Ploche ONE: High-manózu Väzba antivirotikum lektín PFL z Pseudomonas fluorescens Pf0-1 podporuje bunkovú smrť v žalúdku Cancer Cell MKN28 prostredníctvom interakcie s a2-Integrin

abstraktné

Novel anti-HIV lektínov rodine, ktorá vykazuje striktné väzbové špecificita pre vysoké manózu glykánov bol nájdený v nižších živočíchov. Bakteriálna ortolog bol identifikovaný v genóme Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 a gén kódujúci putativní lektín bol klonovaný, exprimovaný v Escherichia coli stroje a čistí sa o jeden krok gélovej filtrácie. Glykanové screening pole rekombinantnej lektínu, nazývané PFL, bolo zistené, že PFL preferenčne rozpoznáva vysoké mannózové glykánov s α1-3 človeka, ktorý bol veľmi exponované na pozíciu D2. Na rozdiel od maskovania tohto α1-3 Muž s α1-2 Man dramaticky zníženú interakciu lektín-sacharidov. Zníženie terminálu disacharid, GlcNAc-GlcNAc vysokých manózy glykánov bolo tiež nevyhnutné pre PFL-záväzné. PFL vykazovali silnú aktivitu vírusu proti chrípke inhibíciu vstupu vírusu do buniek v dávkach nízkej koncentrácii nanomolární. V mikromolárnych koncentráciu alebo vyššej, PFL vykazoval cytotoxicitu sprievodný stratu adhézie buniek proti ľudskej rakoviny žalúdka MKN28 buniek. Povrchová molekula, na ktorú sa viaže PFL koprecipitovaný biotínom značené PFL a identifikovaný ako integrín α2 hmotnostnej snímanie odtlačkov prstov peptidu pomocou MALDI-TOF hmotnostnej spektrometrie. Je zaujímavé, že po pôsobení exogénne PFL, integrín α2 na povrchu bunky prešli rýchlu internalizáciu do cytoplazmy a akumulovaný perinukleárním oblasti, spoločne s naviazaným PFL. Výsledná strata bunkovej priľnavosti by vyvolalo signálne dráhu, ktorá vyvolané anoikis podobné bunkovú smrť. Tieto udalosti boli účinne inhibované predčistenia PFL s mannnan, čo naznačuje zapojenie vysokých manózu glykánov na PFL-indukovanej bunkovej smrti, ktorá bola spustená PFL-integrinových a2 interakcií

Citácia :. Sato Y, Morimoto K., Kubo T, Yanagihara K, Seyama T (2012) High-manózu Väzba antivirotikum lektín PFL zo Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 podporuje bunkovú smrť v žalúdku Cancer Cell MKN28 prostredníctvom interakcie s a2-integrínu. PLoS ONE 7 (9): e45922. doi: 10,1371 /journal.pone.0045922

Editor: Roger Chammas, Universidade de São Paulo, Brazília

Prijaté: 7. mája 2012; Prijaté: 27 augusta 2012; Uverejnené: 20. septembra 2012

Copyright: © Sato et al. Toto je článok o otvorený prístup distribuovaný pod podmienkami Creative Commons Attribution licencie, ktorá umožňuje neobmedzené použitie, distribúciu a reprodukciu v nejakom médiu, za predpokladu, že pôvodný autor a zdroj sú pripísané

Financovanie :. Tento výskum bol podporovaný z časti grantom-in-pomoc pre mladých vedcov (b) z Japonska spoločnosť pre podporu vedy (JSP) (Grant číslo 24790101). Platcovia mal žiadnu úlohu v dizajne štúdie, zber a analýzu dát, rozhodnutie publikovať, alebo prípravu rukopisu

Konkurenčné záujmy: .. Autori vyhlásili, že žiadne konkurenčné záujmy neexistujú

Úvod

Vysoké manózu viažuci lektíny, ktoré sa zameriavajú na konkrétne glykánov na povrchu vírusu sú sľubné potenciálne vírusové inaktivujúcich látky, ktoré by mohli byť použité pre prevenciu a kontrolu vírusových infekcií [1], [2]. Početné lektíny, ktoré špecificky rozpoznávajú vysokej mannózové glykány sa nachádzajú z rôznych taxonómie, vrátane baktérií, rias, rastlín a zvierat, a niektoré z nich bolo preukázané, že vykazujú anti-HIV aktivitu [3]. Nedávno sme našli novú anti-HIV lektínu rodinu distribuovaný v nižších organizmov, vrátane baktérií, siníc a morských rias [4]. Vykazujú jednotné vlastnosti, ako je napríklad sekvenčné násobenie vysoko konzervatívny N-terminálny domény a exkluzívne vysokej manózových oligosacharidov rozpoznávania. Niektoré lektíny v tejto rodine ako je napríklad siníc OAA z Oscillatoria agardhii
[4] a červené rias ESA-2 od Eucheuma Serra
[5] ukázali, že inhibujú vstup HIV do hostiteľských buniek s EC _{50s nízke nanomolární priamou väzbou na obálky gp120. Okrem toho červené rias lektín KAA-2 od Kappaphycus alvarezii
, ktorý patrí tiež do tejto rodiny inhibuje infekcii rôznych kmeňov chrípkových vírusov s EC 50s nízkej hladiny nanomolárních v kmeni nezávislý spôsobom, a to prostredníctvom uznanie vysokej mannosa oligosacharidy na vírusový obal glykoproteín hemaglutinín (HA) [6].}

Okrem silné antivírusové účinnosti, ESA-2 ukazuje rôzne biologické aktivity, ako je mitogénnu aktivitu pre myší a ľudské lymfocyty a in vitro
inhibícia rastu nádorových buniek [7], [8]. Hoci biologické vlastnosti tohto lektínov rodiny sa stávajú zrejmé, vlastnosti bakteriálnych orthologues zo Pseudomonas fluorescens
Pf0-1 a Herpetosiphon aurantiacus
stále potrebné objasniť.

súčasná štúdia sme naklonovali ortolog lektínu gén P. fluorescens
Pf0-1 a kódovaný proteín lektín (PFL) bol vyjadrený v Escherichia coli
. Funkčné PFL bol úspešne prečistí vo vysokom výťažku a charakterizované, pokiaľ ide o jeho biologickej aktivity, ako je protivírusové a protinádorové aktivity. Ako sa očakávalo z intenzívneho štruktúrnej podobnosti PFL s inými členmi tejto rodiny lektínov, PFL vykazovali výhradný špecificitu pre vysokú manóza oligosacharidy a silnú antivírusovú aktivitu proti vírusom chrípky. Okrem toho, PFL indukované anoikis-like bunkovú smrť žalúdka rakovinových buniek MKN28 prostredníctvom interakcie s bunkového povrchu integrín a2.

materiáloch a metódach

Materiály

Stab Kultúra P. fluorescens
Pf0-1 bola veľkoryso poskytol Dr. Mark W. Silbe (University of Massachusetts Dartmouth, USA). Chrípkové vírusy a psie obličky (MDCK) bunky Madin-Darby boli veľkoryso poskytol Dr. T. Sakaguchi (Hiroshima University, Japonsko): Vírusy chrípky boli pestované v chorioallantoidní tekutine 10 dní starých slepačích vajciach. MDCK bunky boli kultivované v Dulbeccova modifikovanom Eagle médiu (DMEM) doplnenom 10% fetálnym bovinným sérom a penicilín-streptomycín. Bunková línia rakoviny žalúdka, MKN28 láskavo poskytol Prof. Suzuki (Fukushima lekárskej univerzity, Fukushima, Japonsko). Bunková línia bola udržiavaná v médiu RPMI-1640 (GIBCO, Grand Island, NY) doplnenom 10% fetálnym bovinným sérom (FBS, Gibco), 100 IU /ml sodná soľ penicilínu G a 100 mg /ml streptomycín sulfátu. Ďalšie žalúdka bunková línia rakoviny, GCIY, bol zakúpený od Riken bunkovej banky (Ibaraki, Japonsko) a udržiavaná rovnakým spôsobom, ako je popísané vyššie. Primárne normálny ľudský hepatocytov buniek (ACBRI 3716) bol zakúpený od DS Pharma Biomedical (Osaka, Japonsko) a udržiavané v SK-C Médium súprava R (DS Pharma Biomedical).

hemaglutinačno test

hemaglutinačnej test bol vykonaný s použitím 2% (objem /objem) suspenzie trypsínom ošetrené králičích erytrocytov, ako bolo opísané skôr [9]. Stručne povedané, králik natívne erytrocytov suspenzia sa nechá reagovať s 0,5% trypsínu v roztoku chloridu sodného a zmes bola inkubovaná pri teplote 37 ° C počas 60 min. Po premytí roztokom chloridu sodného, ​​2% trypsín ošetrených erytrocytov sa pripraví suspenzia vo fyziologickom roztoku. Hemaglutinačnej aktivita bola vyjadrená ako titer, prevrátená hodnota najvyššieho 2 zriedením vykazuje pozitívne hemaglutinácie.

Gene Klonovanie a expresia lektínu PFL

genómovej DNA P. fluorescens
Pf0-1 bola použitá ako templát pre klonovanie génu z PFL génu. Najprv sa oligonukleotidové primer set, 5'-GGCAGGTCTCCCGAAACTTCAAG-3 'a 5'-AGTCGAACGCCTGAACCTGTTGA-3', ktorá hybridizuje s proti prúdu a po prúde od kódujúcej oblasti PFL, v danom poradí, boli použité, a PCR bola vykonaná za použitia Prime DNA STAR polymerázy (TAKARA). Pomocou amplifikovanej PCR fragmentu ako šablónu, následné PCR bola vykonaná s dopredným primerom 5'-CACCATGTCTAAATACGCAGTGGCA-3 ', ktorý mal ČAKK ďalšie sekvencie ATG štart kodóne génu PFL, a reverzné primer, 5'-TTACTCTATCTGCCCACGGAAG -3 '(TTA, zodpovedajúce stop kodóne génu RFL). Amplifikované fragmenty boli ligovány do pET101 /D-TOPO vektora pre expresiu. Rekombinantný plazmid bol transformovaný do Escherichia coli
TOP10 buniek (Invitrogen). Získané rekombinantné klony boli potvrdené byť správny konštrukt DNA sekvenovaním. Funkčné klony boli transformované do Escherichia coli BL21
hviezdy (DE3) buniek pre indukovatelnou expresiu génu PFL. IPTG sa na konečnú koncentráciu 0,8 mM sa pridá do transformovanej kultúry k indukcii expresie PFL. Po 6 hodinách inkubácie pri 37 ° C, boli bunky zozbierané centrifugáciou pri 8000 otáčkach za minútu po dobu 20 minút.

Čistenie lektínu PFL

Získané Bakteriálne bunky boli resuspendované v 20 mM fosfátovom pufri ( pH 7,0) s obsahom 0,15 M NaCl (PBS) a boli rozrušené sonikací. Po odstredení pri 8000 otáčkach za minútu po dobu 20 minút, alikvotná časť supernatantu bol podrobený Superose 12 kolónu (GE Healthcare), ekvilibrovanou pomocou PBS. Stĺpec sa vymýva s PBS pri prietokovej rýchlosti 0,8 ml /min pomocou isokratickém modu. Eluát sa sleduje pomocou absorpcie pri 280 nm a vyšetrí na hemaglutinačnej aktivitu a aktívne frakcie boli spojené.

Stanovenie molekulovej hmotnosti z PFL

Molekulárna hmotnosť bola stanovená pomocou PFL MALDI-TOF MS analýzu s hmotnostným spektrometrom AutoFlex (Bruker, Japonsko) po kalibrácii peptid hmotnosť štandardného kit (Bruker, Japonsko) za použitia sinapinová kyselina ako matrice.

sekvencie DNA analýza

Nukleotidové sekvencie boli stanovené metódou dideoxy terminátora reťazca s použitím BigDye terminátor Cycle Sequencing verzia 3.1 kit (Applied Biosystems). Sekvenovania DNA sa vykonáva za použitia ABI 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).

glykan array analýza

PFL bol označený s Alexa Fluór 488 v súlade s pokynmi výrobcu (Invitrogen, Eugene, OR). Glykanové väzba špecifickosť PFL bola stanovená tlačených glykanových mikročipov (verzia 5.0) podľa štandardného postupu CoreH konzorcia pre funkčné Glycomics (CFG) (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp~~HEAD=pobj ). Priemerná relatívna fluorescencie v repliky šiestich bola vypočítaná ako priemer štyroch hodnôt po odstránení najvyššej a najnižšej hodnoty, na odstránenie niektorých falošných hitov s veľmi vysokými alebo nízkymi bodmi. Chybové úsečky predstavujú štandardné chybu strednej hodnoty (SEM), a% CV je variačný koeficient (SD /priemer), počítané ako%.

protichrípkových aktivita PFL

In vitro
proti chrípke aktivita PFL bola stanovená neutrálnej červene (NR) príjmu farbivá testu. Rôzne koncentrácie PFL boli pripravené s DMEM s obsahom 10 ug /ml trypsínu v 96-jamkové mikrotitračné doštičky. Do každej jamky, vírus bol pridaný ako multiplicitě infekcie približne 0,001 infekčných častíc na bunku. Po inkubácii pri teplote 37 ° C počas 48 hodín, bolo pridané 100 ul farbiva NR (150 ug /ml v DMEM), a ďalej inkubované po dobu 2 hodín. NR farbivo začlenené do buniek sa extrahuje pridaním 100 ul 1% kyseliny octovej /50% etanolu. Jamky bola meraná pri 540 nm pomocou ELISA readeru (1420 Multilabel pult, PerkinElmer, MA, USA) ako faktor prežitia z vírusu cytopatického účinku.

imunofluorescenčné mikroskopie

imunofluorescenčné farbenie bolo vykonáva vizualizáciu vstupné inhibíciu chrípkového vírusu PFL. V stručnosti, bunky MDCK pestované na krycom skle boli infikované A /Udorn /72 pri multiplicitě infekcie približne 0,001 infekčných častíc na bunku, v prítomnosti alebo neprítomnosti 200 nM PFL v DMEM obsahujúcom 10 ug /ml trypsínu. Po 24 h po infekcii boli infikované bunky boli fixované 80% acetónom po dobu 5 minút. Po premytí PBS boli bunky inkubovali s myšou monoklonálnou anti-HA protilátkou (HyTest, Turku, Fínsko) pri teplote 37 ° C po dobu 1 hodiny. Po premytí PBS boli bunky inkubované s fluorescein isothiokyanátem (FITC) konjugovaným kozím anti-myšou IgG protilátkou (Anticorps Secondaires, Compiègne, Francúzsko) pri teplote 37 ° C po dobu 1 hodiny. Po ďalšom premytí PBS boli bunky namontované s použitím Vectashield s 4 ', 6-diamidínov-2-fenylindolu (DAPI) (Vector Laboratories, Burlingame, CA) a boli pozorované pod fluorescenčným mikroskopu (Olympus BX51, Olympus, Japan).

ELISA

priamej interakcie s PFL vírusového obalu glykoproteín HA bola testovaná za použitia immnosorbent testu s naviazaným enzýmom (ELISA). PFL (5 ug /ml) v pufri uhličitan (pH 9,6) sa nanesie na 96-jamkové doštičky ELISA (BD Biosciences, Bedford, MA). Jamky boli trikrát premyté PBS obsahujúcom 0,1% Tween 20 (PBST) a blokované 3% odstredeného mlieka pri teplote 37 ° C po dobu 1 hodiny. Po premytí s PBST, rôznymi koncentráciami prípravy chrípkovej vakcíny HA (Astellas, Tokyo, Japonsko) bol pridaný do každej jamky a inkubuje sa pri teplote 37 ° C po dobu 1 hodiny. Po premytí s PBST boli jamky inkubovali s myšou anti-HA monoklonálnymi protilátkami (HyTest) pri teplote 37 ° C počas 1 hodiny s následnou inkubáciou s chrenovou peroxidázou (HRP) konjugovaným kozím anti-myšou IgG protilátky (GE Healthcare, UK ) pri teplote 37 ° C po dobu 1 hodiny. Následne sa 3,3 ', bol pridaný 5,5'-tetrametylbenzidín (TMB) substrátom (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MI). Reakcia bola zastavená pomocou TMB zastavenie činidla (Sigma-Aldrich) a absorbancia pri 450 nm sa merala pomocou Microplate Reader (1420 Multilabel pult, PerkinElmer).

nádorové bunkovej proliferácie MTS testu

proliferácie buniek bola kvantifikovaná pomocou bežného MTS testu za použitia CellTiter 96 bunkovej proliferácie (Promega, Madison, WI). Bunky nasadené na 96-jamkové mikrotitračné doštičky boli inkubované po dobu 72 hodín s rôznymi koncentráciami PFL vo vhodnom médiu s 10% FBS. Bunky potom boli inkubované s 20 ul MTS činidla po dobu 1 hodiny pri teplote 37 ° C a meria sa čítačkou mikrodoštičiek (1420 Multilabel počítadlá, PerkinElmer) pri 490 nm. Účinok kvasiniek mannan na cytotoxity z PFL bola určená inkubáciou buniek s 5 uM PFL v prítomnosti rôznych koncentrácií kvasiniek mannan v RPMI 1640 s 10% FBS po dobu 72 hodín, a životaschopnosť buniek bola meraná ako je popísané vyššie.

Izolácia PFL väzbové molekula (y) na MKN28 buniek

PFL bol označený biotín pomocou značenia biotín kit (Dojindo molekulárnej technológie, Japonsko) podľa pokynov výrobcu. Na konfluentní MKN28 bunky na krycie sklíčka, biotinylizované-PFL (200 ug) bol pridaný a inkubuje sa s ním po dobu 2 hodín pri teplote miestnosti. Po premytí chladným PBS, bunky sa Zoškrabte a lyžovanie v 800 ul pufri RIPA (50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P40, 0,5% deoxycholát sodný, koktailu inhibítora proteázy, 0,1% SDS ). Následne sa 100 ul biotín-avidín zachytávanie guličiek (adar Biotech, Izrael) bol pridaný do bunkového lyzátu a inkubované cez noc pri 4 ° C za mierneho miešania. Perličky boli premyté trikrát s 50 mM Tris-HCl, pH 7,5. Zachytené proteíny na guličky boli eluované s 50 ul SDS-PAGE vzorkového pufra (62,5 mM Tris, pH 6,8, 2% SDS, 10% glycerolu, 1% mercaptoetanolu, 0,003% Brómfenolová modrá) počas 15 min pri teplote 90 ° C a podrobí sa SDS-PAGE. Proteínový pás špecifický pre liečbu frakciu PFL bola analyzovaná pomocou MALDI-TOF MS po štiepenie in-gél s trypsínom. Stručne povedané, CBB zafarbené proteínové pásy boli vyrezané a odfarbí s 25 mM hydrogénuhličitan amónny obsahujúci 50% acetonitrilu. Redukčná alkylácia sa vykonáva s 50 mM TCEP (tris [2-karboxyethyl] fosfín) v 25 mM hydrogénuhličitanu amónneho s následnou inkubáciou s 50 mM iodoacetoamide po dobu 1 hodiny. Po dehydratácii s acetonitrilom, bol proteín v gélu sa rozštiepi pôsobením 10 ul TPCK-trypsínu (100 ug /ml) v 50 mM hydrogénuhličitanu amónneho. Štiepenie sa čistí Zip špičkou (Millipore, Japonsko) a nanesie na MALDI cieľ. Jeden ul roztoku matrice (α-zelenomodrá-4-hydroxycinnapic matrix kyselina [Bruker, Japonsko] v zmesi acetónu a etanolu [01:02]) sa potom pridá na miesto. MALDI-TOF MS analýza bola vykonaná pomocou hmotnostného spektrometra AutoFlex (Bruker, Japonsko), po kalibrácii s peptidovým štandardného kitu Hmotnosť (Bruker, Japonsko). Hmotnostné údaje prst tlač peptid bol hľadaný softvéru Maskot (Matrix Science, Japonsko).

Bunková lokalizácia PFL a integrínu α2

MKN28 bunky boli kultivované na krycie sklíčko v 6-jamkové doštičky , Bunky rastúce na krycích sklíčkach boli ošetrené 30 ug /ml Alexa488 konjugovanej-PFL v RPMI 1640 a inkubované po dobu rôznych časových obdobiach. Po premytí PBS boli bunky fixované 80% acetónom po dobu 5 minút. Po premytí PBS boli bunky inkubovali s myšou monoklonálnou anti-integrín a2 /CD49b protilátky (R &D Systems, MN) pri teplote 37 ° C po dobu 1 hodiny. Po premytí PBS boli bunky inkubované s Alexa568-konjugovanou kozí anti-myší IgG protilátkou (Life Technologies, Japonsko) pri 37 ° C po dobu 1 hodiny. Po ďalšom premytí PBS boli bunky namontované s použitím Vectashield s DAPI (Vector Laboratories) a boli pozorované v konfokálního laserového skenovacieho mikroskopu (IX70, Olympus, Japonsko). Použitím druhého žalúdočné rakovina bunkové línie GCIY a normálne ľudské bunky hepatocytov ACBRI 3716, bunkovej lokalizácie integrínu a2 a Alexa488-PFL bola skúmaná rovnakým spôsobom, ako je popísané vyššie, a pozorovali pod fluorescenčným mikroskopom (Olympus BX51). Účinok kvasiniek mannan na bunkovej lokalizácii PFL a integrín a2 bola hodnotená nasledovne. Konfluentní bunky MKN28 pestované na krycie sklíčko v 6-jamkové doštičky boli ošetrené 20 ug /ml Alexa488-PFL v RPMI 1640 v prítomnosti alebo neprítomnosti 700 ug /ml kvasinkovej mannan po dobu 4 hodín. Bunky boli fixované, vizualizované za použitia anti-integrín a2 /CD49b protilátky, ako je popísané vyššie, a pozorovali pod fluorescenčným mikroskopom (Olympus BX51). Vplyv rôznych lektínov na bunkovej lokalizácii integrín a2 bola skúmaná podobným spôsobom, inkubáciou MKN28 buniek s 20 ug /ml každého lektínu v RPMI 1640 po dobu 4 hodín.

Výsledky

molekulárne klonovanie, expresia a čistenie PFL

už skôr sme našli genóm P. fluorescens
Pf0-1 obsahuje možné homolog protilátky proti HIV lektínovú rodiny, ktorá sa v poslednej dobe nachádzajú v nižších organizmov, vrátane baktérií, siníc a morských rias [4]. na sekvenciu nukleotidov hypotetické lektínu zo P založený. fluorescens
Pf0-1 na databázu, sady primérov boli navrhnuté tak, aby amplifikáciu génu lektínu. Domnelý lektín gén bol úspešne klonovaný klonovaním systémom smerové TOPO, a kódujúci proteín bol exprimovaný v heterológnych E. coli
BL21 (DE3). Lektín exprimovaný proteín bol čistený do homogenity jediným krokom gélovou filtráciou na Superose 12 kolóne (obr. 1A). Aktívne vrchol s hemaglutinačnej aktivita sa získa jediný proteínový pás o 13 kDa na SDS-PAGE (Obr. 1B). A konečne od 1. vrhu E. Získa sa Coli
kultúra, vysoký výnos čisteného lektínu (240 mg). Vyčistený lektín bol menovaný PFL a použije na ďalšie skúmanie. Molekulová hmotnosť PFL (13883,7) určuje MALDI-TOF MS bolo v súlade s vypočítanou hmotou (13881.1) zo sekvencie aminokyselín, a že odhadované hodnoty od mobility na SDS-PAGE.

Odvodené aminokyselinová sekvencia PFL kryl dve homológnej domény, z ktorých každá sa skladá z N- a C-terminálny polovice s 62% sekvenčnou identity medzi nimi. PFL vykazovali vysokú sekvenčná homológie s siníc lektínov OAA zo Oscillatoria agardhii
, červená rias lektín ESA-2 od Eucheuma Serra stroje a bakteriálne lektín MBHA zo Myxococcus Xanthus
(obr . 2B), ktoré predstavujú nový anti-HIV lektín rodinu. Molekulová hmotnosť PFL a OAA boli podobné, 13883,7 a 13924,1, v tomto poradí, a obaja lektíny boli zložené zo 132 aminokyselín. Obaja PFL a letecký priestor majú spoločnú vlastnosť vo svojom sekvenčné opakovanie, ale letecký priestor zobrazuje vyšší stupeň vnútornej identitu sekvencie s 75% medzi dvoma opakovanými domén. Na rozdiel od ESA-2 a MBHA sú zložené zo štyroch tandemový opakovaných homológnych domén 67 aminokyselín. Stupne podobnosti OAA, ESA-2 a MBHA sa PFL v ich N-koncovej časti (každá 132 zvyškov) z aminokyselinové sekvencie boli 62,1, 61,4 a 62,1% pre rovnaké aminokyseliny, resp.

sacharidy viažuci špecifickosť PFL

Ak chcete zistiť sacharidy viažuci špecifickosť PFL, glykan pole analýza bola vykonaná u Consortium pre funkčnú Glycomics s využitím tlačený poľa verzie 5.0. Zo 611 testovaných druhov oligosacharidov, PFL (10 ug /ml) ukázala, výhradný špecificitu pre vysoké glykánov manózu typu, ako je znázornené na Obr. 3. Celý zoznam oligosacharidy testovaná a výsledky možno nájsť na internetovej adrese (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp).

PFL silne viaže na M6 glykan (216 ) a glykan M8 (212), z ktorých oba majú odkrytú α1-3 muž na D2 ramenom, s podobnou úrovňou vysokých RFU hodnôt, 43471 a 40759, resp. Na rozdiel od maskovania tejto α1-3 Muž s α1-2 Muž výrazne narušená interakciu medzi PFL a glykánov. Toto bolo najviac zrejmé z porovnania M6 glykánov (216) a M7 glykánov (211), kde prídavné α1-2 Man na D2 ramená zníženej väzbové účinnosť približne 53%. Podobne väzba potencie PFL k M9 glykánov (213) bola znížená (RFU = 8535) v porovnaní so svojim náprotivkom M8 glykánov (212) chýba D2 terminálu α1-2 muž, zobrazujúci iba 21% účinnosti. Je zaujímavé, že odstránenie redukčného terminálu disacharid, GlcNAc-GlcNAc vysokých manózy glykánov moc drasticky zmenšil PFL-záväzné. Napríklad väzbové potencie PFL bol takmer kompletne zrušené na glykánov 316 a 317, ktoré nemajú žiadnu sekvenciu GlcNAc-GlcNAc, zatiaľ čo tie, ktoré náprotivok glykány 212 a 213, v uvedenom poradí, vykazovali oveľa vyššiu účinnosť. Význam koncového GlcNAc-GlcNAc bola ďalej potvrdená porovnaním glykánov 217 a 315, aj keď rozsah zníženia hodnoty PFL-väzby bol obmedzený. Tento lektín postráda monosacharidu väzbu vrátane manózu. Okrem toho, PFL ani interakcie s človekom α1-6 Man (314) a mannotriose (214), ktoré sú zložkami rozvetvené časti vysokých mannosových glykánov. Pentasacharid Jadro N-glykánov (50) nebol rozpoznaný PFL, ale jeho náprotivok fukosylována (485), zobrazí sa slabou interakciu (RFU = 746). Tieto oligosacharid väzbové profily PFL boli veľmi podobné tým z OAA, ESA-2 a Kaa-2, ktoré patria do novej anti-HIV lektínovú rodiny v nižších živočíchov [4] - [6].

Anti- chrípkový vírus aktivita PFL

aktivita Anti-virus chrípky z PFL bola hodnotená dvoma kmeňov chrípkového vírusu a /Udorn /72 (H3N2) a a /Beijing /262/95 (H1N1) u príjmu NR farbivá test. PFL účinne potlačené cytopatický efekt spôsobený oba kmene chrípkového vírusu, s EK _{50s 19,4 ± 1,5 Nm a 4,5 ± 0,4 nM (obr. 4A). K potvrdeniu, že PFL inhibuje počiatočný krok vstupu vírusu chrípky do buniek, distribúcia vírusových antigénov v infikovaných bunkách bola pozorovaná v prítomnosti alebo neprítomnosti PFL fluorescenčnou mikroskopie. Obr. 4B ukazuje rozloženie vírusového antigénu po 24 h po infekcii s A /Udorn /72 detekovaný špecifickú anti-hemaglutinín protilátky. PFL účinne inhibuje vstup chrípkového vírusu do buniek, zatiaľ čo vírusy sú schopné preniknúť a replikáciu v hostiteľských bunkách v neprítomnosti PFL. Galaktózy špecifický lektín PNA zo Arachis hypogaea
nedokázal brániť vstupu vírusu do buniek. Tieto výsledky naznačujú prítomnosť vysokých manózy glykánov na povrchu vírusu v polohe kritickej pre vstup vírusu do buniek. Pre testovanie, či PFL sa priamo viazať na vírusový obal glykoproteínu HA, test ELISA bola vykonaná za použitia komerčne dostupného prípravku vakcíny, ktoré obsahujú HA z A /California /7/09 (H1N1), A /Victoria /210/09 (H3N2), a B /Brisbane /60/08 Záručná ako hlavnú zložku. Ako je ukázané na Obr. 4C, bola pozorovaná na dávke závislá na väzbe HA PFL.}

PFL indukovanej bunkovej smrti ľudské žalúdočné nádorové bunky MKN28

in vitro
protinádorového účinku na PFL karcinómu žalúdka buniek MKN28 bola vyhodnotená konvenčným testom MTS. Ako je znázornené na Obr. 5A (ľavý panel), PFL vykázala dávky závislý účinok na proliferáciu buniek MKN28. V 72 hodín po PFL spracovaní, životaschopnosť buniek bola významne znížili v denných dávkach 0,5 um alebo vyššou. Na rozdiel od toho pri nízkych dávkach 0,1-0,3 um, množenia buniek bola stimulovaná mierne. PFL-indukovaná smrť buniek MKN28 buniek bolo spojené so stratou bunkovej adhézie na dno kultivačnej doštičke, ako je znázornené na Obr. 5B kde zvrhnutá zhluk buniek boli pozorované ako hnedasté liniek. PFL-indukovaná bunková smrť bola účinne inhibovaná v prítomnosti kvasiniek mannan, glykoproteínu nesie vysoké mannózové oligosacharidy (obr. 5A, pravý panel). To znamená vysoké mannózové glykány na MKN28 buniek sa zapojí do PFL-indukovanej bunkovej signalizáciu, ktorá nakoniec vedie k smrti bunky. Na rozdiel od normálnych ľudských hepatocytov bunky (ACBRI 3716) boli relatívne rezistentné na liečbu PFL v porovnaní s MKN28 buniek (Obr. 5A, ľavý panel).

Izolácia PFL-väzbové molekuly (y) na ľudské nádorové bunky žalúdka MKN28

aby sa vyriešil problém molekulárnej mechanizmus, ktorým PFL vyvoláva bunkovú smrť bunky MKN28, bunková povrchová molekula (y), ku ktorému PFL viazaný boli skúmané. Biotinylizované PFL sa inkubuje po dobu 2 hodín s MKN28 bunky a bunky boli Lyžovanie RIPA pufra, ktorý obsahuje 0,1% SDS. Povrchová molekula (y), ku ktorému biotín-PFL spútaná sa spoločne vyzráža avidín potiahnuté guličkami. Proteíny zachytené na guličky boli následne vylúhovaný s SDS-PAGE vzorkovej pufra a analyzované na SDS-PAGE (Obr. 6A). Hoci boli zistené niektoré nešpecifické pásy, sme pozorovali 150 kDa, ktorý špecificky detekované v PFL liečených frakcie. Tento pás sa ďalej podrobí štiepenie in-gél trypsínu nasleduje MALDI-TOF hmotnostnej spektrometrie. Získané mapovaním peptidové hmoty dát (obr. 6B) boli hľadané databázu a proteín bol identifikovaný ako integrín α2, sa skóre na báze pravdepodobnosť, že 57 (p menšie ako 0,05).

Bunková lokalizácia exogénne pridanej PFL a integrín α2

správanie k PFL sám a integrín a2 pri liečbe liekom PFL boli skúmané pomocou konfokálního fluorescenčného mikroskopu. V tomto experimente, fluorescenčne značeného PFL (Alexa488-PFL) bol použitý na sledovanie PFL lokalizácie. Alexa488-PFL bola inkubovaná s bunkami po dobu 1 MKN28, 5 a 24 hodín pri dávkach 30 ug /ml. Integrín α2 boli detekované pomocou anti-integrín a2 /CD49b monoklonálne protilátky nasledované Alexa568-konjugovanou 2. protilátky. Je zaujímavé, že Alexa488-PFL viaže na bunkový povrch a začala internalizáciu do cytoplazmy priebehu 1 hodiny (obr. 7). Integrín α2, ktorý bol prevažne lokalizovaný na bunkovom povrchu pri rovnovážnom stave prešli aj internalizáciu, a čo je dôležitejšie, lokalizácia integrín a2 dobre zhodoval s PFL. Po 5 hodinách inkubácie, a to ako PFL a integrín α2 boli ko-lokalizované a akumuluje v perinukleární oblasti a ďalšie inkubácie v podstate nemení umiestnenie oboch proteínov. Je preto pravdepodobné, že akonáhle PFL viaže na integrín a2, obaja proteíny neboli nikdy recyklovaný späť na povrch buniek. Rapid intracelulárnu obchodovanie s PFL-integrín a2 komplexu došlo aj na kolagén I potiahnutých krycie sklíčka (dáta nie sú uvedené). Podobne, prerozdelenie integrín a2 po spracovaní s PFL bol pozorovaný v inom žalúdočné rakovina bunkové línie, GCIY, ale nie v normálnych ľudských hepatocytov buniek, ACBRI 3716 (obr. 8). V roku 3716 ACBRI bunky, internalizácia PFL nebolo pozorované prípadne na menšie expresiou integrínu a2 na bunkovom povrchu.

Zapojenie vysokých manosy glykánov na PFL-integrínu interakcie a2

Ak chcete otestovať, či bunkový prerozdelenie integrínu a2 spôsobené PFL môže vzniknúť z konkrétnej interakcie PFL s vysokými manózu glykánov na integrín a2 molekulu, sme vyhodnotili vplyv kvasiniek mannán na PFL-indukovanú integrín a2 internalizácie pomocou MKN28 buniek. Pri absencii kvasinkového mannan, obaja proteíny prešiel významnou internalizáciu (viď obr. 9a, horný panel). Na rozdiel od toho v prítomnosti kvasiniek mannan, PFL nepodarilo sa viaže na bunkový povrch, a následné intracelulárne obchodovanie PFL bol úplne zrušený (obr. 9A, vpravo dole). Súhlasu s týmto pozorovaním, integrín a2 nezmenil svoju lokalizáciu v prítomnosti kvasiniek mannan (obr. 9A, vľavo dole). Tieto výsledky jasne ukazujú, že PFL viaže na integrín a2 prostredníctvom uznania vysokej manózu glykánov na integrín a2. Pre ďalšie potvrdenie požiadavke vysokých manózu glykánov pre integrín a2 redistribúciu sme testovali vplyv rôznych lektínov na bunkovej lokalizácii integrín a2. Ako je znázornené na Obr. 9B, iné lektíny s rôznymi špecifikami, ako je galaktóza viažucich PNA zo Arachis hypogaea
, fukosa-väzbové AOL zo Aspergillus oryzae
, sialovej MAM viažuci kyselinu zo Maki amurensis
, D-GlcNAc-viažuci Uda z Urtica dioica
neovplyvnili polohu integrínu a2. Je zaujímavé, že väzba aj vysoká manózy lektíny, ako je napríklad monocot mannosa (Man) vážiaci lektínu GNA, ze Galanthus nivalis
neukázala žiadnu významnú zmenu na integrín a2. Na rozdiel od toho väzba s vysokým obsahom manózy strukoviny lektínu concanavalin (Coname) skreslený usporiadanie integrínov a2 ako PFL urobil.

Diskusia

V tejto štúdii sme vyhodnotili biologickú aktivitu nového bakteriálneho lektínom PFL zo P. fluorescens
Pf0-1, ktorý patrí k nedávnemu nájdených anti-HIV lektínov rodiny v nižších organizmov. Výskyt rastúce kmene vírusu chrípky rezistentné rovnako ako rozvíjajúcich sa vysoko patogénne kmene vírusov, ako je vtáčia H5N1 nás viedli k objavovaniu PFL ako nové anti-chrípky činidlo. PFL vykazovali silnú aktivitu vírusu proti chrípke a mechanizmus, ktorým PFL inhibuje replikáciu vírusu bola inhibícia počiatočného kroku vstupu vírusu do buniek. Je veľmi pravdepodobné, že PFL pôsobiace proti chrípke aktivitu selektívne väzby na vysokej manosy glykánov na obale vírusu HA, ako je ukázané v teste ELISA [9]. V skutočnosti, lokálne špecifická výskyt vysokého mannosa oligosacharidy ukázala v oblasti HA v blízkosti väzbového miesta receptora [10].

Ak chcete preskúmať protinádorový účinok PFL, činných sme rakovina žalúdka u bunkové línie, ktoré MKN28 je pochádzal z stredne diferencovaného nádoru čriev typu. Červená rias lektín ESA-2, ktoré patria do rovnakej rodiny lektínov s PFL vystavoval protinádorový účinok obaja in vitro stroje a in vivo
[7], [8]. ESA-2 je proteín odvodený z jedlých morských rias, a očakáva sa, že vyvíjať protinádorový účinok na rakovinu gastrointestinálneho traktu perorálnym podaním. Je pozoruhodné, že PFL podporovať bunkovú smrť bunky MKN28, výhradne prostredníctvom uznania vysokej manózu glykánov na integrínu a2 molekule, ktorá prevažne nachádza na povrchu buniek, v rovnovážnom stave. Heterodimerní integríny pôsobí nielen ako ukotvenie molekula pripojiť buniek do vhodného extracelulárnej matrix (ECM), ale tiež ako snímače ECM životného prostredia [11].

• Ploche ONE: Honokiol indukuje kalpain sprostredkovaná glukózou regulovaný proteín-94 Štiepenie a apoptózu u ľudských žalúdočné rakovinové bunky a Obmedzuje rast nádorových
• Druhy rakoviny žalúdka