roman anti-HIV lektin obitelj koja prikazuje strogu specifičnost vezanja za visoke manozu glikana je pronađen u nižih organizama. Je bakterijski orthologue je identificiran u genom Pseudomonas fluorescens pregled Pf0-1 i gena, urođeni lektin je klonirana, eksprimirana na Escherichia coli Izvor:. Sato Y, Morimoto K, Kubo T, Yanagihara K, Seyama T (2012) Visoka manoza-binding Antiviral lektin PFL iz Pseudomonas fluorescens pregled Pf0-1 Promiče smrti stanice želuca stanica raka MKN28 putem interakcije s a2-integrin. PLoS ONE 7 (9): e45922. doi: 10,1371 /journal.pone.0045922 pregled Urednik: Roger Chammas, sveučilišta u de São Paulo, Brazil pregled Primljeno: 7. svibnja 2012. godine; Prihvaćeno: 27. kolovoza 2012. godine; Objavljeno: 20. rujna 2012 pregled Copyright: © Sato et al. Ovo je otvorenog pristupa članak distribuirati pod uvjetima Creative Commons Imenovanje License, koja omogućuje neograničeno korištenje, distribuciju i reprodukciju u bilo kojem mediju, pod uvjetom da je izvorni autor i izvor su zaslužan financiranja. Ovo istraživanje je podržan u sklopu koje o potpori-u-Aid za mlade znanstvenike (b) od Japanskog društva za promicanje znanosti (JSPS) (Grant broj 24790101). U financijeri nisu imali ulogu u studiju dizajna, prikupljanja i analize podataka, Odluka o objavi, ili pripremu rukopisa pregled U konkurenciji interese.. Autori su izjavili da ne postoje suprotstavljeni interesi pregled Uvod pregled Visoke manoznim vežu lektini koji ciljaju specifične glikana na površini virusa su obećavajući potencijal virusnih-agensima za inaktivaciju koja bi se mogla koristiti za prevenciju i kontrolu virusnih infekcija [1], [2]. Brojne lektini koji specifično prepoznaju visoke manoze glikana iz raznih taksonomiju uključujući bakterije, algi, biljaka i životinja, a neke od kojih su do sada pokazali anti-HIV aktivnost. [3] Nedavno smo otkrili novi anti-HIV lektin obitelj distribuira u nižih organizama, uključujući bakterije, cijanobakterije i morskih algi [4]. Oni pokazuju zajedničke karakteristike, kao što su sekvence multiplikacije visoko očuvanih N-terminalne domene i ekskluzivne visokim manozu oligosaharida priznanja. Neki lektini u ovoj obitelji, kao što su cyanobacteria OAA iz Oscillatoria agardhii pregled [4] i crvena alga ESA-2 iz Eucheuma Serra pregled [5] su pokazali da inhibiraju ulazak HIV-a u stanice domaćina s EK 50-tih godina niskom nanomolarnom po izravno obvezuje omotnicu gp120. Nadalje, crvena alga lektin KAA-2 iz Kappaphycus alvarezii Osim snažnu antivirusnu aktivnost, ESA-2 pokazuje različite biološke aktivnosti kao što su mitogene aktivnosti za miš i ljudskih limfocita i in vitro pregled inhibicija rasta tumorskih stanica, [7], [8]. Iako se biološka svojstva ovog lektina obitelji postaje očita, svojstva bakterijskih ortolozima iz Pseudomonas fluorescens pregled Pf0-1 i Herpetosiphon aurantiacus pregled i dalje biti razjašnjeno. Pregled ova studija smo klonirani gen orthologue lektin iz str. fluorescens pregled Pf0-1 a kodirani lektin protein (PFL) je izražen u Escherichia coli materijali i postupci Materijali pregled Stab kultura P. fluorescens hemaglutinacije Test pregled hemaglutinacije analiza je izvršena pomoću 2% (v /v) suspenziju tripsin liječenih eritrocitima kunića kako je prethodno opisano [9]. Ukratko, zečja nativni eritrocita suspenzija je obrađena s 0.5% tripsinom u fiziološkoj otopini i smjesa je inkubirana na 37 ° C 60 min. Nakon ispiranja s otopinom soli, 2% tripsin tretiranih eritrocita Suspenzija je pripravljen u fiziološkoj otopini. Hemaglutinacijsko aktivnost izražena je kao titra, na recipročan najvišoj 2-strukom razrjeđenju pokazuje pozitivan hemaglutinacije, pregled Kloniranje gena i ekspresiju lecitin PFL pregled genomna DNA P. fluorescens Pročišćavanje lecitin PFL pregled Ubrane Bakterijske stanice su ponovno suspendirane u 20 mM fosfatnog pufera ( pH 7.0) koji je sadržavao 0,15 M NaCl (PBS) te su potrgane s ultrazvukom. Nakon centrifugiranja na 8000 rpm tijekom 20 minuta, alikvot supernatanta podvrgnuti Superose 12 stupac (GE Healthcare) ekvilibrirana sa PBS. Kolona je eluirana s PBS-om pri brzini protoka od 0,8 ml /min do ekvimolarnim način. Eluat se prati pomoću apsorpcije na 280 nm i ispitivane hemaglutinacije aktivnost, a aktivne frakcije se prikupi. Pregled Molekularna težina Određivanje PFL Molekularna težina PFL je određen MALDI-TOF MS analiza s Autoflex masenom spektrometru (Brucker, Japan) nakon kalibracije s peptida masa standardnim kit (Brucker, Japan) koristeći sinapinska kiselina kao matrica. slijed DNA analiza nukleotidnih sekvenci određene su metodom dideoksi lanca terminator pomoću BigDye Terminator verzija 3.1 Cycle Sequencing kit (Applied Biosystems). DNA sekvenciranje je provedeno pomoću ABI 310 genetski Analyzer (Applied Biosystems). Pregled glikana array analizu pregled PFL obilježen je s Alexa Fluor 488, prema uputama proizvođača (Invitrogen, Eugene, OR). Glikana specifičnost vezanja PFL je određena tiskanih glikana proizvedenog niza (verzija 5.0) prema standardnoj proceduri CoreH Konzorcija za funkcionalnu Glycomics (cfg) (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp~~HEAD=pobj ). Prosječna relativna fluorescencija u ponavljanja od po šest je izračunata prosjeku četiri vrijednosti nakon uklanjanja najviše i najniže vrijednosti kako bi se uklonili neki od lažnih hitova s vrlo visokim ili niskim bodova. Stupci pogreške predstavljaju standardnu pogrešku srednje vrijednosti (SEM) i% CV je koeficijent varijacije (SD /prosjek) izračunat kao%. Pregled Anti-Gripa Aktivnost PFL Netlogu In vitro pregled aktivnosti protiv influence of PFL određena je neutralni crveni (NR) apsorpcije boja testu. Različite koncentracije PFL pripremljeni su u DMEM koji sadrži 10 ug /ml tripsina u 96 jažica mikroploče. U svaku jažicu, virus je dodan kao višestrukom infekcijom od oko 0,001 infektivnih čestica po stanici. Nakon inkubacije na 37 ° C tijekom 48 sati, doda se 100 ul NR boje (150 ug /ml u DMEM), te dalje inkubirane 2 sata. NR boja ugrađenog u stanice ekstrahira dodatkom 100 ul 1% octena kiselina /50% etanola. Posudice se mjeri na 540 nm s čitačem mikroploča (1420 Multilabel brojač, Perkin Elmer, MA, USA) kao faktor preživljavanja od virusa citopatogenog učinka. Pregled imunofluorescencija mikroskopija pregled Imunofluorescencija bojanje obavlja vizualizirati ulazak inhibiciju virusa gripe po PFL. Ukratko, MDCK stanice se uzgajaju na pokrovnim staklom su inficirani sa A /Udorn /72 uz višestrukost infekcije od oko 0,001 infektivnih čestica po stanici, u prisutnosti ili odsutnosti 200 nM PFL u DMEM koji sadrži 10 ug /ml tripsina. Nakon 24 h nakon infekcije, inficirane su stanice fiksirane s 80% acetonom 5 minuta. Nakon ispiranja s PBS, stanice su inkubirane s mišjim monoklonskim anti-HA antitijela (HyTest, Turku, Finska) pri 37 ° C tijekom 1 sata. Nakon ispiranja s PBS, stanice su inkubirane s fluorscein izotiocijanat (FITC), koje je konjugirano anti-mišjim IgG (Anticorps Secondaires, compiegne, Francuska) na 37 ° C tijekom 1 sata. Nakon daljnjeg PBS pranja, stanice su montirani pomoću Vectashield s 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) (Vector Laboratories, Burlingame, CA), te su promatrane pod fluorescentnim mikroskopom (Olympus BX51, Olympus, Japan). pregled ELISA test pregled Izravna interakcija PFL sa virusne ovojnice glikoproteina HA je analiziran pomoću immnosorbent testa vezanog enzima (ELISA). PFL (5 ug /ml) u karbonatnog pufera (pH 9,6) obložena je s 96 jažica ELISA pločama (BD Biosciences, Bedford, MA). Jažice su isprane tri puta s PBS koji sadrži 0.1% Tween20 (PBST) i blokirani sa 3% obranim mlijekom na 37 ° C tijekom 1 sata. Nakon ispiranja s PBST, različitim koncentracijama pripravka je influenca HA cjepivo (Astellas, Tokyo, Japan) se doda u svaku jažicu i inkubirane na 37 ° C tijekom 1 sata. Nakon ispiranja s PBST, jažice su inkubirane sa mišjim anti-HA monoklonsko antitijelo (HyTest) na 37 ° C 1 h, nakon čega slijedi inkubacija sa peroksidaze hrena (HRP), koje je konjugirano anti-mišjim IgG antitijela (GE Healthcare, UK ) na 37 ° C tijekom 1 h. Zatim 3,3 ', doda se 5,5'-tetrametilbenzidin (TMB) supstrata (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MI). Reakcija je bila zaustavljena pomoću TMB Stop reagensa (Sigma-Aldrich), a apsorpcija pri 450 nm je mjerena pomoću čitača mikroposuda (1420 Multilabel Counter, Perkin Elmer). Pregled Tumor stanična proliferacija MTS testnom proliferacija stanica se kvantificira pomoću konvencionalnih MTS ispitivanjem Celltiter 96 proliferacije stanica (Promega, Madison, WI). Sjemenskih stanica na ploče s 96 jažica mikroploče se inkubiraju 72 sata s različitim koncentracijama PFL u odgovarajućem mediju s 10% FBS. Stanice su zatim inkubirane sa 20 ul MTS reagensa za 1 sat na 37 ° C, a mjerena s čitačem za mikroploče (1420 Multilabel Counter, PerkinElmer) na 490 nm. Učinak kvasca manan o citotoksičnosti od PFL određuje se inkubacijom stanica s 5 uM PFL u prisutnosti različitih koncentracija kvasca manan u RPMI 1640 s 10% FBS na 72 sata, a stanična vijabilnost je mjerena kao što je opisano gore. Izolacija PFL vezanja molekula (e) na MKN28 stanica Netlogu PFL je obilježen sa biotin pomoću kompleta biotinom označavanje (Dojindo molekularne tehnologije, Japan) u skladu s uputama proizvođača. Konfluentnim MKN28 stanice na poklopcima, biotiniliranog PFL (200 ug) i stavi na inkubaciju 2 sata na sobnoj temperaturi. Nakon ispiranja s hladnim PBS, stanice su ostrugane i lizira u 800 ul RIPA puferom (50 mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 1% Nonidet p40, 0,5% natrij deoksikolat, koktel inhibitora proteaze, 0,1% SDS ). Nakon toga, 100 ul biotin-hvatanje avidinom kuglica (Adar Biotech, Israel), doda se staničnog lizata i inkubiraju preko noći na 4 ° C uz lagano miješanje. Slojevi su zatim isprani tri puta s 50 mM Tris-HCl, pH 7,5. Snimljene proteini na kuglice se isperu s 50 ul pufera SDS-PAGE uzorka (62,5 mM Tris, pH 6,8, 2% SDS, 10% glicerol, 1% merkaptoetanola, 0.003% bromfenol plavo) tijekom 15 min na 90 ° C, te podvrgne SDS-PAGE. Proteinski sastav koji su specifični za liječenje PFL frakciji analizirana pomoću MALDI-TOF MS nakon in-gel probavom s tripsinom. Ukratko, CBB Obojene trake proteina se izrezati i obezbojena sa 25 mM amonijev bikarbonat sadrži 50% acetonitrila. Reduktivna alkilacija je izvršena s 50 mM TCEP (tris [2-karboksietil] fosfin) u 25 mM amonijevog bikarbonata, nakon čega slijedi inkubacija sa 50 mM iodoacetoamide 1 h. Nakon dehidracije acetonitrilom, protein u gelu je razgrađen s 10 ul TPCK-tripsina (100 ug /ml) u 50 mM amonijevog bikarbonata. Probava se pročišćava Poštanski vrha (Millipore, Japan) i nanese na MALDI metu. Jedan ul otopine matrice (α-cijano-4-hydroxycinnapic matrice kiseline [Bruker, Japan] u acetona-etanola [1:02]) je zatim dodan u licu. MALDI-TOF MS analiza je provedena pomoću Autoflex masenim spektrometrom (Bruker, Japan) nakon kalibracije sa peptidnim masenog Standard Kit (Bruker, Japan). masa podaci prst tisak Peptid se pretraživati po maskota softvera (Matrix Science, Japan). pregled stanična lokalizacija PFL i integrina α2 pregled MKN28 Stanice su uzgajane na pokrovnim u 6 jamica , Stanice koje rastu na pokrovnim pomiješa se s 30 ug /ml Alexa488 konjugirani-PFL u RPMI 1640 i inkubira različitim vremenskim periodima. Nakon ispiranja s PBS, stanice su fiksirane s 80% acetonom 5 minuta. Nakon ispiranja s PBS, stanice se inkubira s mišjim monoklonskim anti-integrin a2 /CD49b antitijelo (R &D Systems, MN), pri 37 ° C tijekom 1 sata. Nakon ispiranja s PBS, stanice su inkubirane s Alexa568-konjugiranim anti-mišjim IgG (Life Technologies, Japan) na 37 ° C tijekom 1 sata. Nakon daljnjeg ispiranja PBS, stanice su montirani pomoću Vectashield sa DAPI (Vector Laboratories) i promatraju pod laser scanning mikroskopa (IX70, Olympus, Japan). Primjenom drugog želučani rak staničnu liniju GCIY i normalne stanice humanog hepatocitnog ACBRI 3716, stanični položaji integrina a2 i Alexa488-PFL su ispitani na isti način kao što je gore opisano, a promatrana pod fluorescentnim mikroskopom (Olympus BX51). Učinak kvasca manan na staničnoj lokalizaciju PFL i integrina, a2 je procijenjena kako slijedi. Konfluentne MKN28 stanice uzgojene na pokrovnim u 6 jažica su tretirani s 20 ug /ml Alexa488-PFL u RPMI 1640, u prisutnosti ili odsutnosti 700 ug /ml kvasca manan 4 h. Stanice su fiksirane, vizualizirani koristeći anti-integrin a2 /CD49b protutijelo kao što je gore opisano, i promatraju pod fluorescentnim mikroskopom (Olympus BX51). Učinak različitih lektina na staničnu lokalizaciju integrina a2 ispitana je na sličan način, inkubacijom MKN28 stanica s 20 ug /ml svakog lecitin u RPMI 1640 4 sata. Pregled Rezultati Molekularno kloniranje, ekspresija i čišćenje PFL Netlogu Mi smo ranije otkrili genom str. fluorescens pregled Pf0-1 sadrži mogući homologije anti-HIV lektina obitelji koja je nedavno pronađena u nižih organizama, uključujući bakterije, cijanobakterije i morskih algi [4]. Na osnovu nukleotidnog slijeda hipotetske lecitin iz P. fluorescens pregled Pf0-1 na bazi primera setovi su označeni za amplifikaciju gen lektin. Potencijalni lektin gena uspješno je kloniran od smjera TOPO kloniranje sustav i kodiranje proteina heterologno je izražen u E. coli zaključiti aminokiselinski slijed PFL gajio dvije homologne domene, koji se sastoje od N- i C-terminalne polovine s 62% identičnosti sekvencije između njih. PFL pokazao je visoku homologiju sekvence cyanobacteria lektina OAA iz Oscillatoria agardhii pregled, crvena alga lektin ESA-2 iz Eucheuma Serra pregled i bakterijske lektin MBHA iz Myxococcus xanthus pregled (Sl , 2B), koji predstavljaju novi anti-HIV lecitinske porodice. Molekulska masa PFL i OAA su slične, 13.883,7 i 13924,1, odnosno, i oba lektini su sastavljena od 132 aminokiselina. I PFL i OAA imaju zajedničko svojstvo da u svojoj sekvenci umnožavanje, ali OAA prikazuju viši stupanj unutarnje identičnosti sekvence sa 75% između dva ponovljenih domene. Za razliku od toga, ESA-2 i MBHA se sastoji od četiri tandemski ponovljenih homologne domena 67 aminokiselina. Stupnjevi sličnosti OAA, ESA-2 i MBHA sa PFL na svojim N-terminalnim dijelovima (svaka 132 ostaci) od aminokiselinskih sekvenci su 62,1, 61,4 i 62,1% za identične ili aminokiselina. Pregled Ugljikohidrati-specifičnost vezanja PFL Netlogu Da bi se odredilo ugljikohidrate specifičnost vezanja PFL, analize glikana polje je izveden u konzorcij za funkcionalnu Glycomics koriste tiskani array verzija 5.0. Od 611 vrsta oligosaharida testiranih, PFL (10 ug /ml) pokazala ekskluzivno specifičnost za visoke glikana manoze tipa kao što je prikazano na slici. 3. Cijeli popis oligosaharida ispitan, a rezultati se mogu naći online na (http://www.functionalglycomics.org/glycomics/publicdata/primaryscreen.jsp). Pregled PFL snažno veže na M6 glikana (216 ) i M8 glikana (212), od kojih oba imaju izložen α1-3 čovjeka na D2 ruku, sa sličnim razinama visokih RFU vrijednosti, 43471 i 40759, respektivno. Za razliku od toga, prikrivanje ove α1-3 Čovjeka s α1-2 Man dramatično umanjena interakciju između PFL i glikana. To je najočitije usporedbom M6 glikana (216) i M7 glikana (211), pri čemu je dodatno α1-2 Čovjek na D2 ruku smanjena obvezujuću moć približno 53%. Slično tome, vezanje potenciju PFL postupku M9 glikana (213) je smanjena (RFU = 8.535) u usporedbi sa svojim kolegom M8 glikana (212) nedostaje D2 terminala α1-2 Čovjek je vidljivo samo 21% jačini. Zanimljivo, uklanjanje redukcijskog terminalnog disaharida, GlcNAc-GlcNAc visoke manoze glikana mnogo drastično smanjena PFL se veže. Na primjer, PFL vezanje potentnost je gotovo potpuno ukida u glikana 316 i 317 koji nemaju GlcNAc-GlcNAc sekvencu dok oni kolega glikana 212 i 213, redom, pokazuju puno veću potenciju. Važnost terminala GlcNAc-GlcNAc dodatno je potvrđena usporedbom glikana 217 i 315, iako je stupanj umanjenja PFL vežu bilo ograničeno. To lektin bio lišen monosaharid vezanje uključujući manoza. Štoviše, PFL nije u interakciji s čovjekom α1-6 Man (314) i mannotriose (214), koji su sastavni dijelovi razgranatih dijela visokih manozu glikana. Pentasaharidni jezgra N-glikana (50) nije priznata PFL ali njegova fukozilirani kolega (485) prikazuje slabe interakcije (RFU = 746). Ove oligosaharidnih profil vezanja PFL su vrlo slične onima u OAA, ESA-2 i KAA-2 koji pripadaju novoj anti-HIV lektina obitelji nižih organizama [4] - [6]. Pregled Anti virusa gripe aktivnost PFL pregled Anti-virus gripe aktivnost PFL je procijenjena s dva soja virusa influence, a /Udorn /72 (H3N2) i a /Peking /262/95 (H1N1) od strane NR unosa boje test. PFL učinkovito inhibirati citopatogeni učinak uzrokovan obje sojeva virusa influence s EK 50-tih godina 19,4 ± 1,5 nM odnosno 4,5 ± 0,4 nm (Sl. 4a). Za potvrdu da PFL inhibira početni korak ulaska virusa gripe u stanice, distribucija virusni antigeni u zaraženim stanicama uočena je u prisutnosti ili odsutnosti PFL metodom imunofluorescencije mikroskopije. Sl. 4B prikazuje distribuciju virusnog antigena nakon 24 sati nakon infekcije A /Udorn /72 detektiran pomoću specifičnog anti-hemaglutinina antitijela. PFL učinkovito inhibirani unos virusa influence u stanice, dok su virusi bili u stanju prodrijeti i ponoviti u stanicama domaćina u nedostatku PFL. Galaktoza specifična lektin PNA iz Arachis hypogaea pregled nije uspio spriječiti ulazak virusa u stanice. Ovi rezultati upućuju na prisutnost visokih manoze glikana na površini virusa na položaju kritične za ulazak virusa u stanice. Za testiranje da li bi PFL izravno vežu na virusni glikoprotein omotača HA, ELISA test izveden je s komercijalno dostupnim dobivanje cjepiva koji sadrže HA iz A /California /7/09 (H1N1), A /Victoria /210/09 (H3N2), i B /Brisbane /60/08 kao glavni sastojak. Kao što je prikazano na slici. 4C opažena dozi ovisnog vezanja HA za PFL. Pregled PFL induciranu smrt stanice ljudske stanice raka želuca MKN28 pregled In vitro Izolacija PFL-vezanja molekula (e) na ljudske stanice raka želuca MKN28 pregled da bi se riješila molekularni mehanizam kojim PFL inducira staničnu smrt MKN28 stanice, stanične površine molekula (e) na koje se PFL vezan ispitan. Biotinilirani PFL je inkubirana 2 sata s MKN28 stanice i stanice su lizirane s RIPA puferom koji sadrži 0,1% SDS. Površina stanice molekula (e) u kojoj biotin-PFL spojenih koji su zajedno istaloži avidinom obloženih kuglica. Proteini talože na zrncima su zatim ispere se s SDS-PAGE puferom za uzorke i analizirane SDS-PAGE (Sl. 6A). Iako su otkrivene nekoliko ne-specifične bendova, gledali smo 150 kDa bend koji je posebno otkriven u PFL tretira dio. Ova vrpca se dalje podvrgne u gelu digestijom tripsinom i zatim MALDI-TOF masena spektrometrija. Dobivene peptida masa Identifikacija podataka (Sl. 6B) su tražili bazu podataka, a protein je identificiran kao integrina α2, s vjerojatnošću na temelju ocjenama od 57 (p < 0,05). Pregled stanična lokalizacija egzogeno dodati PFL i integrinskog α2 pregled ponašanje samog PFL i integrina a2 nakon tretmana s PFL su ispitani pomoću konfokalnog fluorescentnog mikroskopa. U ovom eksperimentu, fluorescentno obilježeni PFL (Alexa488-PFL) je korištena za praćenje PFL lokalizacije. Alexa488-PFL je inkubiran sa stanicama MKN28 1, 5 i 24 sata, u dozama od 30 ug /ml. Integrina α2 su detektirane s anti-integrin a2 /CD49b monoklonsko protutijelo nakon čega Alexa568 konjugiranim 2 antitijela. Zanimljivo, Alexa488-PFL vezan za površinu stanice i pokrenuo internalizacije u citoplazmi u roku od 1 sat (Sl. 7). Integrin α2 koji je uglavnom lokaliziran na površini stanice u stabilnom stanju i prošao internalizacije, a što je najvažnije, lokalizacija integrina a2 dobro podudara s PFL. Nakon 5 sati inkubacije, i Pfl i integrina α2 su lokalizirani i akumuliraju u perinuclear regije i daljnja inkubacija u osnovi ne mijenja položaj obje bjelančevine. Stoga je vjerojatno da jednom PFL vezan na integrin a2, oba proteina nisu nikad bili ponovno se na staničnu površinu. Rapid unutarstanični trgovina PFL-integrin a2 kompleksu se dogodila čak i na kolagen sam omotom gaćice (podaci nisu prikazani). Slično, preraspodjela integrina a2 nakon tretmana s PFL je zabilježena u drugom želučanom raka stanične linije GCIY, ali ne i na normalnim ljudskim stanicama hepatocita, ACBRI 3716 (Sl. 8). U ACBRI 3716 stanica, internalizacija PFL nije uočeno vjerojatno do manjeg izražavanja integrina a2 na površini stanice. Pregled Uključenost visokih manozu glikana na PFL-integrin a2 interakcije pregled Kako bi testirali da li stanični preraspodjela integrina a2 uzrokovane PFL može nastati iz određenog interakcije PFL s visokim manozu glikana na integrin a2 molekulu, smo ocijenili učinak kvasca manan na PFL-inducirane integrinskog a2 internalizacije pomoću MKN28 stanice. U nedostatku kvasca manan oba proteina podvrgnut značajno internalizaciju (Sl. 9A, gornja ploča). Nasuprot tome, u prisustvu kvasca manan PFL nije da se vežu na površinu stanice, te naknadno unutarstanični trgovina PFL potpuno je ukinula (Sl. 9A, dolje desno). Prihvaćanjem ovog promatranja, integrin a2 ne mijenja svoj lokalizaciju u prisustvu kvasca manan (Sl. 9A, dolje lijevo). Ovi rezultati jasno ukazuju da PFL dužan integrina a2 kroz priznanje visoke manozu glikana na integrin a2. Kako bi se dodatno potvrditi zahtjev visokih manozu glikana za integrin a2 preraspodjele, mi smo testirali učinak raznih lektina na staničnu lokalizaciju integrina a2. Kao što je prikazano na slici. 9B, drugi lektina s različitim specifičnostima kao što su galaktoza-obvezujući PNA iz Arachis hypogaea pregled, fukoze vežu AOL iz Aspergillus oryzae pregled, MAM sialične kiseline vežu s Maackia amurensis Rasprava pregled U ovom istraživanju smo ocijenili biološku aktivnost romana bakterijske lecitin PFL iz P. fluorescens pregled Pf0-1 koji pripada novijoj naći anti-HIV lektina obitelji nižih organizama. Pojava povećanja lijekove rezistentnih sojeva virusa gripe, kao i nastajanju visoko patogenim sojevima virusa, kao što su ptičje H5N1 nas je vodio istraživanje PFL kao sredstvo protiv gripe roman. PFL pokazali su jaku aktivnost protiv virusa influence i mehanizam kojim PFL inhibira replikaciju virusa je inhibicija početni korak ulaska virusa u stanice. To je vrlo vjerojatno da PFL vrši djelovanje protiv influence selektivnim vezanjem na visokim manoze glikana na virusne ovojnice HA, kao što je pokazano ELISA [9] testu. U stvari, mjesno specifična pojava visoke manoza oligosaharida je pokazala na području HA u blizini mjesta vezanja receptora [10]. Pregled Kako bi istražili antitumorski učinak PFL, zaposleni smo ljudska stanična linija karcinoma želuca MKN28 koji je nastao iz umjereno diferenciran crijevnih tumora tipa. Crvena alga lektin ESA-2, koji pripada istoj lektina obitelj s PFL izlagao antitumorski učinak i In vitro pregled i In vivo pregled [7], [8]. ESA-2 je protein dobiven iz jestivih alge i očekivalo da pokaže antitumorski učinak na rak probavnog sustava oralnom primjenom. Uočljivo je da PFL promovira smrti stanice MKN28 stanica, i to isključivo kroz priznavanje visoke manozu glikana na integrinskog a2 molekule, koje se pretežno nalazi na površini stanice u stabilnom stanju.
i pročisti jedan korak gel filtracijom. Glikana niz projekcija rekombinantnog lecitin, nazvao PFL, otkrio je da PFL prepozna visoku manoze glikana sa α1-3 čovjek koji je bio vrlo izložen na D2 položaju. Za razliku od toga, prikrivanje ove α1-3 Čovjeka s α1-2 Man dramatično umanjenje vrijednosti lektin ugljikohidrata interakcije. Smanjenje terminala disaharid, GlcNAc-GlcNAc visokih manozu glikana je također bitan za PFL-obvezujuće. PFL pokazali snažnu aktivnost virusa protiv gripe inhibirajući ulazak virusa u stanice pri dozama od niske koncentracije nM. Pri mikromolarnim koncentracijama ili više, PFL pokazao citotoksičnost popratno gubitak adhezije stanica protiv humanog karcinoma želuca MKN28 stanica. Površina stanice molekula koja PFL vezana je koprecipitirali označenim biotinom PFL i identificirani kao integrina α2 peptidnom masenog otiska pomoću MALDI-TOF masene spektrometrije. Zanimljivo, nakon tretmana s egzogeni PFL integrin α2 na staničnoj površini podvrgnuti brzu internalizaciju u citoplazmu i akumulirana na perinuclear regiji zajedno s vezanim PFL. Nastali gubitak stanice mogle prihvatiti izazvalo bi signalne puteve koji inducirani anoikis nalik staničnu smrt. Ovi događaji su učinkovito inhibirati predobrade PFL s mannnan, što ukazuje na umiješanost visokih manozu glikana na PFL-inducirane stanične smrti koja je potaknuta PFL-integrinskih a2 interakcije pregled
, koji također pripada ovoj obitelji inhibira infekciju različitih sojeva virusa influence s EK 50-tih godina niskim razinama nanomolarnim u soja neovisan način, kroz prepoznavanje visoke manoza oligosaharida na virusne ovojnice glikoproteina hemaglutinina (HA) [6]. pregled
. Funkcionalna PFL uspješno se pročisti u visokom iskorištenju i karakteriziran u pogledu biološke aktivnosti kao što su aktivnost antivirusno i anti-tumora. Kao što je predvidio od intenzivne strukturne sličnosti PFL s ostalim članovima ove lektina obitelji, PFL izlagao ekskluzivni specifičnost za visoku manoza oligosaharida i moćno antivirusno djelovanje protiv virusa gripe. Nadalje, PFL izazvana anoikis nalik smrti stanice raka želuca stanica MKN28 putem interakcije s površine stanice integrina a2. Pregled
Pf0-1 velikodušno dao je dr Mark W. Silby (University of Massachusetts Dartmouth, SAD). Virusi influence i Madin-Darby stanice psećeg bubrega (MDCK) su velikodušno daje dr T. Sakaguchi (Hiroshima University, Japan): Virusi influence su uzgojene u korioalantonske tekućini 10 dana starih kokošjih jaja. MDCK stanice se uzgoje u Dulbeccovom modificiranom Eagle mediju (DMEM) obogaćenom s 10% fetalnog goveđeg seruma i penicilin-streptomicin. Stanična linija karcinoma želuca, MKN28 ljubazno je ustupio prof Suzuki (Medicinski fakultet Sveučilišta Fukushima, Fukushima, Japan). Stanična linija je održavana u RPMI-1640 mediju (GIBCO, Grand Island, NY) s dodatkom 10% fetalnog goveđeg seruma (FBS, GIBCO), 100 IU /ml penicilina G natrij, i 100 mg /ml streptomicin sulfata. Još želuca stanična linija GCIY, je bila nabavljena od Riken banke stanica (Ibaraki, Japan) i održava se na isti način kao što je gore opisano. Primarna normalno ljudsko hepatocita stanica (ACBRI 3716) je kupljen od DS Pharma Biomedical (Osaka, Japan), a održava se u CS-C srednje kit R (DS Pharma Biomedical). Pregled
Pf0-1 korišten je kao kalup za kloniranje gena PFL gena. Prvo se oligonukleotidna prajmera, 5'-GGCAGGTCTCCCGAAACTTCAAG-3 'i 5'-AGTCGAACGCCTGAACCTGTTGA-3', koja hibridizira sa uzvodno i nizvodno od PFL kodirajuće regije, koji su korišteni su i PCR je izvedena pomoću Prime STAR DNA polimeraze (TAKARA). Pomoću amplificirani PCR fragment kao predloška, naknadno PCR je proveden s primerom 5'-CACCATGTCTAAATACGCAGTGGCA-3 ', koja je dodatno CACC slijed ATG početnog kodona gena PFL i obrnuti primer, 5'-TTACTCTATCTGCCCACGGAAG -3 '(TTA, odgovara stop kodona gena RFL). Amplificirani fragmenti ligirani su u pET101 /D-TOPO vektor ekspresije. Rekombinantni plazmid je transformiran u Escherichia coli
top10 stanica (Invitrogen). Dobiveni rekombinantni klonovi su potvrđeni ispravnim konstrukt je DNA sekvencom. Funkcionalne klonovi su pretvoreni u Escherichia coli BL21 pregled Star (DE3) stanice za inducirajuću ekspresiju gena PFL. IPTG s konačnom koncentracijom od 0.8 mM se doda u transformirane kulture induciraju ekspresiju Pfl. Nakon 6 sati inkubacije pri 37 ° C, stanice su sakupljene centrifugiranjem na 8000 okretaja u minuti tijekom 20 minuta. Pregled
BL21 (DE3). Eksprimirani lektin protein je pročišćen do homogenosti od jednog koraka gel filtracijom na koloni Superose 12 (sl. 1). Aktivni pik sa hemaglutinacije aktivnošću dala jednu proteinsku vrpcu od 13 kDa na SDS-PAGE (Sl. 1B). Konačno, od 1. legla E. dobiven je Coli pregled kultura, visoki prinos pročišćenog lecitin (240 mg). Pročišćeni lektin je nazvan PFL i koristi za daljnja ispitivanja. Molekulska masa PFL (13.883,7) određuje MALDI-TOF MS je bila u skladu s izračunatom masom (13881.1) iz predpostavljeni slijed aminokiselina i te procijenjene vrijednosti po mobilnosti na SDS-PAGE. Pregled
antitumorskog učinka na PFL rak želuca stanica MKN28 procijenjena konvencionalnim MTS testa. Kao što je prikazano na slici. 5A (lijevi panel), PFL pokazao učinak ovisan o dozi na proliferaciju MKN28 stanice. 72 sata nakon tretmana PFL, vijabilnost stanica značajno je smanjena u dozama od 0.5 uM ili više. Nasuprot tome, kod niske doze od 0,1-0,3 uM, proliferacija stanica je stimulirana malo. PFL inducirana stanična smrt MKN28 stanica prati gubitak adhezije stanice na dnu ploči kulture, kao što je prikazano na slici. 5B gdje su uočeni izvučenim nakupina stanica kao smeđe linije. PFL inducirana smrt stanica učinkovitije je inhibirana u prisutnosti kvasca manan glikoprotein nosi visoku manoze oligosaharida (Sl. 5A, desni panel). To ukazuje na visoke manoze glikana na MKN28 stanica uključiti u PFL-induciranu staničnu signalizaciju koji u konačnici dovodi do smrti stanice. Nasuprot tome, normalna ljudska hepatocita stanice (ACBRI 3716) bili su relativno otporni na PFL liječenja u usporedbi s MKN28 stanica (Sl. 5A, lijevi dio). Pregled
D-GlcNAc vežu Uda iz kopriva pregled nije utjecala na položaj integrina a2. Zanimljivo je da je čak i high manoznim vezanja lektina kao što monosupnice manoza (Man) -vezujući lecitin, GNA iz Galanthus nivalis pregled nije pokazao nikakvu značajnu promjenu na integrin a2. Nasuprot tome, visoka manoza obvezujući mahunarki lektin ConcanavalinA (ConA) iskrivljena aranžman od integrina a2 kao PFL učinio. Pregled
Lijek za mršavljenje Wegovy odobrio je FDA
Bakterijske promjene u crijevima utječu na rezultate liječenja lupusa u trudnoći
Studija sugerira vezu između upotrebe probiotika i "zamagljenosti mozga"
Mlada krv starijima vraća vitalnost
Znanstvenici dokazuju ulogu mikrobioma u pretilosti
Vrsta crijevnih bakterija može povećati rizik od raka crijeva
COVID-19:Kako bolest izgleda
Uz sve veće prikupljanje informacija o bolesti COVID-19 iz prve ruke, dobiva se točnija slika kliničkih obilježja. Kako se COVID-19 predstavlja Pa kako počinje? Državni odjeli za zdravstvo, i svje
Novo ispitivanje pokazuje poboljšano preživljavanje pacijenata s uznapredovalim kolorektalnim BRAF-mutantnim karcinomom
Rezultati novog kliničkog ispitivanja objavljeni danas u časopisu New England Journal of Medicine pokazati da uporaba kombinacije tri lijeka koja ciljaju na specifičnu mutaciju gena BRAF u pacijenat
Inhibitori GSK-3 obećavaju u liječenju infekcija koronavirusom
Istraživači u Sjedinjenim Državama predložili su novi pristup liječenju infekcije koronavirusom, poput teškog akutnog respiratornog sindroma koronavirusa 2 (SARS-CoV-2)-agensa koji uzrokuje koronaviru