolia tutkimuksen suunnittelu, tiedonkeruu ja analyysi, päätös julkaista tai valmistamista käsikirjoituksen.

Kilpailevat edut: Kirjoittajat ovat ilmoittaneet, etteivät ole kilpailevia intressejä ole.

Johdanto

korkea mannoosia sitova lektiinejä joka kohdistaa tiettyihin glykaanien viruksen pinnalla ovat lupaavia mahdollisten virusten inaktivoiva aineita, joita voitaisiin käyttää ehkäisyyn ja valvontaan virusinfektioiden [1], [2]. Lukuisat lektiinejä, jotka spesifisesti tunnistavat runsaasti mannoosia glykaaneja löytyy eri taksonomian mukaan lukien bakteerit, levät, kasvit ja eläimet, ja joista osa on osoitettu olevan anti-HIV-aktiivisuus [3]. Olemme hiljattain löytäneet uuden HIV-lektiini perheen jaettu alempaan organismien, kuten bakteerien, syanobakteerien ja merilevä [4]. Niillä yhteisiä ominaisuuksia, kuten sekvenssi moninkertaistuminen hyvin säilyneitä N-terminaalinen domeeni ja yksinomainen runsaasti mannoosia oligosakkaridin tunnustuksia. Jotkut lektiinit tässä perheessä, kuten syanobakteerien OAA alkaen Oscillatoria agardhii
[4] ja punainen levien ESA-2 Eucheuma serra
[5] ovat osoittaneet estävän HIV: n pääsy isäntäsoluihin EC _{50s alhaisen nanomoolialueella suoraan sitoutumalla kirjekuori gp120. Lisäksi punainen levien lektiini KAA-2 Kappaphycus alvarezii
, joka myös kuuluu tähän perheeseen estää tartunnan eri viruskantoja EC 50s alhaisen nanomolaari- tasojen kanta-riippumattomalla tavalla, kautta tunnustamista runsaasti mannoosia oligosakkaridin viruksen vaippaglykoproteiinin hemagglutiniini (HA) [6].}

lisäksi voimakas antiviraalinen aktiivisuus, ESA-2 esitetään erilaisia ​​biologisia toimintoja, kuten mitogeeniaktiivisuuden hiiren ja ihmisen lymfosyyttien ja in vitro
kasvun inhibition kasvainsolujen [7], [8]. Vaikka biologisia ominaisuuksia tämän lektiinin perheen käymässä ilmeiseksi, ominaisuuksia bakteerien ortologeja alkaen Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 ja Herpetosiphon aurantiacus
on vielä selvennettävä.

Tässä tutkimuksessa olemme kloonattu ortologin lektiinin geenin P. fluorescens
Pf0-1 ja koodatun lektiini proteiini (PFL) ilmennettiin Escherichia coli
. Toiminnallinen PFL onnistuneesti puhdistettiin johtamalla ammoniakkia tunnettu suhteen sen biologisia vaikutuksia kuten antiviraalisten ja antituumorivaikutus. Kuten ennustaa voimakas rakenteellinen yhtäläisyys PFL muiden jäsenten kanssa tämän lektiinin perheen, PFL näytteillä spesifisyyden ainoastaan ​​korkea mannoosi oligosakkaridin ja voimakas antiviraalinen vaikutus influenssaviruksia. Lisäksi PFL aiheuttama anoikis kaltainen solukuolemaa mahasyövän solun MKN28 kautta vuorovaikutuksessa solun pinnalla integriinin α2.

Materiaalit ja menetelmät

Materiaalit

Stab kulttuurin P. fluorescens
Pf0-1 oli jalomielinen lahjoitus Dr. Mark W. Silby (University of Massachusetts Dartmouth, USA). Influenssaviruksia ja Madin-Darby koiran munuaissolut (MDCK) soluja jalomielinen lahjoitus tri T. Sakaguchi (Hiroshima University, Japani): Influenssavirukset kasvatettiin korionallantoisnestettä 10 päivän ikäisten kanan munia. MDCK-soluja kasvatettiin Dulbeccon Modified Eagle Medium (DMEM), jota oli täydennetty 10% naudan sikiön seerumia ja penisilliiniä-streptomysiiniä. Vatsa tasyöpäsolulinja, MKN28 luovutti ystävällisesti professori Suzuki (Fukushima Medical University, Fukushima, Japani). Solulinjaa ylläpidettiin RPMI-1640-väliaineessa (GIBCO, Grand Island, NY) täydennettynä 10% naudan sikiön seerumia (FBS, GIBCO), 100 IU /ml G-penisilliini ja 100 mg /ml streptomysiinisulfaattia. Toinen mahasyöpä solulinja, GCIY, hankittiin RIKEN CELL BANK (Ibaraki, Japani) ja ylläpidetään samalla tavalla kuin edellä on kuvattu. Ensisijainen normaalia ihmisen hepatosyyttisolulinjasta (ACBRI 3716) ostettiin DS Pharma Biomedical (Osaka, Japani) ja ylläpidetään CS-C väliaineessa kit R (DS Pharma Biomedical).

Hemagglutiniinin Pitoisuus

Hemagglutiniinin määritys suoritettiin käyttäen 2% (v /v) suspensioon trypsiini-käsitelty kanin punasolujen kuten aiemmin on kuvattu [9]. Lyhyesti, kaniinin natiivi punasolujen suspensiota käsiteltiin 0,5% trypsiiniä suolaliuoksessa, ja seosta inkuboitiin 37 ° C: ssa 60 min. Pesun jälkeen suolaliuoksella, 2% trypsiiniä-käsitelty punasolujen suspensio valmistettiin suolaliuoksessa. Hemagglutinaatioaktiivisuus ilmaistiin tiitteri, vastavuoroinen korkeimman 2-kertainen laimennus, joilla positiivinen hemagglutinaation.

Gene kloonaus ja ekspressio lektiini PFL

Genominen DNA P. fluorescens
Pf0-1 käytettiin templaattina geenin kloonausta PFL-geenin. Aluksi, joka on oligonukleotidialuketta set, 5'-GGCAGGTCTCCCGAAACTTCAAG-3 'ja 5'-AGTCGAACGCCTGAACCTGTTGA-3', joka hybridisoitui ylävirtaan ja alavirtaan PFL koodaavan alueen, vastaavasti, käytettiin, ja PCR suoritettiin käyttäen Prime STAR DNA -polymeraasia (TAKARA). Käyttämällä monistettu PCR-fragmentti templaattina, sen jälkeen PCR suoritettiin eteenpäin aluketta, 5'-CACCATGTCTAAATACGCAGTGGCA-3 ', joka oli CACC lisäksi sekvenssin ATG-aloituskodonin ja PFL-geenin, ja reverse-aluke, 5'-TTACTCTATCTGCCCACGGAAG -3 '(TTA, joka vastaa lopetuskodonin RFL-geeni). Monistetut fragmentit ligoitiin pET101 /D-TOPO-ekspressiovektoriin. Yhdistelmä-DNA-plasmidi transformoitiin Escherichia coli
TOP10-soluihin (Invitrogen). Saatu yhdistelmä-DNA-kloonit varmistettiin olevan oikea konstrukti DNA-sekvensoinnilla. Toiminnallinen klooneja muunnettava Escherichia coli
BL21 Star (DE3) solut indusoituvaa ilmentymistä PFL geenin. IPTG, joiden lopullinen konsentraatio on 0,8 mM lisättiin transformoitu viljelmä indusoimiseksi PFL ilmaisua. 6 tunnin kuluttua inkuboinnin jälkeen 37 ° C: ssa, solut kerättiin sentrifugoimalla 8000 rpm 20 minuutin ajan.

puhdistus lektiinin PFL

korjattu bakteeri- solut suspendoitiin uudelleen 20 mM fosfaattipuskuria ( pH 7,0), joka sisälsi 0,15 M NaCl (PBS), ja hajotettiin sonikoimalla. Kun oli sentrifugoitu 8000 rpm: ssä 20 min, alikvootti supernatantista tehtiin Superose 12 -pylväällä (GE Healthcare), joka oli tasapainotettu PBS: llä. Pylväs eluoitiin PBS: llä virtaus- nopeudella 0,8 ml /min isokraattinen tilassa. Eluaattia seurattiin absorption aallonpituudella 280 nm ja tutkittiin hemagglutinaatioaktiivisuus, ja aktiiviset fraktiot yhdistettiin.

Molekyylipaino määritys PFL

molekyylipaino PFL määritettiin MALDI-TOF- MS-analyysi, jossa on AUTOFLEX massaspektrometriä (Bruker, Japani) kalibroinnin jälkeen peptidin kanssa massa standard kit (Bruker, Japani) käyttämällä sinapiinihappoa matriisina.

DNA analyysi

nukleotidisekvenssejä määritettiin dideoksi-ketjun terminaattori menetelmällä käyttäen BigDye Terminator version 3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems). DNA: n sekvensointi suoritettiin käyttäen ABI 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

Glycan erilaisia ​​analyysi

PFL leimattiin Alexa Fluor 488 mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti (Invitrogen, Eugene, OR). Glykaanin sitova spesifisyys PFL määritettiin painetun glykaanin mikrosiruja (versio 5.0) standardin menettely CoreH konsortion for Functional glykomiikan (CFG) (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp ). Keskimääräinen suhteellinen fluoresenssi rinnakkaisnäytteet kuusi laskettiin laskemalla keskiarvo neljästä arvosta poistamisen jälkeen korkein ja alin arvo poistamaan joitakin vääriä osumia erittäin korkea tai matala pistettä. Virhe palkit edustavat standardin keskivirhe (SEM), ja% CV on vaihtelukerroin (SD /keskiarvo) laskettu%.

Anti-Influenssa aktiivisuus PFL

In vitro
anti-influenssa aktiivisuus PFL määritettiin neutraali punainen (ET) väriaineen oton määritystä. Eri pitoisuuksia PFL valmistettiin DMEM, joka sisälsi 10 ug /ml trypsiiniä 96-kuoppalevyn. Kuhunkin kuoppaan, virus lisättiin infektiokertoimella noin 0,001 tarttuvien partikkelien solua kohti. Kun oli inkuboitu 37 ° C: ssa 48 h, 100 ui NR väriainetta (150 ug /ml DMEM: ssä) lisättiin ja inkuboitiin edelleen 2 h. NR väriaine siirtyy soluihin uutettiin lisäämällä 100 ui 1% etikkahappoa /50% etanolia. Kuopat mitattiin 540 nm: ssä mikrolevylukijalla (1420 -monileimalukijaa, PerkinElmer, MA, USA) kertoimella elossa peräisin viruksen sytopaattisen vaikutuksen.

immunofluoresenssimikroskoopilla

immunofluoresenssi oli suoritetaan visualisoida pääsyn estäminen influenssaviruksen mukaan PFL. Lyhyesti, MDCK-solut kasvatetaan suojalasi infektoitiin A /Udorn /72 infektiokertoimella noin 0,001 tarttuvien hiukkasten solua kohti, kun läsnä on tai ei ole 200 nM PFL DMEM, joka sisälsi 10 ug /ml trypsiiniä. Sen jälkeen kun 24 tuntia infektion, tartunta solut kiinnitettiin 80% asetonilla 5 min. Pesun jälkeen PBS: llä, soluja inkuboitiin hiiren monoklonaalisten anti-HA-vasta-ainetta (HyTest, Turku, Suomi) 37 ° C: ssa 1 h. PBS-pesun jälkeen soluja inkuboitiin fluoreseiini-isotiosyanaatti (FITC) -konjugoitu vuohen anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta (Anticorps Secondaires, Compiegne, Ranska) 37 ° C: ssa 1 h. Sen jälkeen kun vielä PBS pesun jälkeen solut kiinnitetään käyttämällä Vectashield 4 ', 6-diamino-2-fenyyli (DAPI) (Vector Laboratories, Burlingame, CA), ja niitä havaittiin fluoresenssimikroskoopilla-mikroskoopin (OLYMPUS BX51, Olympus, Japani).

ELISA-määrityksessä

suora vuorovaikutus PFL viruksen vaippaglykoproteiinin HA määritettiin käyttäen entsyymi-immnosorbent määrityksellä (ELISA). PFL (5 ug /ml) karbonaattipuskurissa (pH 9,6) päällystettiin 96-kuoppaisille ELISA-levyille (BD Biosciences, Bedford, MA). Kuopat pestiin kolme kertaa PBS: llä, joka sisälsi 0,1% Tween 20: tä (PBST) ja blokattiin 3% kuorittua maitoa 37 ° C: ssa 1 h. PBST: llä, erilaisina pitoisuuksina influenssan HA-rokotteen valmistamiseksi (Astellas, Tokio, Japani) lisättiin kuhunkin kuoppaan ja inkuboitiin 37 ° C: ssa 1 h. PBST: llä, kuoppiin inkuboitiin hiiren anti-HA-monoklonaalinen vasta-aine (HyTest) 37 ° C: ssa 1 h, mitä seurasi inkubointi piparjuuriperoksidaasiin (HRP) konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta (GE Healthcare, UK ) 37 ° C: ssa 1 h. Tämän jälkeen 3,3 ', 5,5'-tetrametyylibentsidiini (TMB) substraattina (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MI) lisättiin. Reaktio pysäytettiin käyttäen TMB Stop-reagenssia (Sigma-Aldrich), ja absorbanssi 450 nm: ssä mitattiin mikrolevynlukijaa käyttäen (1420 -monileimalukijaa, PerkinElmer).

Kasvain soluproliferaation MTS-määritys

soluproliferaatiota kvantitoitiin tavanomaisella MTS-määritys käyttäen CellTiter 96-solujen lisääntymisen määrityksessä (Promega, Madison, WI). -Solut ympättiin 96-kuoppaisen mikrolevyn inkuboitiin 72 tuntia erilaisilla pitoisuuksilla PFL sopivassa väliaineessa, jossa oli 10% FBS: ää. Soluja inkuboitiin sitten 20 ui MTS-reagenssia 1 tunti 37 ° C: ssa ja mitattiin mikrolevylukijalla (1420 -monileimalukijaa, PerkinElmer) 490 nm: ssä. Vaikutus hiivan mannaania on cytotoxity on PFL määritettiin inkuboimalla soluja 5 uM PFL, kun läsnä on eri pitoisuuksia hiivan mannaania RPMI 1640, jossa oli 10% FBS: ää 72 tuntia, ja solujen elinkyky mitattiin kuten edellä on kuvattu.

eristäminen PFL sitovan molekyylin (t) MKN28 solun

PFL oli leimattu biotiinilla käyttäen biotiini -leimauskittiä (Dojindo molekyyli-, Japani) mukaisesti valmistajan ohjeiden mukaisesti. Yhteen- kasvaneille MKN28 solujen peitinlaseja, biotinyloitua-PFL (200 ug) lisättiin ja inkuboitiin 2 tuntia huoneenlämpötilassa. Kun oli pesty kylmällä PBS: llä, solut kaavittiin pois ja hajotettiin 800 ul: aan RIPA-puskuria (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P40, 0,5% Natriumdeoksikolaatti, proteaasiestäjäseostabletit, 0,1% SDS: ää ). Sen jälkeen 100 ui biotiini-capture avidiinihelmiin (Adar Biotech, Israel) lisättiin solulysaattiin ja inkuboitiin yön yli 4 ° C: ssa varovasti sekoittaen. Helmet pestiin kolme kertaa 50 mM Tris-HCl, pH 7,5. Jää proteiinit helmet eluoitiin 50 ui SDS-PAGE-näytepuskuria (62,5 mM Tris, pH 6,8, 2% SDS, 10% glyseroli, 1% merkaptoetanolia, 0,003% bromifenolisinistä) ja 15 min 90 ° C: ssa ja alistettiin SDS-PAGE. Proteiini bändi spesifinen PFL hoitoa jae analysoitiin MALDI-TOF MS jälkeen geelissä trypsiinillä hajotusta. Lyhyesti, CBB värjätään Proteiinivyöhykkeet leikattiin pois ja väri poistettiin 25 mM ammoniumbikarbonaattia sisälsi 50% asetonitriiliä. Pelkistävä alkylointi suoritettiin 50 mM TCEP: tä (Tris [2-karboksietyyli] fosfiinia) 25 mM ammoniumbikarbonaattia, jonka jälkeen inkuboitiin 50 mM iodoacetoamide 1 tunti. Dehydraation jälkeen asetonitriilillä, proteiini geeli pilkottiin 10 ul: TPCK-trypsiiniä (100 ug /ml) 50 mM ammoniumbikarbonaattia. Mädätys puhdistettiin Zip kärki (Millipore, Japani) ja täpläksi MALDI tavoite. Yksi ui matriisiliuosta (α-syano-4-hydroxycinnapic happo matriisi [Bruker, Japan] asetoni-etanoli [1:02]) lisättiin sitten paikan päällä. MALDI-TOF MS-analyysi suoritettiin jota AUTOFLEX massaspektrometriä (Bruker, Japani) kalibroinnin jälkeen peptidin kanssa massa standard kit (Bruker, Japani). Peptidi massa sormenjälkien tietoja haettiin jonka Mascot ohjelmisto (Matrix Science, Japani).

Cellular lokalisointi PFL ja integriini α2

MKN28 soluja viljeltiin peitinlaseil- on 6-kuoppalevyllä . Solut kasvavat peitinlaseil- käsiteltiin 30 ug /ml Alexa488 konjugoitua-PFL RPMI 1640 ja inkuboitiin eri ajanjaksoja. PBS-pesun jälkeen solut kiinnitettiin 80% asetonissa 5 min. Pesun jälkeen PBS: llä, soluja inkuboitiin hiiren monoklonaalisten anti-integriini α2 /CD49b-vasta-ainetta (R &D Systems, MN) 37 ° C: ssa 1 h. PBS-pesun jälkeen soluja inkuboitiin Alexa568-konjugoitua vuohen anti-hiiri-IgG-vasta-ainetta (Life Technologies, Japani) 37 ° C: ssa 1 h. Sen jälkeen kun vielä PBS Pesun jälkeen solut kiinnitetään käyttäen Vectashield DAPI (Vector Laboratories) ja havaittiin alle konfokaali laserkeilauksen mikroskooppi (IX70, Olympus, Japani). Käyttämällä muita mahalaukun syövän solulinja GCIY ja normaaleihin ihmisen maksasolujen solujen ACBRI 3716, solu lokalisointi integriini α2 ja Alexa488-PFL tutkittiin samalla tavalla kuin yllä on kuvattu, ja havaittiin fluoresenssimikroskoopilla (OLYMPUS BX51). Vaikutus hiiva mannaania annetun sijainti solun PFL ja integriinin α2 arvioitiin seuraavasti. Konfluentit MKN28 soluja kasvatettiin peitinlaseilla on 6-kuoppalevyllä käsiteltiin 20 ug /ml Alexa488-PFL RPMI 1640: n läsnä tai poissa ollessa 700 ug /ml hiivan mannaania 4 tuntia. Solut kiinnitettiin, visualisoitiin käyttämällä anti-integriini α2 /CD49b-vasta-ainetta, kuten edellä on kuvattu, ja havaittiin fluoresenssimikroskoopilla (OLYMPUS BX51). Vaikutus eri lektiinejä sijainti solun integriini α2 tutkittiin samalla tavalla, inkuboimalla MKN28 soluja 20 ug /ml kutakin lektiinin RPMI 1640: ssa 4 tuntia.

Tulokset

Molecular cloning, ilmentyminen ja puhdistus PFL

Olemme aiemmin havaittu genomista P. fluorescens
Pf0-1 sisältää mahdollinen homologia anti-HIV lektiini perheen joka on hiljattain löydetty alempi organismien, kuten bakteerien, syanobakteerien ja merilevä [4]. Perustuen nukleotidisekvenssin hypoteettisen lektiini P. fluorescens
Pf0-1 tietokantaan, alukesarjat oli suunniteltu monistamaan lektiinin geenin. Otaksuttu lektiini geeni onnistuneesti kloonattiin suuntaava TOPO kloonaus järjestelmä, ja koodaus proteiini heterologisesti ilmaistu E. coli
BL21 (DE3). Ilmentynyt lektiini proteiini puhdistettiin homogeeniseksi yhdessä vaiheessa geelisuodatuksella Superose 12 -pylväällä (Fig. 1A). Aktiivinen huippu hemagglutinaatioaktiivisuus antoi yhden proteiinijuovan 13 kDa SDS-PAGE (kuvio. 1 B). Lopuksi 1 pentueen E. coli
kulttuuri, high yield puhdistettua lektiinin (240 mg) saatiin. Puhdistettu lektiini nimettiin PFL ja käytettiin jatkotutkimuksiin. Molekyylimassa PFL (13883,7) määritettiin MALDI-TOF-MS oli kanssa laskennallisen massan (13881,1) päässä päätelty aminohapposekvenssi, ja että arvioitu arvo liikkuvuutta SDS-PAGE.

päätelty aminohapposekvenssi PFL kanna kaksi homologista domeenia, joista kumpikin koostuu N- ja C-terminaaliset puolikkaat 62% sekvenssi-identiteetti niiden välillä. PFL näytteillä korkea sekvenssihomologia syanobakteerien lektiinin OAA iältään Oscillatoria agardhii
, punainen levien lektiini ESA-2 Eucheuma serra
, ja bakteeri lektiini MBHA iältään Myxococcus xanthuksesta
(kuvio . 2B), jotka muodostavat uusia HIV-lektiini perhe. Molekyylimassa PFL ja OAA olivat samanlaisia, 13883,7 ja 13924,1, vastaavasti, ja molemmat lektiinit koostuivat 132 aminohappoa. Sekä PFL ja OAA on yhteinen ominaisuus sen järjestyksessä päällekkäisyyksiä mutta OAA näyttää korkeamman sisäisen identtisyys 75% kahden toistuvan verkkotunnuksia. Sen sijaan, ESA-2 ja MBHA koostuvat neljästä peräkkäin toistuvia homologisia domeeneja 67 aminohappoa. Astetta samankaltaisuuden OAA, ESA-2 ja MBHA PFL niiden N-terminaalista osaa (kukin 132 tähdettä) ja aminohapposekvenssit olivat 62,1, 61,4 ja 62,1% samoja aminohappoja, vastaavasti.

hiilihydraattien sitova spesifisyys PFL

määrittämiseksi hiilihydraattia sitovan spesifisyyden PFL, glykaanitähteen erilaisia ​​analyysi suoritettiin konsortio for Functional glykomiikan käyttäen painettua array versiota 5.0. On 611 erilaista oligosakkaridia testattu, PFL (10 ug /ml) sisälsi spesifisyyden ainoastaan ​​paljon mannoosia sisältäviä glykaaneja, kuten on esitetty kuviossa. 3. Koko lista oligosakkaridin testattava ja tulokset löytyvät osoitteesta (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp).

PFL sitoutuu voimakkaasti M6 glykaanitähteen (216 ) ja M8 glykaanitähteen (212), jotka molemmat on alttiina α1-3 Mies D2 käsivartensa samalla tasolla korkean RFU arvoista, 43471 ja 40759, vastaavasti. Sen sijaan, peittämisen tämän α1-3 Mies α1-2 Man dramaattisesti heikentynyt vuorovaikutusta PFL ja glykaanien. Tämä oli ilmeisintä vertaamalla M6 glykaanitähteen (216) ja M7 glykaanitähteen (211), jossa lisäksi α1-2 Man D2 arm laski sitovan teho noin 53%. Samoin sitova teho PFL M9 glykaanitähteen (213) laski (RFU = 8535) verrattuna sen vastine M8 glykaanitähteen (212) puuttuu D2 terminaali α1-2 Man, joka osoittaa vain 21%: n teho. Mielenkiintoista, poistaminen vähentää terminaalin disakkaridi, GlcNAc-GlcNAc korkean mannoosia glykaanien paljon dramaattisesti vähentynyt PFL-sitova. Esimerkiksi PFL sitova teho on lähes kokonaan poistettiin ja glykaanit 316 ja 317, joilla ei ole GlcNAc-GlcNAc-sekvenssin nämä vastine glykaanien 212 ja 213, vastaavasti, esillä paljon suurempi teho. Tärkeys terminaali GlcNAc-GlcNAc varmistettiin lisäksi vertailussa glykaanien 217 ja 315, vaikka laajuus arvonalentumisesta PFL-sitoutuminen oli rajallinen. Tämä lektiini puuttui monosakkaridi sitovan lukien mannoosi. Lisäksi, PFL ei vuorovaikutuksessa Man α1-6 Man (314) ja mannotriose (214), jotka ovat ainesosia haarautuneen osan paljon mannoosia glykaanien. Pentasakkaridiannos ydin N-glykaanin (50) ei tunnista PFL mutta sen fukosyloituja vastine (485) näkyy heikko vuorovaikutus (RFU = 746). Nämä oligosakkaridirakenteisiin sitova profiilit PFL olivat hyvin samankaltaisia ​​kuin lentoliikennealue, ESA-2 ja KAA-2, jotka kuuluvat uutta HIV-lektiini perheen alempi organismien [4] - [6].

Anti influenssa virus aktiivisuus PFL

Anti-influenssaviruksen aktiivisuus PFL arvioitiin kahdella viruskantoja, A /Udorn /72 (H3N2) ja A /Beijing /262/95 (H1N1) mukaan NR väriaine otto määritys. PFL tehokkaasti esti solutuhovaikutus aiheuttamaa molemmat viruskantoja, jossa EY _{50s 19,4 ± 1,5 nM, ja 4,5 ± 0,4 nM (kuvio. 4A). Sen vahvistamiseksi, että PFL esti ensimmäinen askel influenssaviruksen pääsyn soluihin, jakelu viruksen vasta infektoiduissa soluissa havaittiin läsnä ollessa tai puuttuessa PFL käyttäen immunofluoresenssimikroskopialla. Kuva. 4B on esitetty jakautuminen Virusantigeenin jälkeen 24 tuntia infektion A /Udorn /72 havaitsee tietyn anti-hemagglutiniini-aineella. PFL tehokkaasti esti influenssaviruksen tuloa soluihin taas virukset pystyivät tunkeutumaan ja replikoitua isäntäsoluissa puuttuessa PFL. Galaktoosipitoisen lektiiniä PNA iältään Arachis hypogaea
eivät estäneet viruksen pääsyä soluihin. Nämä tulokset viittaavat siihen, läsnäollessa runsaasti mannoosia glykaanien viruksen pinnalla siihen kohtaan kriittisiä viruksen pääsyä soluihin. Testata, onko PFL olisi suoraan sitoutua viruksen vaipan glykoproteiini HA, joka on ELISA-määritys suoritettiin kaupallisesti saatavissa rokotetta valmiste, joka sisältää HA A /Kalifornia /7/09 (H1N1), A /Victoria /210/09 (H3N2), ja B /Brisbane /60/08 pääkomponenttina. Kuten osoitettu kuvassa. 4C, annoksesta riippuvainen sitoutuminen HA PFL havaittiin.}

PFL solukuolema ihmisen mahasyövän solun MKN28

In vitro
kasvainten vastaisen vaikutuksen PFL on mahalaukun syöpäsolun MKN28 arvioitiin tavanomaisilla MTS-määritys. Kuten on esitetty kuviossa. 5A (vasen paneeli), PFL osoitti annoksesta riippuva vaikutus proliferaatioon MKN28 solun. 72 tunnin kuluessa PFL-hoito, solujen elinkelpoisuuden pieneni merkitsevästi annoksilla 0,5 uM tai enemmän. Sen sijaan alhaisilla annoksilla 0,1-0,3 uM, proliferaatiota hieman edistettävä. PFL-indusoidun solukuoleman MKN28 solujen mukana menetys soluadheesiota pohjaan kulttuurin levy, kuten on esitetty kuviossa. 5B jossa everted klusterin soluja havaittiin ruskehtava linjat. PFL-solukuolema estettiin tehokkaasti läsnä hiivan mannaanista glykoproteiini laakeri korkea mannoosia oligosakkarideja (Fig. 5A, oikea paneeli). Tämä osoittaa runsaasti mannoosia glykaanien MKN28 solut osalliseksi PFL aiheuttaman solun signalointi, joka lopulta johtaa solun kuolemaan. Sen sijaan normaalin ihmisen hepatosyyttien soluja (ACBRI 3716), olivat suhteellisen resistenttejä PFL hoitoon verrattuna MKN28 solut (Fig. 5A, vasen paneeli).

eristäminen PFL sitova molekyyli (t) ihmisen mahasyöpä solu MKN28

Vastatakseen molekyylitason mekanismi, jolla PFL indusoi solukuolemaa MKN28 solun, solun pinnan molekyyli (t), johon PFL sitoutuneet tutkittiin. Biotinyloitu PFL inkuboitiin 2 h MKN28 solut ja solut lyysattiin RIPA-puskurilla, joka sisälsi 0,1% SDS: ää. Solun pinnan molekyyli (t), johon biotiini-PFL sitoutuneen oli yhteistyössä saostettiin avidiinilla päällystetyillä helmillä. Proteiinit loukkuun helmet eluoitiin seuraavaksi SDS-PAGE-näytepuskuriin ja analysoitiin SDS-PAGE (kuvio. 6A). Vaikka useat epäspesifisiä vyöhykkeet havaittiin, havaitsimme 150 kDa jossa nimenomaan havaittiin PFL käsitelty jae. Tämä bändi on edelleen suoritettava in-geeliä ruuansulatuksen trypsiinin seuraa MALDI-TOF massaspektrometrianalyysissä. Saatu peptidi massa sormenjälki- (Fig. 6B), etsittiin tietokannasta ja proteiini tunnistettiin integriini α2, ja todennäköisyys, joka perustuu tulokset 57 (p < 0,05).

Cellular localization eksogeenisesti lisättyä PFL ja integriini α2

käyttäytymisen PFL itsensä ja integriini α2 käsittelemällä PFL tutkittiin käyttäen konfokaali fluoresenssimikroskooppia. Tässä kokeessa fluoresenssileimattua PFL (Alexa488-PFL) käytettiin seurata PFL lokalisointi. Alexa488-PFL inkuboitiin MKN28 solujen 1, 5 ja 24 h annoksilla 30 ug /ml. Integriini α2 havaittiin anti-integriini α2 /CD49b monoklonaalinen vasta-aine, jota seuraa Alexa568-konjugoitu 2. vasta-aine. Mielenkiintoista, Alexa488-PFL sitoutuneena solun pintaan ja aloitetaan sisäistämisen sytoplasmaan 1 tunnin kuluessa (Fig. 7). Integriini α2 joka pääasiassa lokalisoitu solun pinnalla vakaassa tilassa myös tehtiin sisäistämisen, ja tärkeintä, lokalisoinnin integriini α2 samaan hyvin PFL. 5 tunnin inkubaation sekä PFL ja integriini α2 olivat yhdessä lokalisoitu ja kertynyt perinuclear alueella ja edelleen inkuboitu pohjimmiltaan ei muuttanut sijainti molempien proteiinien. Sen vuoksi on todennäköistä, että kun PFL sitoutunut integriini α2, molemmat proteiinit ei ole koskaan kierrätetään takaisin solun pinnalla. Rapid solunsisäiseen kuljetukseen PFL-integriini α2 monimutkainen tapahtui jopa kollageeni I päällystetty peitinlaseja (tuloksia ei ole esitetty). Samoin, uudelleenjako integriini α2 käsittelemällä PFL havaittiin toisessa mahasyövän solulinja, GCIY, mutta ei normaaleissa ihmisen hepatosyyttien soluja, ACBRI 3716 (Fig. 8). Vuonna ACBRI 3716 soluissa, sisäistäminen PFL ei havaittu mahdollisesti vähemmän integriini α2 solun pinnalla.

osallistuminen korkean mannoosia glykaanien PFL-integriini α2 vuorovaikutus

Voit testata, onko solu uudelleenjako integriini α2 aiheuttamien PFL voi syntyä spesifisen vuorovaikutuksen PFL suurella mannoosia glykaanien integriinin α2 molekyyli, olemme arvioineet vaikutusta hiiva mannan on PFL aiheuttama integriini α2 sisäistämisen käyttäen MKN28 soluja. Koska hiivan mannaania, molemmat proteiinit tehtiin merkittäviä sisäistämisen (Fig. 9A, ylempi paneeli). Sitä vastoin, kun läsnä on hiivan mannaania, PFL ei onnistunut sitoutumaan solun pinnalla, ja sen jälkeen solunsisäiseen kuljetukseen PFL on poistaa kokonaan (Fig. 9A, alhaalla oikealla). Sopia tähän havaintoon, integriini α2 ei muuttavat sen lokalisointia läsnä hiivan mannaania (Fig. 9A, alhaalla vasemmalla). Nämä tulokset osoittavat selvästi, että PFL sitoutunut integriini α2 tunnustamalla runsaasti mannoosia glykaanien integriinin α2. Edelleen vahvistaa vaatimuksen korkean mannoosia glykaanien integriini α2 uudelleenjako olemme testanneet vaikutus eri lektiinejä sijainti solun integriini α2. Kuten on esitetty kuviossa. 9B, muut lektiinit erilaiset spesifisyydet, kuten galaktoosia sitova PNA päässä Arachis hypogaea
, fukoosin sitova AOL päässä Aspergillus oryzae
, siaalihapon sitova MAM päässä Maackia amurensis
, D-GlcNAc-sitova UDA päässä nokkonen
ei vaikuttanut sijainnin integriinin α2. Mielenkiintoista, jopa paljon mannoosia sitovia lektiinejä kuten monocot mannoosin (Man): aa sitova lektiini, GNA alkaen lumikello
ei osoittanut mitään merkittävää muutosta integriinin α2. Sen sijaan paljon mannoosia sitova palkokasvien lektiini ConcanavalinA (ConA) vääristynyt järjestely integriini α2 kuten PFL teki.

Keskustelu

Tässä tutkimuksessa olemme arvioineet biologista aktiivisuutta romaani bakteerien lektiinin PFL alkaen P. fluorescens
Pf0-1 joka kuuluu hiljattain löydetty HIV-lektiini perheen alemmissa organismeihin. Esiintyminen lisääntyy lääkeresistenttiä-influenssaviruskantoja sekä uusia erittäin patogeeninen viruskantoja, kuten linnun H5N1 johti meidät tutkimaan PFL uutena anti-influenssa aineena. PFL osoitti voimakas anti-influenssa-virus ja mekanismi, jolla PFL esti virusreplikaation oli inhibitio ensimmäinen vaihe viruksen pääsyä soluihin. On erittäin todennäköistä, että PFL kohdistuu anti-influenssa aktiivisuutta selektiivisesti sitoutumaan paljon mannoosia glykaanien virusvaipan HA, kuten on osoitettu ELISA-määrityksessä [9]. Itse asiassa, paikkasidonnainen esiintyminen korkean mannoosipitoisuuden omaavan oligosakkaridin on esitetty alueen HA lähellä reseptoriin sitoutuvan [10].

tutkia kasvainten vastaisen vaikutuksen PFL, käytimme ihmisen mahasyövän solulinja MKN28 joka on peräisin kohtalaisen eriytetty suoliston tyyppi kasvain. Punainen levien lektiini ESA-2, joka kuuluu samaan lektiinin perheen PFL näytteillä antituumorivaikutuksen sekä in vitro
ja in vivo
[7], [8]. ESA-2 on proteiini peräisin syötävät levät ja oletettavasti kasvaimen vastaisen vaikutuksen ruoansulatuskanavassa syöpää suun kautta. On huomattava, että PFL edisti solukuolemaa MKN28 solun yksinomaan tunnustus korkean mannoosia glykaanien integriini α2 molekyyli, joka pääasiassa sijaitsee solun pinnalla vakaassa tilassa. Heterodimeerinen integriinit toimia paitsi ankkurointi molekyylin liittää solujen sopivan soluväliaineen (ECM), mutta myös antureita ECM ympäristön [11].

• PLoS ONE: Honokiol indusoi Calpain välittämää glukoosin säätelemä proteiini-94 lohkaisu ja apoptoosi ihmisen mahasyöpä Syöpäsolut ja Vähentää kasvaimen kasvu
• Tyypit mahan cancer